마이크로 전극 배열에 네트워크 활동을 측정하기위한 유도 다 능성 줄기 세포의 빠른 신경 세포의 분화

요약

우리는 수정하고 흥분 대뇌 피질의 뉴런 ^(12)에 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)의 빠른 재현, 효율적인 분화를 설명하는 이전에 게시 된 프로토콜을 구현합니다. 특히, 우리의 수정은 네트워크 레벨에서의 전기 생리 학적 특성을 측정하기위한 마이크로 - 전극 어레이의 신경 세포 밀도 및 사용의 제어를 허용한다.

초록

인간 유도 만능 줄기 세포에서 파생 된 신경 세포 (hiPSCs)은 신경 질환 연구를위한 유망한 새로운 도구를 제공합니다. 지난 10 년, 뉴런에 hiPSCs 차별화를위한 많은 프로토콜이 개발되었다. 그러나, 이러한 프로토콜들은 높은 변동성, 낮은 재현성, 낮은 효율 느리다. 또한, 이러한 프로토콜 얻어진 신경 종종 미숙과 뉴런 수개월 동안 배양 않는 한 모두 단일 셀 및 네트워크 수준에서 적절한 기능적 활성이 부족하다. 부분적으로 이러한 제한에 hiPSC 파생 신경 네트워크의 기능적 특성은 아직도 잘 특징이다. 여기, 우리는 전사 인자 neurogenin-2 ^(12)의 강제 식으로 hiPSCs에서 인간의 신경 세포의 생성을 설명하는 최근 발표 된 프로토콜을 적용. 이 프로토콜은 빠른 transduc 거의 100 %의 변환 효율, 효율적인 (성인용으로 3 주 내에 뉴런 산출)된다혼성 세포 (> DAPI 양성 세포의 95 %가 양성 MAP2). 또한, 프로토콜은 신경 질환을 세포 형 특정 기부의 조사를 허용 흥분성 뉴런의 균질 한 집단을 산출한다. 우리는 우리의 뉴런의 수를 통해 명시 적으로 제어를 제공 안정적 형질 hiPSC 세포를 생성하여 원래의 프로토콜을 변형. 이러한 세포는 마이크로 전극 어레이에 hiPSC 유래 신경 네트워크를 생성하기 위해 사용된다. 이러한 방식으로, hiPSC 유래 신경 네트워크의 자발적 전기 생리 활성을 측정 할 수 있고, 셀 밀도면에서 interexperimental 일관성을 유지하면서, 방법. 제시된 프로토콜은 특히 인간의 신경 네트워크의 기계적 및 약리 연구에 광범위하게 적용 할 수있다.

서문

인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs) 분화 프로토콜의 개발은 신경 질환 연구를위한 강력한 새로운 도구를 제공하고 체외에서 인간의 신경 세포를 생성합니다. 최근까지이 질환의 연구는 심각하게 인간의 신경 세포를 사용하여 모델 시스템의 부족에 의해 방해되었다. 설치류가 신경 질환을 연구하는데 사용될 수 있지만, 이러한 연구의 결과는 인간 ^1로 쉽게 변환 될 수 없다. 이러한 한계를 감안할 때, hiPSC 유래 신경 세포는 분자 메커니즘을 기본 신경 질환을 규명하는 데 사용 및 체외 약물 스크리닝 할 수있는 유망한 대안 모델입니다.

지난 10 년, 여러 프로토콜은 신경 세포에 hiPSCs가 ^2-8 개발되었다 변환합니다. 그러나, 이러한 프로토콜들은 여전히 ​​많은 방식으로 제한된다. 첫째, 프로토콜은 종종 시간이 많이 소요됩니다 적절한 성숙에 생성 뉴런 (즉 synap자체 형성) 및 기능적 활동은 ⁹ 어려운 대규모 연구를 렌더링 배양 절차의 달을 필요로한다. 또한 hiPSC 투 뉴런 변환 효율이 낮다. 프로토콜은 종종 신경 세포의 이종 인구를 산출하고, 따라서 신경 세포의 특정 부분 집합의 연구를 허용하지 않습니다. 또한, 프로토콜은 서로 다른 IPSC 라인 ^{10, 11에} 대해 서로 다른 결과를 산출 재현 할 수 없습니다. 마지막으로, 성숙 단계 및 생성 된 뉴런의 기능적 특성 ^(10)은 다양하다.

이러한 문제, 장 등의 알을 해결합니다. (2013) ^(12)는 신속하고 재현 가능 neurogenin -2- 전사 인자를 과발현하여 hiPSCs 인간에서 뉴런을 생성하는 프로토콜을 개발했다. 신경 세포의 특성은 무관 한 (- (3 주 neurogenin-2의 발현을 유도 한 후 단 2) 프로토콜 재현 저자에 의해보고 된 바와 같이, 상대적으로 빠르게 분화 발생hiPSC 라인) tarting하고 hiPSC - 투 - 신경 세포 변환 (거의 100 %) 매우 효율적입니다. 자신의 프로토콜을 사용하여 생성 된 신경 세포의 인구는 신경 질환에 대한 세포 형 특정 기부금의 조사를 허용, 균질 (상위 계층 대뇌 피질의 뉴런을 닮은)된다. 또한, 자신의 hiPSC 파생 뉴런은 20 D 후 성숙 특성 (예를 들어, 능력이 시냅스와 강력한 기능 활동을 형성하기 위해) 전시.

네트워크 수준에서 hiPSC 유래 신경 세포의 전기 생리 특성을 특성화하는 hiPSC 기술 이전의 중요한 전제 조건은 인간의 질병 연구를 위해 이용 될 수있다. 이 때문에, 많은 연구 그룹은 최근 마이크로 전극 어레이 (MEA) 장치 (멀티 채널 시스템, 이틀 링겐, 독일) ^{13 ~ 16을} 이용하여 네트워크 레벨에서 줄기 세포 유래의 신경 세포를 조사하기 시작했다. MEA의 전극은 신경 세포를 배양 할 수있는 기판에 매립된다.다자간는 신경 네트워크 및 활성 시험 관내 전기 생리 학적 현상의 성질을 조사하는데 사용될 수있다. 현재 다자간는 성숙한 네트워크를 수득 수개월이 걸릴 분화 프로토콜과 함께 사용된다. 따라서, 신속한 분화 프로토콜 MEA를 조합하여 신경 질환의 대규모 연구에서이 기술의 사용을 용이하게한다.

여기서, 우리는 장 동부 등의 변형을 제시한다. (2013) ¹² 프로토콜과 다자간 환경에서 사용할 수 있도록 적응. 특히, 오히려 급성 렌티 바이러스 전달에 의존하는 것보다, 우리는 대신에 안정적으로 분화를 유도하기 전에 rtTA / Ngn2을 표현 hiPSC 라인을 만들었습니다. 우리는 신경 세포 밀도는 신경 네트워크의 형성에 중요하며, 신경과 MEA ^{(17, 18)의} 전극 사이에 양호한 접촉하기 때문에, 신경 세포 밀도 위에 재현성 제어를 주로 이것을했다. Althoug시간 장 등의 알. 프로토콜 hiPSCs 형질 전환에 대하여 매우 효율적이다는 처음 ¹² (장 등.에서도 2e 참조) 도금 hiPSCs 수가 뉴런의 최종 수율에 대하여 본질적으로 가변적이다. 안정적인 라인으로, 우리는 렌티 바이러스의 독성 및 감염의 효율성 변화를 일으키는 많은 문제를 제거 할 수 있습니다. 우리는 그 다음 네트워크 성숙을 획득, 안정적으로 다자간에 hiPSC 파생 신경 네트워크를 생성 매개 변수를 최적화 (예를 들어, 채널의 대부분을 포함하는 동기 이벤트) 셋째 주에 의해. 이 신속하고 신뢰성있는 프로토콜은 서로 다른 (즉, 환자 맞춤형) hiPSC 라인뿐만 아니라 약리 연구에 강력한 일관성을 제공에서 파생 된 신경 세포 사이의 직접 비교를 사용하도록 설정해야합니다.

프로토콜

동물의 모든 실험 동물 관리위원회, Radboud 대학 의료 센터, 네덜란드, (: 77,073 RU 12 월-2011-021, 프로토콜 번호)의 승인 된 동물 관리 및 사용 지침에 따라 수행 하였다.

1. 아교 세포의 분리 및 문화

참고 : 여기에 제시된 프로토콜 Vellis ¹⁹ 맥카시의 작품과 드 기반 및 마우스 성상 세포에 대한 매우 비슷한 상세한 프로토콜을 사용할 수 ^(20)이다. 배아 (E18) 쥐의 뇌에서 대뇌 피질 별아교 세포의 일차 배양 물을 생성하기 위해 임신 한 생쥐를 희생 할 필요가 태아가 자궁에서 수확 될 필요하고 뇌 배아로부터 분리 될 필요가있다. T75 플라스크를 채우려면,이 배아 뇌의 피질이 결합 될 필요가있다. 대안으로, 시판되는 정제 및 동결 성상을 구입할 수있다.

1. T75 문화 플라스크를 준비
   1. 희석 폴리 - D - 라이신 (PDL)에서10 μg / ML의 최종 농도로 멸균 초순수. T75 문화 플라스크에 희석 PDL 5 mL를 추가합니다. 전체 성장 표면을 적시에 주위에 부드럽게 섹시. 3 시간 동안 가습 37 ° C를 인큐베이터에서 플라스크를 놓습니다.
   2. 플라스크에서 PDL을 기음. 언 바운드 PDL을 제거하기 위해 5 mL의 멸균 물을 플라스크의 3 배를 씻어. 완전히 물을 대기음. 층류 후드 또는 즉시 사용에 건조 플라스크를 남겨주세요.
2. 피질의 해부
   1. 2 % (v / v)의 B-27 보충과 Lebovitz의 L-15 매체 50 ML의 해부 매체를 준비합니다. 얼음에 보관하십시오.
   2. (- 8 분 ~ 5) 호흡이 중단 될 때까지 유도 챔버에 깊이 이소 플루 란과 쥐 (작은 플렉시 유리 상자) 마취. 유도 챔버에서 쥐를 제거하고 즉시 자궁 전위에 의해 안락사.
   3. 70 % EtOH로 쥐의 복부 스프레이와 과잉을 닦아. 노출과 제왕 섹션에 ì 통해 댐에서 자궁을 제거위 ^(21)의 한 쌍의 사용에.
   4. 가위로 자신의 양수 주머니에서 개별 배아를 잘라 차가운 해부 매체로 가득 멸균 페트리 접시에 전송하고 얼음에 보관하십시오.
   5. 차가운 해부 매체로 채워진 새로운, 멸균 6cm 페트리 접시에 다시 배아를 전송합니다. 스테레오 현미경 배아에서 뇌의 압축을 풉니 다. 뇌를 노출, 부드럽게 집게를 사용하여 피부와 두개골을 벗겨. 부드럽게 뇌 전체를 특종 신선한, 차가운 해부 매체와 35mm 페트리 접시에 전송합니다.
      주 : 배아 해부 전체 뇌 세포가 생존을 유지하면서 장시간 얼음 해부 매체에 저장 될 수있다.
   6. 뾰족한 스프링 가위 또는 메스로 중간 선을 절단하여 각 뇌의 두 반구를 분리합니다. 조심스럽게 똑바로 뾰족한 집게로 수막을 제거.
      주 : 완전히 수막을 제거하는 것이 매우 중요합니다. 일성상 세포 문화의 방지 섬유 아세포 오염이다. 섬유 아세포는 빠르게 세포를 분할하고 결국 다른 세포를 대체합니다.
   7. 중뇌 / 선조체 봄 가위 나 메스와 후각 망울을 제거합니다. 또한 봄 가위 나 메스와 (피질에 대한 perimedian와 꼬리입니다 C 모양의 구조) 해마를 제거해야합니다. 5 ML의 해부 매체로 채워진 15 mL의 원심 분리기 튜브의 대뇌 피질 반구를 수집합니다. 얼음에 보관하십시오.
3. 피질의 분리
   1. 준비 2 mL의 ^칼슘 / 마그네슘 ²⁺ - 무료 0.25 % 트립신과 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) (해리 중). 50 mL의 높은 포도당 15 % (v / v)의 태아 소 혈청 (FBS) 및 1 %에 둘 베코의 수정 이글의 중간 (DMEM) (v / v)의 페니실린 / 스트렙토 마이신 (배지) 및 필터 소독을 준비합니다.
   2. 조직은 원심 분리 튜브의 바닥에 정착하자. 조심스럽게으로조직 위에서 가능한 한 해부 매체의 많은 해적. ^{2 +} / 마그네슘 ²⁺ - 무료 HBSS (트립신 제외) 5 ㎖ 칼슘과 조직을 씻고 조직은 튜브의 바닥에 정착 할 수 있습니다.
   3. 조심스럽게 HBSS를 대기음. 2 mL의 해리 매체를 추가하고 조직 주변의 효소를 섞어 부드럽게 튜브를 가볍게. 5 ~ 10 분 동안 37 ° C를 물을 욕조에 품어. 조직을 선동하기 위해 배양하는 동안 튜브를 몇 번 쓸어 넘기십시오.
   4. 즉시 1000 μL 피펫 팁을 사용하여 조직을 씹다. 약 800 μL에 피펫 볼륨을 설정합니다. 조각 대기음 직접 유체 라인 위에, 상기 튜브의 측면에 강제로 토출. 그러나 거품이나 거품을 최소화하려고합니다. 20 배 - 조직이 충분히 약 15 해리 될 때까지 반복합니다. 트립신을 비활성화 8 mL의 배지를 추가합니다. 부드럽게 튜브를 여러 번 반전 섞는다.
   5. 50 (M)의 상부에 배치 된 70 μm의 세포 여과기를 통하여 세포 현탁액 합격L 원심 분리기 튜브. 배양 배지 15 mL로 튜브를 세척하여 세포 현탁액과 50 ㎖ 튜브에서 매체를 수집하는 셀 스트레이너를 통해 매체를 필터링. 셀 스트레이너에게 배지와 몇 번 씻어. 25 ㎖ - 헹굼 후 최종 부피는 약 20이어야한다.
   6. 10 분 동안 200 XG에서 세포 펠렛. 조심스럽게 세포 펠렛을 건드리지 않고 최대한 매체 대기음. 1000 μL 피펫을 사용하여 1 ㎖의 배지에서 세포를 재현 탁. 11 mL로 데워진 문화 매체를 추가하고 10 ML의 피펫을 사용하여 (거품을 방지하기 위해) 가볍게 섞는다.
   7. 5 mL의 배지에 한 번 PDL 코팅 T75 플라스크를 씻어. 배지를 흡인하고 플라스크에 세포 현탁액을 전송. 모든 세포는 도금 된 현탁액에, 우리는 성상 세포가 현탁액에 다른 셀과 구별 될 수 없기 때문에, 일반적으로는 불필요을 계산 발견. 5 % CO ₂ F의 분위기와 가습 37 ° C를 인큐베이터에 플라스크를 배치이틀.
4. 확장 및 성상 세포의 유지 보수
   1. 초기 도금 후 처음으로 2 일의 전체 매체를 교체합니다. 전체 매체를 이후 매 3 D를 교체합니다. 항상 세포에 추가하기 전에 37 ° C에 새로운 배지를 prewarm.
      참고 : 성상 교세포 7 필요 - 약 90 %의 포화 상태를합니다 (성상 세포는 미세 아교 세포 및 희소 돌기 아교 세포가 상단에 거짓말과 혼합과 더불어, 조밀 모자이크 단일 층으로 표시)에 도달하는 10 D를.
   2. 아스트로 사이트가 약 90 % 컨 플루 언시에 도달 할 때, 오염 아교 세포를 제거하기 위해, 플라스크를 흔들어
      1. 인큐베이터에서 플라스크를 제거하고 캡 (페놀)를 조이거나 포트 커버 (필터링). 미세 아교 세포를 제거하려면, 1 시간 동안 180 rpm으로 궤도 플랫폼에서 플라스크를 흔들어. 매체를 기음. 5 ML의 미리 예열 문화 매체, 흡인 한 번 헹구고 12 mL의 배지로 교체합니다.
      2. 제거희소 돌기 아교 세포는, O / N 바람직 궤도 플랫폼에 플라스크를 반환하고 250 rpm으로 흔들, 37 ° C를 7 시간의 최소하지만.
      3. 매체를 기음. 5 ML의 미리 예열 문화 매체, 흡인 한 번 헹구고 12 mL의 배지로 교체합니다. 인큐베이터에 플라스크를 돌려줍니다.
      4. 0.05 % 트립신 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)로 2 : 1 내지 3 : 100 % 컨 플루 언트 1의 비율로 표준 절차를 이용하여 아스트로 사이트를 분할하는 경우. 100 % 포화 상태에서의 T75 플라스크 통상적 총 약 4.0 × ¹⁰⁶ 세포를 수득한다. 이 스케줄에 따라, 문화는 일반적으로 일주일에 한 번 분할 할 수 있습니다.
         주 : 성상 세포가 포화 상태에 도달 할 때, 수확 할 수 있고, 프로토콜 단계 3.4에서 후술 hiPSC 분화 사용. 성상 세포는 생존의 눈에 띄는 손실없이 한 번 이상 분할 할 수 있습니다. 이들은 배양 최대 2 개월 동안 유지 될 수있다. 경험에서, 차 배아 일 18 쥐의 성상 세포의 progressively 말기 차별화 될 및 / 또는 반복 분할 후 생존 능력을 잃게됩니다. 그것이 나중에 사용할 수 성상을 동결 할 수 있지만, 우리는 필요할 때 신선한 태아의 뇌에서 아스트로 사이트를 분리하는 것을 선호한다.

rtTA의 2 세대 / Ngn2 양성 hiPSCs

참고 : 재 프로그래밍이 cMYC, SOX2, OCT4 및 KLF4 요인으로 실험에 사용 된 hiPSCs 인간 섬유 아세포의 렌티 바이러스 전달에 의해 사내에서 생성되었다.

참고 : rtTA / Ngn2 양성 hiPSCs의 생성을 위해, 렌티 바이러스 벡터를 안정적으로 hiPSCs의 게놈에 유전자를 통합하는 데 사용됩니다. 렌티 바이러스의 제조를위한 프로토콜은 이전에 ^{22 일} 발표되었다. rtTA Ngn2 및 렌티 바이러스 입자를 제조하는 데 사용되는 포장 렌티 바이러스 벡터의 세부 사항이 제공된다 소재 / 장비의 표. rtTA의 렌티 바이러스에 사용되는 전송 벡터 pLVX-EF1α-입니다 (테트 - 온 - 고급) -IRES-G418 (R); 즉,이 벡터는 항생제 G418에 구성 적 EF1α 프로모터의 제어하에 고급 transactivator 테트 - 온 및 부여 저항을 인코딩합니다. Ngn2의 렌티 바이러스에 사용하는 전사 벡터이다 pLVX- (TRE-thight) - (마우스) Ngn2 - 퓨로 마이신 PGK - (R); 즉,이 벡터는 뮤린 neurogenin -2 테트 조절 프로모터의 조절 및 구조적 PGK 프로모터의 조절 하에서 퓨로 마이신 내성 유전자 하에서 유전자를 암호화한다. 따라서, 두 전송 경로를 이용함으로써, hiPSC 라인이 생성 될 수는있는 뮤린 neurogenin-2의 발현은 독시사이클린으로 매체를 보충에 의해 유도 될 수있다. hiPSCs의 전달을 위해, 렌티 바이러스 입자 상등액 사용 예 재치 (텍스트의 나머지에서 '렌티 바이러스 현탁액'이라 함)HOUT은 초 원심 분리를 이용하여 입자를 집중.

1. hiPSCs 플레이트 (1 일)
   참고 :이 프로토콜에서 언급 된 볼륨이 hiPSCs가 6 웰 플레이트에서 배양하는 것이 하나의 웰의 세포를 수확한다고 가정합니다. 또한, 세포를 12 웰 플레이트의 웰 (12)에 연속적으로 도금되어있는 것으로한다.
   1. 희석 BMM을 얻기 위해 1 % (v / v)의 지하실 막 매트릭스 (BMM)으로 10 mL의 차가운 DMEM / F12를 준비합니다. 12 웰 플레이트의 웰 당 BMM 희석 800 μL를 추가합니다. 5 % CO _2의 가습 된 분위기로 37 ° C의 배양기에서 적어도 1 시간 동안 인큐베이션. 사용하기 전에 실온에서 1 시간 동안 평판을 배양한다.
   2. 1 % (v / v)의 페니실린 / 스트렙토 마이신, 9 mL의 DMEM / F12 실온에 1 mL의 세포 분리 솔루션 (CDS) 따뜻한 15 mL의 필수 8 (E8) 매체. 의 Rho 관련 단백질 키나제 (ROCK) 억제제와 E8 매체를 보충합니다.
   3. hiPSCs의 소비 매체를 기음D를 hiPSCs 1 ML의 CDS를 추가합니다. 5 % CO _2의 분위기와 가습 37 ° C 배양기에서 5 분 - 3을 품어. 세포가 서로 분리되는지 여부를 현미경으로 확인한다.
   4. 부드럽게 1,000 μL 피펫으로 세포를 중단하고 15 mL의 튜브에 세포를 전송, 잘 2 mL의 DMEM / F12를 추가합니다. 세포 현탁액에 7 ML의 DMEM / F12를 추가합니다. 5 분 동안 200 XG에서 세포를 스핀.
   5. 뜨는을 대기음 및 제조 E8 매체의 2 mL를 넣어. hiPSCs이 15 ML 튜브의 측면에 대한 1,000 μL 피펫의 팁을 넣어 부드럽게 세포를 재현 탁하여 (세포 덩어리를 형성하지 않음) 해리되어있는 세포 현탁액을 얻습니다. 세포 해리 여부를 현미경으로 확인한다.
   6. 혈구 챔버를 사용하여 세포 (세포 / ㎖)의 수를 결정한다.
      참고 : 80에서 잘 6 잘 플레이트 - 총 4.0 × 10 ⁶ 세포 - 90 %의 포화 상태는 일반적으로 3.0를 얻을 것입니다.
   7. 대기음은 12 웰 플레이트에서 희석 BMM. 3.0 × ¹⁰⁴ 세포 / ㎖의 세포 현탁액을 수득 세포를 희석. 12 웰 플레이트의 웰 당 세포 현탁액 1 ㎖의 판. 5 % CO _2의 분위기와 가습 37 ° C 배양기에서 12 웰 플레이트 O / N를 놓습니다.
2. rtTA 및 Ngn2 렌티 바이러스와 유도 만능 줄기 세포를 형질 도입 (2 일)
   1. 실온으로 1 % (V / V) 페니실린 / 스트렙토 마이신과 12 mL의 따뜻한 E8 매체. E8 매체 8 μg / ML의 최종 농도로 ROCK 억제제 및 폴리 브렌과 E8 매체를 보완.
   2. 렌티 바이러스 서스펜션과 분취 량을 해동. 렌티 바이러스 현탁액에 8 μg / ML의 최종 농도로 폴리 브렌을 추가한다. 폐 매체를 기음과 각 웰에 제조 E8 매체의 1 mL를 넣어.
   3. 및 Ngn2 -lentivirus 현탁액 -는 다른 rtTA의 양으로 전달을 수행합니다. 예를 들어, transdu12 웰 플레이트 잘 하나에 rtTA의 -lentivirus 및 Ngn2의 -lentivirus 서스펜션 모두의 100 μL를 추가하여 hiPSCs를 CE. 다른 우물의 경우, 렌티 바이러스 서스펜션 대신에 100 μL 200 μL, 300 μL, 400 μL, 500 μL를 사용합니다. 12 웰 플레이트의 두 우물의 hiPSCs는 형질 도입되어서는 안된다; 그들은 선택시 컨트롤 역할을합니다.
      주 : 전달 효율 (프로토콜 단계 2.2.4 참조)의 선택의 시작 후 더욱 정확하게 추정 될 수 있도록 transductions 바람직 중복 수행된다. 효율적 hiPSCs 대부분의 형질 도입 할 필요가 렌티 바이러스 현탁액의 양의 렌티 바이러스 현탁액과 사용되는 hiPSC 라인의 역가에 의존한다. hiPSCs를 형질 도입하는 렌티 바이러스 서스펜션의 500 μL - 본 연구에서는, 우리는 일반적으로 100을 사용합니다.
   4. 5 % CO의 분위기와 가습 37 °의 C 배양기에서 12 웰 플레이트를 배치6 시간 동안 2. 6 시간 배양 기간이 종료하기 전에, 1 % (v / v)의 페니실린 / 스트렙토 마이신과 12 따뜻한 12 mL의 E8 매체 RT에 용액 둘 베코 인산염 완충 생리 식염수 (DPBS). ROCK 저해제와 E8 매체를 보충합니다.
   5. 폐 E8 매체 기음. 1 mL의 DPBS 잘 각을 씻으십시오. 각 웰에 준비 E8 매체의 1 ML을 추가합니다. 5 % CO _2의 분위기와 가습 37 ° C 배양기에서 12 웰 플레이트 O / N를 놓습니다.
3. E8 매체를 새로 고침 (3 일)
   1. RT에 1 % (v / v)의 페니실린 / 스트렙토 마이신 따뜻한 12 mL의 E8 매체. 12 웰 플레이트의 우물에서 보낸 매체를 대기음 잘 각각 제조 E8 매체의 1 mL를 넣어. 5 % CO _2의 분위기와 가습 37 ° C 배양기에서 12 웰 플레이트 O / N를 놓습니다.
4. 퓨로 마이신 및 G418 (- 팔일 4)와 선택을 수행
   참고 : 엉덩이의 세포 분열 속도에 따라배양을 분할해야 할 시점에서 선택 기간 동안 80 % 컨 플루 - SC 라인 및 렌티 바이러스 형질 도입 효율, 셀 (70)에 도달 할 수있다. 분할의 타이밍을 미리 예상 할 수 없기 때문에, 이는 프로토콜에서 언급되지 않는다. 그러나, 대신 퓨로 마이신 및 G418의 언급 농도 보충 E8 매체를 새로 고침으로, 하나는 (비트로 넥틴 코팅 된 플레이트에 세포를 도금 포함) 일반 hiPSC 문화로 hiPSC 문화를 분할 할 수 있습니다. 유일한 예외는 E8 매체 선택을 계속 한 항생제 농도로 보충되어야한다는 것이다.
   1. 실온으로 1 % (V / V) 페니실린 / 스트렙토 마이신과 12 mL의 따뜻한 E8 매체. 선택을위한 퓨로 마이신 및 G418 추가; 항생제의 상이한 양이 선택 기간 (표 1) 중에 첨가된다.
   2. G418- 및 퓨로 마이신의 비율을 추정하여 전달 효율 견적모성 세포. 내성 세포의 비율을 측정하기 위해, 다른 조건 (렌티 바이러스 현탁액의 상이한 양 형질 배양)에 대한 죽은 세포의 비율 (비 저항성 세포)를 추정하고 nontransduced 셀 (선택 제어 역할 셀)에 대한. [- (죽은 세포의 비율) 100 %]로 내성 세포의 비율을 계산합니다.
      주 : 렌티 바이러스 현탁액의 상이한 양을 가진 transductions이 이중으로 수행 된 경우, 전달 효율이 더 정확하게 추정 될 수있다. 비 형질 세포 조건은 선택 제어 역할; 렌티 바이러스 현탁액의 서로 다른 양의 형질 문화에 대한 죽은 세포의 비율이 낮아야한다. 내성 세포의 추정 비율은 가능성이 두 유전자에 대한 긍정적 인 hiPSCs를 선택하는 데 사용됩니다. 일반적으로, 우리는 세포의> 90 %가 형질 도입 상태에서 hiPSCs이었다 선택할s는 5 (D)의 선택 기간을 생존.
   3. hiPSCs의 소비 매체를 기음과 우물에 준비된 E8 매체의 1 mL를 넣어. 5 % CO _2의 분위기와 가습 37 ° C 배양기에서 12 웰 플레이트 O / N를 놓습니다.

	G418의 최종 농도	퓨로 마이신의 최종 농도
4 일	250 μg의 / mL의	2 μg의 / mL의
5 일	250 μg의 / mL의	2 μg의 / mL의
6 일	250 μg의 / mL의	1 μg의 / mL의
7 일	250 μg의 / mL의	1 μg의 / mL의
8 일	250 μg의 / mL의	1 μg의 / mL의

표 1 : 선택 기간 동안 항생제의 농도. 선택 기간의 5 D 동안 퓨로 마이신 및 G418의 농도.

5. 선택을 중지하고 일반 배양 (나중에 하루 9)를 시작
   1. 세포의 E8 매체 / ㎖ 및 퓨로 마이신으로 최종 농도 50 μg의 최종 농도 G418로 보충 된 것을 제외하고는도 5 (D)의 선택 기간 정상 hiPSCs로 rtTA / Ngn2 양성 hiPSCs 배양 후 0.5 μg의 / mL로.
      주 : 셀은 백업 역할을 (세포의 냉동 보존을위한 표준 프로토콜에 따라) 고정 할 수 있습니다. 그것이 많은 장래 분화 실험 rtTA / Ngn2 양성 hiPSCs 같은 배치의 사용을 허용하기 때문에, 분화 프로토콜의 재현성을위한 중요한 공정이다.

6 웰에 신경을 rtTA / Ngn2 양성 hiPSCs 3. 차별화다자간 및 유리 Coverslips는

참고 :이 프로토콜에서, 세부 사항은 두 개의 서로 다른 기판, 즉 6 자 다자간 및 커버 글라스에 (물론 당 9 기록 1 참조 내장 미소 전극과 6 독립적 인 우물로 구성 장치)에 rtTA / Ngn2 양성 hiPSCs 차별화 제공됩니다 24- 웰 플레이트의 웰. 프로토콜은, 그러나, 쉽게 표면적에 따라 언급 된 값을 스케일링함으로써, (12, 6 웰 플레이트의 웰에 대해, 예를 들어)보다 큰 기판들에 대해 적용될 수있다.

1. 신체의 체중 측정 또는 커버 글라스 (하루 0과 1 일)를 준비
   1. 분화의 시작 전날, 제조업체의 권고에 따라 신체의 체중 측정을 소독.
   2. 접착 단백질 폴리 -L- 오르니 틴 (PLO) 멸균 초순수의 최종 농도를 50㎍ / ㎖로 희석한다. 코트 100 μL를 배치하여 6 웰의 MEA 전극 활성 영역각 웰에 희석 PLO의 놓습니다. 멸균 핀셋을 사용하여 24 웰 플레이트의 우물에 커버 슬립을 놓습니다. 각 웰에 희석 PLO의 800 μL를 추가합니다. 1000 μL 피펫 팁을 아래로 밀어 부동에서 커버 슬립을 방지합니다.
   3. 5 % CO _2의 분위기와 6 자 MEA를 24 웰 플레이트 O / N에 가습 37 ° C 배양기를 품어. 다음 날, 희석 PLO를 대기음. 멸균 초순수 회 6 웰 다자간의 유리 표면과 커버 슬립을 씻는다.
   4. 최종 (6 잘 MEA의 경우) 20 μg의 / ㎖의 농도 (유리 된 커버 용) 10 μg의 / mL의 차가운 DMEM / F12의 라미닌을 희석. 바로 코트를 각 웰에 100 μL 강하를 배치하여 6 웰 다자간의 활성 전극 면적. 마찬가지로, 코트로 24 웰 플레이트의 각 웰에 희석 된 라미닌의 커버 슬립을 400 μL를 추가합니다. 1000 μL 피펫 팁을 아래로 밀어 부동에서 커버 슬립을 방지합니다.
   5. 적어도 2 시간 동안 5 % CO _2의 분위기와 가습 37 ° C 배양기에서 6 웰 MEA를 24 웰 플레이트를 품어.
2. hiPSCs 플레이트 (1 일)
   참고 : 단계 3.2.1에서 언급되는 볼륨 - 3.2.4는 rtTA / Ngn2 양성 hiPSCs는 6 웰 플레이트에서 배양하는 것이 하나의 웰의 세포를 수확한다고 가정합니다. 6- 웰 다자간 및 / 또는 커버 슬립에 세포를 도금에 필요한 볼륨 6 웰 다자간 및 / 또는 실험에 사용 된 커버의 수의 수에 의존한다; 단계 3.2.6에 지정된 번호 - 3.2.8 다른 실험 크기로 확장 할 수 있습니다.
   1. 따뜻한 DMEM / F12, CDS 및 R / T에 1 % (v / v)의 페니실린 / 스트렙토 마이신과 E8 매체. E8 매체에 최종 4 μg의 / mL의 농도 및 ROCK 저해제에 독시 싸이클린을 추가합니다.
   2. rtTA / Ngn2 양성 hiPSCs의 소비 매체를 기음과 1m를 추가hiPSCs에 L의 CDS. 5 % CO _2의 분위기와 가습 37 ° C 배양기에서 5 분 - 3을 품어. 세포가 서로 분리되는지 여부를 현미경으로 확인한다.
   3. 부드럽게 1,000 μL 피펫으로 세포를 중단하고 15 mL의 튜브에 세포를 전송, 잘 2 mL의 DMEM / F12를 추가합니다. 세포 현탁액에 7 ML의 DMEM / F12를 추가합니다. 5 분 동안 200 XG에서 세포를 스핀.
   4. 뜨는을 대기음 및 제조 E8 매체의 2 mL를 넣어. 15 ML 튜브의 측면에 대한 1,000 μL 피펫의 팁을 넣어 부드럽게 세포를 재현 탁하여 hiPSCs을 떼어 놓다. 세포 해리 여부를 현미경으로 확인한다.
   5. 혈구 챔버를 사용하여 세포 (세포 / ㎖)의 수를 결정한다.
      참고 : 80에서 잘 6 잘 판 - 총 4.0 × 10 ⁶ 세포 - 90 %의 포화 상태는 일반적으로 3.0를 얻을 것입니다.
   6. 희석 라미닌을 대기음. 6- 웰 MEA를 들어, 세륨을 획득하기 위해 세포를 희석7.5 × 10 ⁵ 세포 / ㎖의 LL 서스펜션. 6- 웰 MEA의 각 웰에 유효 전극 면적에 세포 현탁액 100 ㎕ 방울을 첨가하여 세포를 접시. 커버 슬립 들어, 4.0 × ¹⁰⁴ 세포 / ㎖의 세포 현탁액을 수득 세포를 희석. 24 웰 플레이트에 세포 현탁액 500 μL를 첨가하여 세포를 접시.
      주 : 다자간에 대한 최종 세포 밀도는 커버 슬립 (도 1A 및 B)보다 더 높다. 우리는 높은 세포 밀도는 네트워크 활동의 적절한 기록에 필요한 것을 발견했다. 프로토콜에서, 번호는 분석을위한 최적의 것으로 판명이 제공된다.
   7. 2 시간 (다자간) 또는 O / N (24 웰 플레이트)에 대한 5 % CO _2의 분위기와 가습 37 ° C 배양기에서 6 잘 MEA를 24 웰 플레이트를 놓습니다.
   8. 2 시간 후, 조심스럽게 6 자 다자간의 각 웰에 준비 E8 매체의 500 μL를 추가합니다. 6 우리를 배치O 다자간 LL / 5 % CO _2의 가습 된 분위기로 37 ° C의 배양기에서 N.
3. 매체를 변경 (2 일)
   1. 다음날, 1 % (v / v)의 N-2 보충제, 1 % (v / v)의 비 필수 아미노산, 1 % (v / v)의 페니실린 / 스트렙토 마이신과 DMEM / F12을 준비합니다. 추가 인간 재조합 뉴로 트로 핀 -3 (NT-3) 4 μg의 최종 농도, 최종 10 NG / ml의 최종 농도로 10 NG / ㎖의 인간 재조합 뇌 유래 신경영 양인자 (BDNF)의 농도, 및 독시사이클린을 / mL로. 37 ° C까지 매체를 따뜻하게.
   2. 배지 0.2 μg / ML의 최종 농도로 라미닌을 추가한다. 결과 매체를 필터링합니다. 6 잘 다자간의 우물에서 보낸 매체와 24 웰 플레이트를 대기음 및 제조 매체로 교체합니다. 5 % CO _2의 분위기와 6 자 MEA를 24 웰 플레이트 O / N에 가습 37 ° C 배양기를 품어.
4. 쥐의 성상을 추가 (3 일)
   참고 :이 프로토콜에서 언급 된 볼륨이 쥐의 성상 세포는 T75 문화 플라스크에서 배양 있다고 가정합니다. 문화에 추가 된 쥐의 성상 세포는 좋은 품질의 것이 중요합니다. 우리는 쥐의 성상 세포는 좋은 품질의 여부를 확인하기 위해 두 가지 기준을 사용합니다. 첫째, 쥐의 성상 세포 문화는 쥐 배아의 뇌에서 분리 한 후 10 일 이내에 합류 성장을 할 수 있어야한다. 둘째, 래트 성상 세포 배양을 분할 한 후, 래트 성상 세포가 합류, 모자이크 단층 (도 1C)을 형성 할 수 있어야한다. 래트 성상 세포 배양이 두 가지 조건을 만족하지 않으면, 우리는 분화 실험 본 배양을 사용하지 부탁.
   1. RT까지 예열 0.05 % 트립신 EDTA. 37 ℃로 1 %와 (v / v)의 페니실린 / 스트렙토 마이신을 DPBS과 DMEM / F12를 따뜻하게.
   2. 쥐의 성상 세포 문화의 소비 매체를 기음. 5 ㎖ DPBS를 추가하여 문화를 씻고 주위에 부드럽게 휙.
   3. AspirDPBS를 먹고 5 mL를 0.05 % 트립신 EDTA를 추가합니다. 주위에 부드럽게 트립신 EDTA를 휙. 10 분 - 5 5 % CO _2의 분위기와 가습 37 ° C 배양기에서 품어.
   4. 세포가 분리 여부를 현미경으로 확인합니다. 플라스크를 몇 번 쳐서 마지막 세포를 분리합니다.
   5. 플라스크에 DMEM / F12 5 mL를 추가합니다. 10 mL의 피펫 플라스크 내부 부드럽게 세포를 씹다. 15 ㎖의 튜브에 세포 현탁액을 수집한다. 8 분 동안 200 XG에서 튜브 스핀.
   6. 뜨는을 기음과 DMEM / F12 1 mL에 세포를 재현 탁. 혈구 챔버를 사용하여 세포 (세포 / ㎖)의 수를 결정한다.
   7. 6 웰 MEA를 잘 당 7.5 × 10 ⁴ 성상을 추가합니다. 24 웰 플레이트의 웰 당 2.0 × 10 ⁴ 성상을 추가합니다. / N, 5 % CO _2의 가습 된 분위기로 37 ° C의 배양기에서 다자간하고 24 웰 플레이트 O 부화.
5. 매체를 변경 (4 일)
   2 % (v / v)의 B-27 보충, 1 % (v / v)의 L 알라 닐 L- 글루타민, 1 % (v / v)의 페니실린 / 스트렙토 마이신로 Neurobasal 매체를 준비합니다. 4 μg / ML의 최종 농도로 10 NG / ㎖, 및 독시사이클린 최종 농도 10 NG / ㎖, BDNF의 최종 농도 NT-3를 추가한다. 또한, 2 μM의 농도로 시토신 β-D 아라 비노 추가.
   참고 : 시토신 β-D-아라 비노는 성상 세포의 증식을 억제하고 신경 세포로 분화되지 않은 나머지 hiPSCs을 죽일 매체에 추가됩니다.
   1. 37 ° C까지 매체와 따뜻한 필터. 6 잘 다자간의 우물에서 보낸 매체와 24 웰 플레이트를 대기음 및 제조 매체로 교체합니다. 5 % CO _2의 분위기와 가습 37 ° C 배양기에서 6 자 다자간 및 24 웰 플레이트를 유지한다.
6. 매체를 새로 고침 (일 6-28)
   참고 : 6 일부터 시작, 반 새로 고침매체의 이틀. 이후 10 일부터 배지 성상 세포 생존 능력을 지원하기 FBS로 보충된다.
   1. 2 % (v / v)의 B-27 보충, 1 % (v / v)의 L 알라 닐 L- 글루타민, 1 % (v / v)의 페니실린 / 스트렙토 마이신로 Neurobasal 매체를 준비합니다. 4 μg / ML의 최종 농도로 10 NG / ㎖, 및 독시사이클린 최종 농도 10 NG / ㎖, BDNF의 최종 농도 NT-3를 추가한다. 10 일 이후부터 2.5 % (v / v) FBS를 포함하는 배지를 보충. 37 ° C까지 결과 매체와 따뜻한 필터.
   2. 6 잘 다자간의 우물과 1000 μL 피펫을 사용하여 24 웰 플레이트에서 소비 된 매체의 절반을 제거하고 준비 매체로 교체합니다. 5 % CO _2의 분위기와 가습 37 ° C 배양기에서 6 자 다자간 및 24 웰 플레이트를 유지한다.

4. hiPSC 파생 뉴런의 신경 생리 학적 프로파일을 설정

참고 :에 후 2 ~ 3 주분화 duction는 hiPSC 유래 신경 다른 하류의 분석에 사용될 수있다. 이 섹션에서, 어떤 전방 분석의 예는 hiPSC 유래 신경 세포의 신경 생리 학적 프로파일을 설정하기 위해 수행 될 수 주어진다.

1. 다자간을 사용하여 신경 네트워크 활동을 특성화
   1. 다자간 환경에서 배양 hiPSC 유래 신경 세포의 전기 생리 활동의 기록 20 분. 기록하는 동안, 37 ℃의 온도를 유지하고, MEA에 가습 가스 (5 % CO _2, 20 % O _2, 75 % N _2)의 일정한 느린 흐름을 팽창하여 매체를 증발하여 pH 변화를 방지 .
   2. 1200X 증폭 (MEA 1060 MCS) 후에, MCS 데이터 수집 카드를 사용하여 10 kHz에서 신호를 샘플링. 사용자 정의 소프트웨어 패키지 ^(23)를 사용하여 데이터 (스파이크 버스트 탐지를) 분석 할 수 있습니다.
2. 단일 세포 전기 생리 활동을 특성화
   1. 직립 현미경 침수 고정 단 기록 챔버로 hiPSC 유래 신경 세포 배양 물을 함유하는 커버 슬립을 전송. 자발적인 활동 전위-유발 시냅스 전류 (sEPSC) ^24의 기록 20 분. 신경 과학 프로그램을 사용하여 시냅스 이벤트를 검출한다.
3. 신경 형태와 synapsin 표현의 특성을
   1. 수정 및 MAP2 대한 hiPSC 유래의 신경 세포를 염색 synapsin-1 / 2, ^{22, 24, 25} PSD-95. 이미지 분석 소프트웨어를 사용 synapsin-1 / 2, PSD-95 puncta의 수를 정량화.

결과

여기에서 우리는 성공적으로 hiPSCs이 전사 인자 neurogenin-2 ^(12)을 통해 발현에 의해 대뇌 피질의 신경 세포로 직접 분화되는 프로토콜을 수정 한 우리는 다자간의 사용을 위해 적응했다. 이러한 접근은 빠르고 우리의 분화 유도 후 셋째 주 동안 이미 기능적 신경 네트워크 활동을 얻을 수 있도록 효율적이다.

분화 프로토콜의 과정 동안, 세포는 신경 세포 형태 학적으로 유사하기 시작했다 : 소 공정을 형성하고, 신경 세포는 서로 (도 1a)에 접속을 시작했다. 우리는 개발 과정에서 자신의 신경 세포의 형태와 시냅스 특성을 측정하여, 건강한 제어 hiPSC 라인에서 파생 된 신경 세포의 신경 생리 학적 프로파일을 설립했다. hiPSC 파생 뉴런은 시작 후 다른 일에 MAP2 및 synapsin-1 / 2 염색분화 (그림 2A)의. 유도 된 신경 세포 3 주 분화 유도 한 후 이미 성숙한 신경 세포의 형태를 보여줍니다. synapsin-/ 2 puncta의 (시냅스의 수에 대한 값)의 개수는 synapsin-/ 2 면역 세포 화학 염색에 기반으로 정량화 하였다. synapsin-/ 2 puncta의 수는 신경 연결의 레벨은 또한 (도 2B)을 증가시키는 것을 제안하고, 시간이 지남에 증가했다. 이십삼일 분화 유도 후 synapsin-/ 2 puncta의 수는 두 개의 독립적 인 IPS 라인 (도 2c)에서 유사 하였다. 23 가장 DIV synapsin1 / 2 puncta의에서 기능 시냅스 (그림 2D)에 대한 나타내는 PSD-95 puncta의에 나란히했다.

장 등의 알에 의해 기술 된 결과와 일치. 우리는 범 신경과 서브 타입 별 피질 m에 의해 확인 흥분성 상위 계층 대뇌 피질의 뉴런의 인구를 생성 이러한 BRN2 및 SATB2로 arkers (레이어 II / III). 우리는 깊은 층의 뉴런 CTIP2 (레이어 V) 또는 FOXP2 (레이어 VI) (그림 2E와 F)에 대한 긍정적이었다 신경 세포를 관찰하지 않았다

hiPSC 유래 신경 세포의 전기 생리 활동을 특성화하기 위해, 우리는 개발 과정에서 측정 하였다 이러한 신경 세포에 전체 셀 전류 및 전압 클램프 녹음, 즉 고유 특성과 흥분성 입력을 사용했다. 신경 세포는 분화와 세포를 급상승의 비율의 시간 (그림 2G 및 H)를 통해 증가 된 후 이미 주 활동 전위를 생성 할 수 있었다. 또한, 신경 세포 분화 유도 후 일주일 이미 흥분성 시냅스 입력을 수신 : 흥분성 시냅스 입력 모두 주파수와 진폭은 개발 과정 (그림 2I - K)를 증가했다.

NT를 "fo를 = 유지-together.within 페이지를"1 "> 더 나은 단일 세포 활성 네트워크 수준의 기능을 형성하는 결합 방법을 이해하려면, 신경이 콘서트에서 작동하는 방법을 연구하는 것이 필수적입니다 다자간에 체외 신경 네트워크 배양 하였다. 신경 역학을 연구하기위한 귀중한 실험 모델을 구성한다. 우리는 6 자 다자간 (그림 2M)에 배양 건강한 제어 hiPSC 라인에서 파생 된 신경 세포의 전기 생리 네트워크 활동의 20 분을 기록했다. 몇 주를 분화 유도 한 후, 신경 세포 . 건강한 제어 hiPSCs에서 파생 된 자연 이벤트 (0.62 ± 0.05 스파이크 / s의도 2N) 표시, 기능적으로 활성 신경 네트워크를 형성 (즉, 16 D 분화의 시작 후) 개발이 단계에서 모든 채널을 포함하는 어떤 동기 이벤트가 없습니다 . 신체의 체중 측정 (그림 2O) 검출의 네트워크 활동의 수준은 개발 과정에서 증가 : t 후 넷째 주에 (도 2N 2.5 ± 0.1 스파이크 / s) 상기 장치의 모든 웰에 그 분화 유도는 신경 네트워크는 자발 활동의 높은 수준을 나타내었다. 긴 시간과의 네트워크도 전시 동기식 네트워크 버스트 (4.1 ± 0.1 버스트 / 분, 그림 2O) (2,100 ± 500 밀리 초).

그림 1 : 뉴런에 hiPSC 차별화. 커버 슬립에 신경 세포에 hiPSCs 분화 A. 세 시점. 다자간에 hiPSCs의 B. 도금. C. 성상은 T75 플라스크에 100 % 컨 플루 언시 (세포가 모자이크 단층을 형성 있습니다). 스케일 바 : 150 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2. 신경 세포 특성을 hiPSC는 유래. A. hiPSC 유래 뉴런 분화 개시 후 MAP2 (녹색) 및 synapsin-1 / 2 (적) 다른 날에 대해 염색 하였다. 스케일 바 : 10 μm의. 두 개의 독립적 인 실험에서 synapsin의 puncta의의 B. 정량. 각 실험에서, 적어도 10 세포를 분석 하였다. 두 개의 독립적 인 IPS 라인에서 파생 된 신경 세포의 DIV23에서 synapsin puncta에의 C. 정량화. D. hiPSC 유래 신경 PSD-95 (녹색)에 대한 염색 및 synapsin-1 / 2 (적) 이십삼일를 분화 개시 후 하였다. Synapsin puncta의는 PSD-95 puncta에 병렬 배치된다. E. hiPSC 파생 뉴런은 MAP2 (녹색) 및 BRN2 (빨간색) 또는 SATB2 (빨간색)의 분화 시작 후 23 일 동안 염색 하였다. MAP2 양성 세포의 F. 비율이표시된 마커에 대한 긍정적이었다. 이 활동 전위를 나타내는 G. 대표 전류 클램프 녹음은 초기 분화 시작 후 7 일 이내로서 생성 할 수 있습니다. 하나 이상의 활동 전위를 표시 분화의 유도 후 다른 일에 세포의 H. 비율. I. 분화 후 다른 일에 hiPSC 유래 신경 세포에 의해 수신 흥분성 시냅스 후 전류 (EPSCs)의 대표 흔적. 개발하는 동안 흥분성 시냅스 후 전류의 J. 주파수. 개발하는 동안 흥분성 시냅스 후 전류의 K. 진폭. L. 대표 (제어)없이 CNQX (CNQX)와 EPSC 녹음의 추적합니다. 하나 hiPSC 라인에서 파생 M. 뉴런은 6 웰 MEA에 배양 및 네트워크 활동은 hiPSC 파생 신경 네트워크 (16)과 분화의 유도 후 23 일 동안 표시됩니다. 에서 기록 된 활동각 웰 (10 kHz에서의 샘플링 속도)를 다른 색으로 표시됩니다 (기록의 20 분의 5 분이 표시됩니다). N. 발사 속도 (16)과 분화의 유도 후 23 라. O. 붕괴 속도 (16)과 분화의 유도 후 23 라. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

결과를 감안할 때, 생성 hiPSC 유래 신경의 품질은 세포의 신경 생리 학적 프로파일을함으로써 평가 될 수있다. 즉, 3 ~ 4 주 평가할 수 분화, 형태, synapsin-1 / 2의 발현 및 신경 세포의 전기 생리 개시 후이다. 그 시점에서, hiPSC 유래 뉴런 MAP2, synapsin / PSD-95 양성 면역 세포 화학을 수행되도록하는 뉴런과 같은 형태를 표시하고 exhibi 예상t 자발적인 전기 생리 활성 (모두 단일 셀 및 네트워크 수준에서).

토론

여기에서 우리는 장 등 알 발행 효율적인 hiPSC 분화 프로토콜을 구현했습니다. 다자간에 hiPSC 유래 신경 네트워크의 네트워크 활동을 측정 (2013) ^12. 우리는 신경 세포의 분화를 유도하기 전에 rtTA / Ngn2 양성 hiPSC 라인을 만들어 원래의 프로토콜을 적용. 이 추가 단계는 우리가 MEA의 신경 세포 밀도를 제어 할 수 있습니다. 신경 밀도 제어는 다자간의 프로토콜을 적응과 일관성을 보장하기위한 중요한 전제 조건이었다. MEA의 신경 네트워크를 사용하여 활성을 측정하기 위하여, 신경 세포를 직접 MEA 전극 ^{(17, 18)} 위에 고밀도 네트워크를 형성 할 필요가있다. 이것은 반드시 신경 세포의 도금 밀도를 통해 엄격한 제어를 필요로한다. rtTA / Ngn2 양성 hiPSC 라인이 전술 전에 분화에 hiPSCs의 급성 렌티 바이러스 transductions에 의존하지 않기 때문에 신경 세포 밀도를 제어 할 수 있습니다;rtTA / Ngn2 양성 hiPSC 라인을 따라서 거의 예를 들어, 렌티 바이러스 독성 및 가변 감염 효율, 인해 최종 수율에 어떤 변화가 없습니다.

실험 방법의 또 다른 중요한 단계는 구별 hiPSCs 함께 동시 배양 된 래트 성상 세포의 수이다. 아스트로 적극적 신경 기능에 중요한 공정이다 모두 시냅스 형성, 유지 및 제거를 제어함으로써, 신경 회로를 개발 미세화에 기여한다. 이 논문에서 제시된 프로토콜은 매우 성상 세포에 의존 : 완전히 성숙하고 기능적인 시냅스를 형성, 신경 세포는 성상 교세포의 지원을 필요로한다. 우리는 성상 세포의 수가 뉴런의 성숙 및 자연 활성을 갖는 신경 세포 네트워크의 형성을 지원하도록 hiPSC 유래 신경 세포의 수와 거의 동일 할 것을 경험 하였다. 우리의 성상 세포 프로토콜 수익률 일차 전지의 막 다른 이후제한된 수명을 가진 투 레스는 쥐의 성상 세포의 분리는 정기적으로 수행해야합니다.

장 등의 알 발행 프로토콜의 우리의 적응. (2013) ¹² MEA 기술을 사용할 가능성이 상당히 hiPSC 유래 네트워크의 네트워크 활동을 연구 할 수있는 능력을 개선한다. 이전과 MEA의 hiPSC 유래 신경 네트워크를 연구에 사용되는 프로토콜은 시간이 많이 소요되는 분화 과정에 의존 ^13-16. 장 등의 알에서 프로토콜입니다. (2013)는 신속하게 대체를 제공하고 변형이 더욱 가능 특히 높은 처리량 또는 약리학 적 연구에서, MEA 기술과 조합 hiPSC 유래 신경 세포를 사용할 수있게 변동성의 근원을 제거한다. 또한, 때문에 장 등 알 발행 방법. (2013) ¹² 상층 피질 뉴런의 균질 인구 우리 구성된 프로토콜 네트워크 (A) 내로 최대한 집중 연구하게 수득이 특정 신경 세포의 부분 집합의 ctivity.

그럼에도 불구하고,이 방법은 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 문화가 뉴런의 다른 클래스 (즉, 억제 및 흥분성 뉴런)이 이기종 네트워크를 구성하는 생체 네트워크에 유사한 덜하기 때문에 우선, 문화의 균질성도 단점으로 간주 될 수있다. 상기 MEA 기술로 hiPSC 유래 신경 세포의 사용을 향상시키기 위해, 다른 신경 세포 집단을위한 급속 (트랜스 계) 분화 프로토콜을 개발하는 것이 중요 할 것이다. 프로토콜을 사용할 수있게되면, 체외 네트워크는보다 밀접하게 생체 네트워크를 모방 한 것입니다. 둘째, 본 래트 성상 세포에서의 성장을 지원하기위한 hiPSC 유래의 신경 세포에 첨가되어야하고, 따라서 생성 된 신경 네트워크는 인간의 신경 네트워크 sensu stricto (좁은 의미로)하지 않다. 미래 솔에서 성상 세포 수도로 hiPSCs 차별화를위한 신뢰할 수있는 프로토콜이 문제를 ^{26했습니다.} 여기에 설명 셋째, 이차원 신경 네트워크, 복잡한 3 차원 생체 신경 네트워크를 연구하는데 한정 모델이다. 다행히, MEA 기술과 함께 쥐 주 뉴런의 입체 문화를 설명하는 프로토콜은 ^{27,28 이미} 사용할 수 있습니다. 전향 삼차원 배양 기술과 MEA 기술 hiPSC 유래 신경 세포와 성상 세포를 얻기위한 신속한 분화 프로토콜의 조합은 생물학적 기전 신경계 장애에 대한 신규 한 통찰력을 제공한다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lebovitz's L-15 medium	Gibco	11415-064
B-27 supplement	Gibco	0080085SA
Poly-D-Lysine (PDL)	Sigma-Aldrich	P6407
Ca2+/Mg2+-free HBSS	Gibco	14175-095
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054
2.5% Trypsin	Gibco	15090-046
High-glucose DMEM	Gibco	11965-092
FBS (Fetal Bovine Serum)	Sigma-Aldrich	F2442-500ML
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
70 µm cell strainer	BD Falcon	352350
DPBS	Gibco	14190-094
psPAX2 lentiviral packaging vector	Addgene	Plasmid #12260
pMD2.G lentiviral packaging vector	Addgene	Plasmid #12259
Basement membrane matrix	Gibco	A1413201
DMEM/F12	Gibco	11320-074
Cell detachment solution	Sigma-Aldrich	A6964
E8 medium	Gibco	A1517001
ROCK inhibitor	Gibco	A2644501	Alternatively, ROCK inhibitors like thiazovivin can be used.
Polybrene	Sigma-Aldrich	H9268-5G
G418	Sigma-Aldrich	G8168-10ML
Puromycin	Sigma-Aldrich	P9620-10ML
Vitronectin	Gibco	A14700
6-well MEAs	Multi Channel Systems	60-6wellMEA200/30iR-Ti-tcr
Glass coverslips	VWR	631-0899
Poly-L-Ornithine (PLO)	Sigma-Aldrich	P3655-10MG
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020-1MG
Doxycyclin	Sigma-Aldrich	D9891-5G
N-2 supplement	Gibco	17502-048
Non-essential amino acids	Sigma-Aldrich	M7145
NT-3, human recombinant	Promokine	C66425
BDNF, human recombinant	Promokine	C66212
Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054
L-alanyl-L-glutamine	Gibco	35050-038
Neurobasal medium	Gibco	21103-049
Cytosine β-D-arabinofuranoside	Sigma-Aldrich	C1768-100MG
Straight fine-tipped forceps	Fine Science Tools	11251
Fine-tipped spring scissors	Fine Science Tools	91500-09