네이티브, 태그 Huntingtin Exon1 모노 머와 스모 융합 전략을 사용 하 여 소의 생성

요약

여기, 우리가 현재 네이티브, 태그 무료 단위체의 밀리 그램 수량과 작은 유비퀴틴 관련된 한정자 (스모) 과도 융합에 따라 Huntingtin 단백질 (Httex1)의 exon1의 소의 생산을 위한 강력 하 고 최적화 된 프로토콜.

초록

Huntington의 질병 (HD) CAG 확장 (≥36)에 의해 발생 하는 상속 된 치명적인 신경 질환 HD 유전자의 첫 번째 엑손에서 Huntingtin 단백질 (Htt) 식의 결과로 또는 N 맨끝 확장된 polyglutamine (그 조각 polyQ) 스트레칭입니다.

Huntingtin 단백질 (Httex1)의 exon1는 휴대에 HD의 기능의 대부분을 작은 Htt 조각 및 동물 모델 Htt의 가장 널리 공부 조각 중 하나입니다. Httex1의 작은 크기는 더 이상 조각 또는 전장 Htt에 비해 표준 및 고해상도 기술을 사용 하 여 생물 특성을 실험적으로 더 많은 의무가 있습니다. 그러나, 높은 집계의 성향을 돌연변이 Httex1 (mHttex1) 증가 polyQ 콘텐츠 (≥42)는 어렵게 효율적인 표현과 충분 한 수량에이 단백질을 생산 하 여 그들을 액세스할 수 있도록 정화 시스템 개발 융해 단백질 또는 단백질의 기본 순서를 변경 하는 다른 전략을 사용 하지 않고 다른 분야에서 과학자. 우리는 강력 하 고 최적화 된 방법을 여기 제시 밀리 그램 양의 네이티브의 생산에 대 한 태그-무료 작은 유비퀴틴 관련된 한정자 (스모) 과도 융합에 따라 Httex1. 단순 하 고 전략의 효율성 Httex1, 따라서이 단백질 더 연구자에 게 편리 하 고 다른 실험실에서 실험의 재현성을 향상의 기본이 아닌 시퀀스를 사용 하는 필요를 삭제할 것 이다. 우리는 이러한 발전 또한 Htt로 개발 새로운 진단 도구 및 치료 치료 또는 HD의 진행을 느리게의 구조-기능 관계를 elucidating 겨냥 하는 미래 학문을 촉진 믿습니다.

서문

Htt 348 kDa 단백질 이며 여러 가지 생리 기능¹에 연루 되어 있다. Htt의 N-말단에 이상 36 잔류물의 확장된 polyQ 지역 포함, HD^2,3발생 합니다. HD 병 리 세포 포함이 고 피 질 신경 죽음, 영향을 받는 조직^4,5의 위축에 의해 특징입니다. PolyQ 반복 요로 포함 하는 여러 N 맨끝 Htt 조각 HD 환자에서 사후 두뇌에서 발견 된 고 huntingtin 단백질⁶의 분해 처리에 의해 생성 될 것으로 생각 되. 최근 연구 결과 Httex1를 벗어난 mRNA 접합에 의해 형성 될 또한 것이 좋습니다. Httex1 병 적인 polyQ 돌연변이 포함 하 고 동물에서의 overexpression HD⁷, 따라서 HD 병리학과 질병 진행^{6,이 조각의 가능한 중앙 역할을 강조의 핵심 기능 중 많은 정리 수 있습니다. 8,9}.

때문에 높은 집계의 성향을 돌연변이 Httex1 (mHttex1) 확장된 polyQ로, 기존 식 시스템의 대부분은 단백질 Httex1의 과도 융합에 기반 (티-S-전이 효소 (GST), thioredoxin (TRX) 등 또는 맥 아당 의무적인 단백질 (MBP) 및 펩 티 드 (폴 리 히스티딘) 차동의 식, 안정성, 정화 및 용 해도^{10,,1112,13,14 개선 하는 ,15,16,17,18,19,20,,2122,23 ,,2425,26,,2728}. 퓨전 파트너 프로 테아 제 트립 신 등의 분열 사이트를 포함 하는 짧은 시퀀스와 Httex1에 연결 되어, 담배 엣지 바이러스 (TEV) 효소 또는 분열 및 집계의 개시 전에 Httex1의 출시에 대 한 허용 하는 PreScission 또는 정화입니다. 비 traceless 분열으로 인해 추가 잔류물 및 불완전 쪼개 짐 (때문이 아니라 Httex1의 시퀀스 내에서 miscleavage로 잘린 조각의 창조의 가능성을 포함 하는 이러한 방법의 단점 Vieweg 외. 장점 및이 방법의 제한에 더 심층적인 토론 참조)¹⁰. 이러한 한계를 해결 하기 위해 우리는 최근 Synechocystis sp. 의 임시 N 맨끝 퓨전을 이용 하 여 처음으로 기본 태그 무료 Httex1의 생성을 활성화 하는 식 전략 개발 (Ssp) DnaB intein Httex1¹⁰. Intein 분열 traceless 이며 특정 단백질의 밀리 그램 수량을 산출 하는 동안 그것은 여전히 수익률을 줄일 수 있는 두 가지 단점이 겪고 있다: 즉, 조 분열 식, 및 분열을 통해 나타나는 사실 중 발생할 수 있는 intein의 특히 반복 확장 된 polyQ와 Httex1에 대 한 집계 인 단백질의 손실로 이어질 수 있는 몇 시간.

이러한 한계를 해결 하 고 아메리카의 생산을 위한 우리의 전략을 수정 하기 위해 태그 무료 Httex1, 우리 시스템을 개발 새로운 식 스모, 더 정확 하 게는 효 모 체 Smt3 Httex1에 과도 융합에 따라. 재조합 단백질의 생산을 위한 스모 시스템의 응용 프로그램 2004²⁹, 식의 증가 속도 스모 융해 단백질의 용 해도 시연 했다에 처음 출판 되었다. 스모 태그 인식 사이트를 필요 하지 않습니다 하지만 스모의 3 차 구조를 인식 하 고 실질적으로 miscleavage³⁰의 가능성을 제거 하는 단백질 특정 효소 1 (ULP1) 같은 유비퀴틴에 의해 죽 습 있을 수 있습니다. 또한, ULP1 중재 분열 및 traceless 이며 뒤에 추가 잔류물을 떠나지 않습니다. 퓨전 태그의 조 숙한 분열 autocatalytic intein¹⁰관찰은 완전히 피할 수는 외부 효소의 요구에 의해. 스모 전략은 재조합 단백질 생산^31,,3233요즘 널리 이용 된다, 하는 동안 우리가 보여이 문서에는 본질적으로 무질서의 세대를 위해 특히 유용 하다 Httex1 같은 집계 경향이, amyloidogenic 단백질. 우리는 믿고 단순성, 효율성 및 우리의 스모 퓨전-기반 방법의 견고성은 네이티브, 태그 무료 Httex1 더 액세스할 수 있도록 연구를 다른 분야에서 생체 외에서 Httex1의 비고유 시퀀스를 사용 하는 필요를 제거 . 이것은 Httex1의 구조-기능 관계를 명료 하 게 하는 미래 연구를 촉진 하는 중요 한 사전 이다.

프로토콜 설명 세균성 문화의 12 L에서 Httex1의 정화 하지만 프로토콜 쉽게 작은 또는 큰 규모 프로덕션에 대 한 적응 될 수 있습니다. 프로토콜 (wtHttex1) 야생 타입 Httex1의 생산에 설명 합니다 (23Q) 아래 polyQ 반복 길이 및 돌연변이 Httex1 (mHttex1)는 polyQ로 (43Q) 위에 길이 병원 성 임계값 (36Q) 반복.

프로토콜

1. 표현의 재조합 Httex1 23Q 및 43Q

1. 필요한 버퍼 및 솔루션을 준비 합니다. 1000 x 암 피 실린 (앰프, 100 mg/mL) 재고 솔루션, 필터 (0.2 µ m), aliquot-20 ° c.에가 게를 준비 Lysogeny 국물 (파운드) 매체를 준비 (25 g 파운드 당 1 L H₂O 밀러), 오토 클레이 브. 1 M 이소프로필 ß-D-1thiogalactopyranoside (IPTG) 재고 솔루션, 필터 (0.2 µ m), 약 수와 저장소 준비-20 ° c.에
2. 화학 유능한 대장균 B 열 충격 방법³⁴태그로 N 맨끝 His6-스모를 융합 하는 인간의 Httex1를 포함 하는 pTWIN1 벡터와 응급실 2566 변환.
   참고: 대장균 BL21 DE3 긴장은 또한 사용 되었습니다. 그러나,이 경우 잘림의 금액을 증가 관찰 되었다.
3. 1 파운드 매체의 200 mL를 접종 앰프 살 균 피 펫 팁 한 천 배지에서 단일 식민지를 추가 하 여 1 L 원뿔 플라스 크에 x. 30 ° C와 세균 인큐베이터에 20 h (하룻밤)에 대 한 180 rpm에서 문화를 품 어.
4. 살 균 피 펫과 문화의 1 mL 샘플을 가져가 라. 600에서 광학 밀도 측정 일회용 플라스틱 베트와 광도 계 (측정 범위 0.1과 1, 파운드 매체와 희석 사이 필요한 경우 존중) 샘플의 nm (OD₆₀₀). 3 L 문화에 0.05의 시작 OD₆₀₀ 귀 착될 것 이다 preculture의 양을 계산 (OD₆₀₀ 의 preculture = 3 50 mL를 의미할 것입니다).
5. 4 문화 접종 (1 파운드 매체의 각 3 L 앰프 5 L 플라스 크에 x), 살 균 피 펫과 preculture의 계산된 금액을 추가 하 여. 37 ° C와 세균 인큐베이터에서 180 rpm에서 문화를 품 어.
6. 모든 30 분 살 균 피 펫과 문화의 1 mL 샘플을 가져가 라. 일회용 플라스틱 베트와 photometer 샘플의 OD₆₀₀ 을 측정 합니다. OD₆₀₀ 에 도달 했습니다 (일반적으로 1-2 시간) 후 0.1 세균 인큐베이터의 온도 14 ° C를 설정 하 고 냉각 하는 동안 부 화를 계속 합니다. 모든 30 분 살 균 피 펫과 문화의 1 mL 샘플을 가져가 라. 일회용 플라스틱 베트와 photometer 샘플의 OD₆₀₀ 을 측정 합니다.
   참고: 시간 문화를 달라질 수 있습니다 사용, 인큐베이터와 그래서 냉각을 시작 하는 시간 인큐베이터 사용의 유형에 따라 적응 해야 할 수도 있습니다. 그러나, 온도 기울기를 변경 해야만 영향을 미칠 작은 수익률에 스모 융해 단백질 꽤 안정적인 것으로 나타납니다.
7. OD₆₀₀ (일반적으로 후에 1-2 h) 0.3-0.4을 도달 했습니다 때, 문화는 overexpression의 SDS 페이지 분석에 대 한 사전 유도 샘플. 셀의 대 등 한 금액을 제공 하는 샘플 크기를 계산 하 고 Coomassie에 좋은 신호 스테인드 SDS 페이지: 10 대 잘 젤: 볼륨 0.2 mL = /od₆₀₀; 15 잘 젤에 대 한 절반을 가져가 라.
   1. OD₆₀₀와 세균성 문화 = 0.4, 걸릴 500 µ L. 계산 된 양의 멸 균 피 펫과 세균성 문화를 가져가 라. 샘플 (g, 4 ° C, 2 분 x 18000) 아래로 회전 시키십시오 그리고 삭제는 상쾌한. 분석 (1.11 단계)를 사용할 준비가 될 때까지-20 ° C에서 펠 릿을 유지.
8. 각 3 L 문화 솔루션을 1 M IPTG 재고 솔루션의 pipetting 1.2 mL에 의해 단백질 표정 유도 (최종 농도 0.4 m m). (하룻밤) 16 h 14 ° C에서 문화를 배양을 계속 한다.
   참고: 온도 일반적으로 도달 했습니다 ~ 20 ° C 때 IPTG 인큐베이터의 성능에 따라 추가 됩니다.
9. 1.7 단계에 설명 된 절차를 따라 overexpression의 SDS 페이지 분석에 대 한 문화의 후 유도 샘플을 가져가 라.
10. 1 L 튜브 (3993 x g, 4 ° C, 10 분)에서 원심 분리 하 여 세포를 수확. 삭제는 상쾌한, 얼음에 셀 펠 릿을 유지 하 고 정화에 직접 진행.
11. SDS 페이지^35,36는 overexpression 분석. 버퍼와 염료를 로드 x 2의 20 µ L 20 µ L에서 사전 및 사후 유도 샘플을 resuspend. 열 블록에서 95 ° C에서 5 분에 대 한 샘플이 열 하 고 로드 하는 동안 여전히 뜨거운 15% 젤에 20 µ L. V. 얼룩 젤 Coomassie와 제조 업체의 지침에 따라 염색 180에 90 분 젤을 실행 합니다. 그림 1C의 대표적인 결과 함께 결과 비교 합니다.
    참고: 프로토콜 여기 중지 될 수 있습니다, 그리고 셀 펠 릿을 동결 하 고 몇 주 동안-80 ° C에서 저장 수 있습니다. 최적의 결과 얻으려면 신선한 세균성 펠 릿을 사용 하 고 동결을 방지 하는 것이 좋습니다. 동결-해 동 세포 세포의 용 해 및 Httex1의 저하가 발생할 수 있습니다. 이 단백질의 품질과 수확량은 줄어들 수 있습니다.

2. 세포 세포의 용 해 및 그의₆의 정화-스모 Httex1 융합 단백질은 금속 친화성 크로마토그래피 (IMAC)에 의해 움직일 수

1. 유리병에 버퍼 A의 2 리터를 준비 (50 mM Tris (hydroxymethyl)-aminomethan (트리 스), 500 m NaCl, 15mm 이미 m). 1 L의 버퍼 B (50 mM Tris, 500 mM NaCl, 500mm 이미 pH 7.4) 유리병에 준비 합니다. 용 해 소금, 후 10 N HCl로 pH를 조정 하 고 병 상단 필터 (0.65 μ m)와 신선한 병에 솔루션을 필터링 합니다. 1000 x phenylmethylsulfonyl 불 소 (PMSF, 0.3 M) 준비 솔루션, 100 µ L를-20 ° c.에 게 aliquot를 재고
   참고: 프로토콜은 반전 단계 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC RP) 정화 및 8-9 h 이내 동결은 세균 펠 릿의 세포에서 모든 단계를 완료 수 있도록 설계 되었습니다. 제한 집계와 베이스, 일시 중지 없이 빠르게 작동 하 고 또는 얼음에 4 ° C에서 모든 단계를 수행 하는 것이 좋습니다.
2. 미리 냉장된 버퍼 A. 추가 버퍼에 세균성 펠 릿의 100 ml PMSF 재고 솔루션 및 프로 테아 제 억제제의 5 개의 정제 (최종 볼륨의 30 mL 당 1) 100 µ L을 추가 하 고 자기 저 어 바 교 반 및 wi 위아래로 pipetting으로 현 탁 액을 균질 목 살 균 10 mL 피 펫 (~ 30 분).
3. 50 mL 일회용 플라스틱 튜브에 40 mL의 aliquots에 박테리아 정지를 나눕니다. 세포 세포의 용 해 (70% 진폭, 총 쥡니다 시간 5 분, 간격 30 s 쥡니다, 30 s 일시 중지)에 대 한 물/얼음 일괄 처리에서 각 약 수 sonicate
   참고: 쥡니다 단계에서 샘플 열 하지 않습니다 중요 하다. 쥡니다 동안 열 분산을 개선 하기 위해 얼음 목욕 물 좀 추가 하는 것이 좋습니다. 쥡니다 절차는 다른 악기를 사용 하는 경우 적응 할 수도 있습니다. 프랑스 누르거나는 microfluidizer와 같은 다른 세포 방법 뿐만 아니라 작동 한다 및 샘플 및 단백질 집단의 난방을 피하기 위해 도움이 될 수도 있습니다. 이 소자 들은 우리의 실험실에서 사용할 수 있었던 고 우리가 우리의 쥡니다 프로토콜 함께 좋은 결과 얻은.
4. 나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS 페이지) 분석에 대 한 lysate의 50 µ L의 샘플을 가져가 라. Centrifuge 샘플 (18000 x g, 4 ° C, 2 분) 하 고 새로운 테스트 튜브에 녹는 일부 플라스틱. 버퍼 A는 피 펫의 50 µ L에서 불용 성 부분을 resuspend. SDS 페이지 분석 (단계 2.6)까지 얼음에 샘플을 유지.
5. 명확히는 lysate 원심 (39191 g, 4 ° C, 60 분).
6. 원심 분리 단계에서 세포 세포의 용 해 단계 SDS 페이지를 분석 합니다. 각각은 lysate의 가용성과 불용 성 부분에 염료를 로드 x 2의 50 µ L를 추가 합니다. 95 ° C에서 5 분에 대 한 열 하 고 여전히 뜨거운 15% 젤에 2 µ L을 로드 합니다. V. 얼룩 젤 Coomassie와 제조 업체의 지침에 따라 염색 180에 90 분 젤을 실행 합니다. 그림 1C의 대표적인 결과 함께 결과 비교 합니다.
7. 상쾌한 (0.45 μ m, 주사기 필터) 필터. SDS 페이지 분석 (단계 2.11)에 대 한 필터링 된 상쾌한의 20 µ L의 샘플을 가져가 라.
   참고: 일반적으로 명시 하 고 필터링 된 상쾌한의 90 ~ 100 mL의 볼륨은 얻어진 다. 일반적으로, 3 주사기 필터는 충분 합니다. 여과 성가신 경우 원심 분리 속도 및/또는 시간을 증가 하려고 합니다.
8. 고정된 금속 친화성 크로마토그래피 (IMAC) 4 ° C³⁷에서 빠른 성능 액체 착 색 인쇄기 (FPLC) 시스템에 의해 명백 하 게 박테리아 lysate에서 His6-스모 Httex1 융합 단백질을 분리.
   1. 명확히 작성 superloop 및 Ni NTA 열에 부하로 lysate (제거, 청소 하 고 제조업체의 설명서에 따라 다시 로드, 이전 빈 실행 권장) 세척을 10 mL/min에서 버퍼 A의 2 mL/분 통과 10 열 볼륨 (CV, 200ml) 언바운드 단백질 밖으로.
   2. 2.5 융해 단백질을 elute 차입에 대 한 로드 하 고 세척 50 mL와 5 mL의 분수 크기를 사용 하는 버퍼 B 2 mL/분의 100%의 이력서 (50 mL). 그림 1D의 대표적인 결과 함께 결과 비교 합니다.
9. SDS 페이지 분석 (20 µ L)에 대 한 각 분수의 샘플을가지고 고 수영장 아이맥 크로마의 피크에 융해 단백질을 포함 하는 분수. (2S, 3S) 추가-1,4-Bis (sulfanyl) 부탄-2, 3-diol (DTT) 및 L-시스테인 (최종 농도 100 mM) 분말과 부드럽게 튜브를 거꾸로 하 여 디졸브로.
   참고: 우리의 경험에서 다른 분수에 융해 단백질의 순도 비교. 조치로, 순화 된 융해 단백질의 분수 아이맥 농축된 분수의 집계를 방지 하기 위해 후 빠르게 풀링된 수 한다. 또한, 스모 태그와 HPLC 정화의 분열에 직접 진행 하는 것이 좋습니다. 필요한 경우 프로토콜 여기 중지 될 수 있습니다. 융해 단백질의 희석된 솔루션 액체 질소에서 냉동,-80 ° C에 저장 되었고 수율에 있는 뜻깊은 감소 없이 녹고 후 정화. 24 h 4 ° C에서 융해 단백질의 희석된 솔루션의 저장소는 또한 비슷한 결과 제공합니다.
10. SDS 페이지 아이맥을 분석 합니다. 각 샘플 염료 로드의 20 µ L를 추가 합니다. 조 재료 (2.7), 언바운드 분수, 세척 분수와 15% 젤에 차입 피크의 각 분수의 2 µ L을 로드 합니다. V. 얼룩 젤 Coomassie와 제조 업체의 지침에 따라 염색 180에 90 분 젤을 실행 합니다. 그림 1D의 대표적인 결과 함께 결과 비교 합니다.

3. 분열은 그의₆-스모-태그와 HPLC 정화

주의: Trifluoroacetic 산 (TFA) 휘발성 액체 이며 원인 심각한 화상 그래서 주의 처리할 수 있습니다. 증기 두건에 모든 처리를 하 고 적절 한 개인 보호 장비 (즉일회용 nitrile 장갑, 안전 안경, 연구실 코트)를 착용.

1. 5 L 병에서 물 (용 매 a: H₂O, 0.1% (TFA) 5 l 플라스틱 주사기 TFA의 5 mL을 추가. 이기의 2.5 L 병에 플라스틱 주사기 TFA의 2.5 mL을 추가 (용 매 b: 이기, 0.1 %TFA).
2. HPLC 시스템 제조 업체에 의해 제안으로 준비 합니다. 깨끗 한 열을 보장 하기 위해 빈 실행을 수행 합니다.
3. UPLC (3.5 단계)에 의해 분열 반응을 모니터링 하는 ULP1의 추가 하기 전에 융해 단백질의 100 µ L의 샘플을 가져가 라.
4. 새로운 50 mL 튜브에 융해 단백질의 20 mL를 전송 ULP1 재고 솔루션의 0.4 mL를 추가, 얼음에 품 어. 얼음에 남아 있는 융해 단백질을 유지.
   참고: 태그 그의 촉매 조각 403-621 유비퀴틴 같은 특정 효소 1의 (여기 "ULP1" 라고도 함) 다니엘 스모 태그에 사용 되었다. 융해 단백질 쪼개진된 Httex1 보다 더 안정적입니다. 전체 일괄 처리의 스모 태그 다니엘을 하지는 것이 좋습니다. 대신, 바로 그리고 완전히 HPLC 열에 적용 수 있는 크기의 aliquots를 계속 합니다.
5. 10 분 마다 울트라 고성능 액체 크로마토그래피 (UPLC)에 의해 진행 상황을 모니터링 하는 분열 반응의 100 µ L의 샘플을 가져가 라. 원심 (18000 rpm, 4 ° C, 2 분) 샘플 및 2 µ L UPLC, 상쾌한의 분석 (그라데이션 10%에서 90%에서에서 용 매 B A 0.25 ~ 3 분을, 1 분, 10 %B 참조 악기 사용에 대 한 제조 업체의 지침). ULP1의 추가 하기 전에 샘플 및 샘플 후 얻은 chromatograms를 비교 합니다. 그림 2B대표 결과 함께 결과 비교 합니다.
6. 스모-절단 완료 되 면 (융해 단백질의 피크 UPLC 크로마에 사라졌다 고 새로 나타나는 스모와 Httex1 피크로 완전히 변환 됩니다), 주사기 필터 (0.22 μ m)와 샘플을 필터링.
   참고: 스모 분열은 일반적으로 매우 빠르다 (4 ° C에서 10-20 분) 따라서 UPLC 분석 실행 시간 4 분의 반응을 모니터링 하는 데 유용한 도구입니다. HPLC 전에 샘플 필터링 정화 열의 수명 증가를 주로 예방 조치입니다. 샘플 탁 설정 하지 해야 합니다.
7. RP HPLC에 의해 필터링 된 샘플 정화 (용 매 A, 15 mL/분에서 40 분 이상에서 25-35% 용 매 B의 그라데이션 (0-10 분: 5%; 25 10-12.5 분: 5%; 12.5-52.5 분: 25 35%, 52.5 57.5 분 35 ~ 95%; 악기 사용에 대 한 제조 업체의 설명서를 참조 하십시오). 그림 2C대표 결과 함께 결과 비교 합니다.
   참고: Httex1와 그의₆-스모 별도 RP HPLC에 의해 잘. 그러나, 시작 및 피크의 끝에서 잘린된 Httex1의 소량 수 있습니다. 순수한 물자의 최대 금액을 얻기 위해 작은 분수를 수집 합니다.
   주의:를 사용 하 여 적절 한 안전 장비 (즉, 연구실 코트, 절연된 장갑, 얼굴 방패) 때 극저온 유체를 처리.
8. HPLC 분수 전기 살포 이온화 질량 분석으로 분석 (ESI-MS, autosampler, 10 µ L를 주입, 0.6 mL/min, 용 매를 흐름: 20% B a, 열, 악기 사용에 대 한 제조 업체의 지침을 참조)와 UPLC (그라데이션 10%에서 90% 용 매 B a에서 0.25 ~ 3 분, 1 분, 10 %B 참조 하십시오 악기 사용에 대 한 제조 업체의 지침). 50 mL 플라스틱 튜브에 유사한 순도 수영장, 액체 질소에서 동결 및 lyophilize. 무게 2 mL 플라스틱 튜브로 동결 건조 된 단백질을 전송 하 고-20 ° c.에 저장
9. UPLC, ESI-MS와 SDS 페이지 순화 된 소재를 특징. 1.5 mL 튜브에 깔끔한 TFA의 8 µ L에 동결 건조 된 Httex1의 100 µ g을 녹이 고 닫힌된 테스트 튜브에 실 온에서 20 분 동안 품 어. 신중 하 게 질소 또는 아르곤의 스트림 연기 후드에서 TFA 증발. 샘플의 손실을 방지 하기 위해 질소/아르곤의 낮은 압력을 사용 합니다.
   1. UPLC에 의해 H₂o. 분석 2 µ L의 100 µ L에 3.8 단계에서 ESI-MS에 의해 5 µ L 단백질 분해. 혼합 20 µ L 단백질 해결책의 염료를 로드 x 2의 20 µ L로.
   2. SDS 페이지 10 µ g 1 µ g의 금액을 분석 합니다. V. 얼룩 젤 Coomassie와 제조 업체의 지침에 따라 염색 180에 90 분 젤을 실행 합니다. 그림 2D대표 결과 함께 결과 비교 합니다.

4. 피 및 Httex1 단백질의 Resolubilization

주의: TFA는 휘발성 액체 이며 원인 심각한 화상 그래서 주의 처리할 수 있습니다. 증기 두건에 모든 처리를 하 고 적절 한 개인 보호 장비 (즉, 처분할 수 있는 니트 릴 장갑, 안전 안경 및 실험실 코트)를 착용.

1. 10 mL 50 mL 튜브에 premixed 분말에서 Dulbecco의 버퍼링 하는 인산 염 (DPBS) (137 m m NaCl, 2.7 m m KCl, 10mm 나₂HPO₄, 2mm KH₂포₄, pH 7.4)을 준비 합니다. 각 사용 하기 전에 0.2 µ m 필터를 통해 DPBS 솔루션을 필터링 합니다.
2. 1.5 mL 튜브에 깔끔한 TFA의 12 µ L에서 동결 건조 된 Httex1의 150 µ g을 녹이 고 닫힌된 테스트 튜브에 실 온에서 20 분 동안 품 어. 신중 하 게 질소 또는 아르곤의 스트림 연기 후드에서 TFA 증발. 샘플³⁸의 손실을 방지 하기 위해 질소/아르곤의 낮은 압력을 사용 합니다.
   참고: 일반적으로, 해산 하 고 단백질의 50 µ g 세분화 4 µ L TFA를 사용 합니다. 이 절차는 내부에 단백질의 영화를 만들 것입니다 테스트 튜브의 벽. 를 방지 하기 위해 다음 단계에서 Httex1의 즉각적인 집계 사전 냉각된 버퍼를 사용 하 고 얼음에 항상 단백질을 유지 하 고 높은 농도 방지.
3. 사전 냉각된 DPBS의 1 mL에 분해 단백질을 녹이 고 pH 7.2-7.4로 1 M NaOH 조정. 1.5 mL 플라스틱 튜브 (20000 x g, 4 ° C, 20 분)로 단백질 해결책 100 kDa 원심 필터를 통해 필터링.
   참고: Httex1의 계산된 이론 농도 손실 가능성에 대 한 계정에 원하는 최종 농도 보다 높은 수준 이다. 여과 단계는 단백질의 해체 동안 형성 수 있습니다 모든 집계를 제거 하는 데 필요한.
4. 아미노산 분석 (λ₂₁₄에서 검출)에 따라 UPLC 보정 곡선을 사용 하 여 Httex1의 농도 결정 하 고 2 µ g 단백질의 아미노산 분석 농도¹⁰을 확인을 보낼. 3 µ M의 농도를 추가 하는 DPBS의 양을 계산 Httex1.
5. 3 µ m 단백질 테스트 튜브에 DPBS의 계산된 금액을 추가 하 여 희석. 집계 프로토콜의 개시까지 얼음에 튜브를 유지.
   참고: Httex1 43Q 솔루션에 저장 되지 합니다. 항상 신선한 단백질 솔루션 위의 프로토콜에 따라 준비 합니다. Httex1 단백질-20 ° c.에 동결 건조 된 분말으로 잘 저장 된다

5. 감시는 집계 활동의 Httex1 43Q UPLC 원형이 색 성 (CD) 분광학 및 전송 전자 현미경 (TEM)에 의해 집계의 특성을 사용 하 여의

1. 이전에 보고 된³⁹편 uranyl 편대 솔루션을 준비 합니다.
2. Httex1의 집계 시작 37 ° C (피의 프로토콜에서 위에서 설명한 대로 준비 하는 솔루션의 1 mL 사용)에서 DPBS에서 3 µ M 솔루션을 배양 하 여 43Q.
   참고: Httex1의 집계 요구와 실험의 목적에 따라 더 높은 농도에서 수행할 수 있습니다.
3. UPLC를 사용 하 여 표시 시간 점 (0, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48 및 120 h)에 수용 성 단백질의 양을 계량. 그렇게 하려면, 35 µ L의 약 수를 받아 하 고 원심 (20000 x g, 4 ° C, 20 분)에 의해 불용 성 집계를 제거 합니다. UPLC에는 상쾌한의 4 µ L를 삽입할. 악기 소프트웨어 ⁴⁰을 사용 하 여 피크 면적의 변화에 따라 녹는 단위체의 비율을 계산 합니다. 그림 3A에 대표 결과 함께 결과 비교 합니다.
4. 0에서 48 h에 CD 분광학을 사용 하 여 이차 구조에 변화를 특징. 100 µ L의 약 수를가지고 고는 타원 측정 (1 m m 쿼 츠 베트, 195 nm 250 nm, 20 ° C, 데이터 포인트 마다 0.2 nm, 속도 10 nm/min, 디지털 통합 시간 2 s, 1.0의 대역폭 nm). 샘플의 평균 6 스펙트럼을 취득 하 고 회선 폭 99의 이항 필터를 사용 하 여 부드러운. 평균 물질 어 금 니 타원 (θ_MRE)⁴¹로 스펙트럼을 플롯 합니다. 그림 3B대표 결과 함께 결과 비교 합니다.
5. 가장 하 여 집계의 구조 및 형태학 속성 특징. Formvar/탄소 코팅 200 메쉬, 글로우 방전 구리 격자 1 분 씻어 0.7% (w/v) uranyl 편대와 30에 대 한 얼룩의 15 μ를 한번 15 μ 물으로 두 번 격자에 대 한에 단백질 해결책의 3 µ L를 넣어 0.7 %w / v uranyl 편대의 15 μ s. 격자의 TEM 분석을 수행 합니다. 그림 3C대표 결과 함께 결과 비교 합니다.

결과

Httex1는 N 맨끝으로 대장균 에 표현 된다 그의₆-스모 태그. 표현과 융해 단백질의 정화의 대표적인 결과 그림 1에서 요약 된다. Httex1 시퀀스 Htt와 Ala2, 시작의 잔류물 2-90 Met1 있기 때문에 완전히 쪼개진 vivo에서⁴²로 구성 됩니다. 23Q 변종 가리킵니다 아미노산의 번호 매기기, 표현된 융해 단백질의 완전 한 순서 그림 1에 표시 됩니다. 플라스 미드는 지역 사회와 공유 하는 가까운 장래에 Addgene에서 예금 될 것 이다. 플라스 미드와 표현된 융해 단백질의 회로도 그림 1B에 표시 됩니다. 융해 단백질의 대부분은 세포의 용 해, 모두는 23Q 및 43Q 변종에 대 한 후 성 분수에 및 His6-스모 Httex1 중간 수준 (그림 1C)에서 표현. 융해 단백질은 분자량에 따라 예상 보다 높은 마이그레이션합니다. 이것은 부분적으로 스모의 강한 배 주로 글루타민, 프롤린 잔류물을 포함 하는 Httex1의 특이 한 시퀀스 구성 때문입니다. Wildtype (23Q)와 돌연변이 (43Q) 융합 단백질 아이맥 (그림 1D) 공동 호스트 단백질 정화의 존재는 Httex1와 큰 샘플의 비교적 낮은 식 수준에 의해 설명 될 수 있다 하 여 ~ 80% 순도 농축 수 볼륨에는 열에 적용입니다.

그의 분열₆-스모 태그와 Httex1의 정화 그림 2A에 표시 됩니다. UPLC는 그의 분열을 모니터링 하는 효율적인 도구입니다₆-스모 태그 (그림 2B). 융해 단백질의 원래 피크 소비와 두 개의 새롭고 잘 분리 된 봉우리는 그에 해당₆-스모 태그와 Httex1 나타납니다. 분열 반응 10-20 분에 완료 됩니다. 서쪽 오 점 (WB) 분열 반응을 효율적으로 모니터링 하는 데 너무 느립니다 하지만 참조용 스모 분열의 완전성을 설명 하기 위해 그림에 포함 되었습니다. 두 Httex1 23Q와 43Q는 그의에서 잘 분리 될 수 있다₆-스모 라인란트-HPLC (그림 2C) 하 여 태그와 UPLC, MS 및 SDS 페이지 분석 (그림 2D)와 같이 고 순도에서 얻어 졌다.

이 방법으로 준비 하는 Httex1 단백질 Httex1의 예상된 집계 속성을 유지, 우리는 침 강 분석 결과 의해 37 ° C에서 Httex1 돌연변이의 fibrillization 활동 평가 설명 하기 위해 CD에 의해 이차 구조에 변화를 모니터링 분광학, 편으로 집계의 형태 특징. MHttex1 fibril 형성 침전 분석 결과 의해 결정 된 대로의 집계 활동의 대표적인 데이터 집합그림 3A에 표시 됩니다. 수용 성 Httex1 fibril 형성으로 인해 시간이 지남에 따라 43Q UPLC 여 계량 했다의 손실. 우리 보육의 48 시간 후 수용 성 단백질의 완전 한 고갈을 관찰합니다. 또한, 우리는 CD 분광학 (그림 3B)에 의해 단백질의 이차 구조를 결정. Httex1 43Q 교대에서 구조화 되지 않은 (λ_분 205 nm) 주로 β 시트 풍부한 구조 (λ_분 215 nm) 외피의 48 시간 후에. 이 구조적인 변화는 48 시간 (그림 3C)에서 가장에 의해 관찰로 긴 원 집계의 형성으로 동반 된다.

그림 1 . 식과 정화는 그의₆-스모 Httex1 융합 단백질. 
(A)는 그의 아미노산 시퀀스₆-스모-Httex1-Q_N 퓨전 구문 (그의₆-스모 녹색에서 및 주황색에서 Httex1 Q_N ); (B) 표현과; 융해 단백질의 정화의 도식 개요 (C) 식과 세포; 후 융합 단백질의 용 해도의 SDS 페이지 분석 융해 단백질의 아이맥 정화 및 SDS 페이지 분수의 분석 (D) 크로마 (빨간 바: 언바운드 분수, 블루 바: 세척 분수, 검은 바: 분수 차입 피크 포함 된); 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2 . 그의 분열₆ 스모 태그 및 태그 무료 Httex1 Q_N 단백질의 정화.
(A) 회로도 개요; UPLC에 의해 ULP1와 스모 태그의 분열의 (B) 분석 (파란색: ULP1;의 추가 하기 전에 블랙: 20 분 (23Q), 각각 10 분 (43Q) ULP1의 추가 후에) 및 WB (MAB5492 1: 2000, 보조 염소 안티 마우스 항 체 1: 5000); Httex1;의 대리점 RP HPLC 정화의 (C) 크로마 D: UPLC에 의해 순화 Httex1의 분석 SDS 페이지와 ESI-MS; 예상된 분자량 각각 9943 다 (23Q)와 12506 다 (43Q) 이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3 . Httex1-43Q의 집계: UPLC에 따라 (A) 침전 분석 결과. (B)와 48 h에 집계의 48 h. (C) 가장 현미경에서 이차 구조의 CD 스펙트럼 (스케일 바는 200 nm). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

토론

이 프로토콜에서 우리가 설명한 효율적인 절차를 얻는 밀리 그램 양의 네이티브, 없는 Httex1에 대 한 23 또는 43 글루타민 잔류물을 포함 하. 이 Httex1는 그의 C-터미널 융합으로 표현 하 여 달성 되었다₆-아이맥 세포 lysate에서 융해 단백질을 사용 하 고 Httex1의 HPLC 정화 전에 죽 습 스모 태그. 스모 전략 다른 여러 가지 단백질의 생산에 사용 되었습니다, 우리의 방법이 보여준다는 스모 본질적으로 생성 하는 데 사용 또한 수 있는 독특한 속성 무질서, 집계 경향이 이전 되 고 입증 하는 amyloidogenic 단백질 ^43,44를 생산 하 고 처리 하기 매우 어려운. 선물이 프로토콜 "품행" 단백질의 생성에 대 한 간단 하 고, 사용 하기 쉬운 프로토콜 비교입니다. 스모 퓨전 solubilizes 고 표현과 아이맥 정화 단계 동안 Httex1를 안정 시킨다. 태그 집계 intein 전략¹⁰ 와 관찰의 조 숙한 분열은 더 이상 문제가.

본질적으로 무질서 단백질은 특히 저하에 취약. N 맨끝 저하 N17 지역에서이 프로토콜을 사용 하 여 문제가 되지 않습니다, 하는 동안 Httex1의 PRD에 잘림 발생할 수 있습니다. 잘린된 단백질은 hydrophobicity, 크기 및 Httex1에 매우 비슷합니다, 크로마 방법으로 그들을 제거 하는 것은 도전적 이다, 따라서 그것은 첫번째 장소에 있는 그들의 대형을 방지 하기 위해 좋은. 프로토콜에 밀접 하 게 튀어나와, 얼음에 항상 노력 하 고 충분 한 양의 protease 억제제를 사용 하 여 데 도움이 됩니다 관찰된 자르기의 수준을 매우 낮게 유지. Httex1의 C-말단에 융합 태그 적용 제거할 수 잘림 PRD에 쉽게 잘린된 단백질 뿐만 아니라 선호도 태그를 잃을 것 이다. 그러나, 기본 시퀀스 Httex1 프롤린과 우리의 지식 최선을 끝나는 대로이 옵션을 적용할 수 없습니다 유지 하는 경우 프롤린 후 traceless 고 효율적인 분열을 유도 하는 것으로 알려져 있습니다 C 터미널 퓨전 태그가 없습니다 있다.

프로토콜의 가장 중요 한 부분은 스모 태그의 분열 후 ULP1에 의해 해방 하는 Httex1의 처리입니다. 단백질은 RP HPLC에 의해 즉시 정화 한다. 다행히, 이것은 일반적으로 4 ° c.에 10-20 분에 완료 되는 효율적이 고 빠른 반응 대조적으로, intein 전략 수익률을 극대화 하기 위해 절충 한 불완전 한 분열 및 시작 집계 백업은 intein의 완전 한 분열에 대 한 몇 시간을 필요 합니다. 빠른 검사 결과 돌연변이 Httex1를 위한 시작 됩니다 23Q 이체는 긴 시간에 대 한 안정적인 반면 분열 반응에 비교적 높은 농도에서 집계. RP HPLC 정화 중 스모의 또 다른 장점은 드러납니다: 스모 더 친수성 이며 C4 반전 단계 열에서 완전히 elutes Ssp DnaB intein 소수는 열에 강하게 집착 하는 동안. 상업적인 ULP1는 매우 비용이 많이 드는, 단백질 고수익 이전 게시 프로토콜²⁹다음에 쉽게 생산 수 있습니다.

Httex1를 사용 하 여 이전 피의 프로토콜 적용의 중요 수 없습니다 충분히 강조. Httex1 같은 동결 건조 된 polyQ 단백질 안정 및 저장된 오랜 기간 수 있지만 물과 버퍼에 완전히 용 해 되지 않습니다. 미리 형성한 올리고 또는 소의 존재는 집계 속도 론 및 단백질⁴⁵의 생물 속성에 큰 영향을 있을 수 있었다. 여기에 설명 된 피의 프로토콜 단백질의 피의 미리 형성한 집계의 제거 및 동결 건조 된 샘플에서 단위체 Httex1의 솔루션의 수 있습니다. Httex1로 얻은 스모 및 intein 전략에 대 한 비슷한 집계 속도 론 및 fibril 형태학을 관찰 합니다.

Httex1 생산을 위한 이전 방법에 비해, 여기에 설명 된 스모 전략 몇 가지 장점이 하 고 구조를 조사 하기 위해 가능한 연구의 범위와 건강 및 질병에이 단백질의 기능적 속성을 확장 합니다. 스모-Httex1 융합 단백질은 취급 하기 쉽다, 그것 수 있습니다 동결 및 저장 하거나 무료 mHttex1 것이 신속 하 게 집계 하는 동안 상 온에서 24 h에 대 한 솔루션에 유지. 안정성과 스모 Httex1 융합 단백질의 높은 가용성 단백질을 조작할 수 없는 가능한 분열 후 mHttex1으로 효소와 화학 수정 소개 하 더 큰 유연성을 제공 합니다. 이 소개를 포함 한다 포스트 번역 상 수정, fluorophores, 스핀 레이블, biotin 태그, 등 여기에 제시 된 발전 한다 1) Httex1;의 구조-기능 관계를 명료 하 게 미래 연구를 용이 하 게 2) 생성 하는 새로운 도구를 조사 Htt 집계 및 병리학 확산; 3) 활성화 돌연변이 Httex1 안정 하 고 그 집계;를 방지 하는 분자를 식별 하는 새로운 분석 실험의 개발 그리고 4)이이 단백질에 작동 하 고 치료약을 찾기 위해 Huntington의 질병에 대 한 우리의 모험을 가입 하 려 다른 분야에서 과학자.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Uranyl formate (UO2(CHO2)2)	EMS	22450
Formvar/carbon 200 mesh, Cu 50 grids	EMS	FCF200-Cu-50
High Precision Cell made of Quartz SUPRASIL 1 mm light path from Hellma Analytics	HellmaAnalytics	110-1-40
Buffer Substance Dulbecco's (PBS w/o Ca and Mg) ancinne ref 47302 (RT) SERVA	Witech	SVA4730203
Ampicillin	AxonLab	A0839.0100
Luria Broth (Miller's LB Broth)	Chemie Brunschwig	1551.05
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	AxonLab	A1008.0025
E. coli B ER2566	NEB	NEB# E4130
Imidazole	Sigma	56750-500G
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail	Roche	4693116001
Anti-Huntingtin Antibody, a.a. 1-82	Merck Millipore Corporation	MAB5492
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H + L)	Licor	925-68070
PMSF	AxonLab	A0999.0005
HisPrep 16/10 column	GE Healthcare	28936551
C4 HPLC column	Phenomenex	00G-4168.P0	10 µm C4 300 Å, LC Column 250 x 21.2 mm, Phenomenex, 19x10 mm guard column, not temperature jacketed
Acetonitrile HPLC	MachereyNagel	C2502
Filtre seringue Filtropur S 0,45 ul sans prefiltre sterile	Sarstedt AG	83.1826
Spectrophotometer semi-micro cuvette	Reactolab S.A.	2534
Superloop, 1/16" fittings (ÄKTAdesign), 50 ml	GE Healthcare	18111382
Trifluoroacetic acid	Sigma	302031
GREINER Tubes fo FPLC 16 x 100 mm, cap. 12.0 ml	Greiner Bio-One	7.160 102
100 kD Microcon  fast flow filters	Merck Millipore Corporation	MRCF0R100
Vibra-cell VCX130 ultrasonic liquid processor	Sonics
Äkta 900 equipped with a fraction collector	GE Healthcare
Jasco J-815 Circular Dichroism	Jasco
Waters UPLC system	Waters		C8 BEH acquity 2.1x100 mm 1.7 micron column  , preheated column (40 °C), flow rate of 0.6 mL/min, injection volume of 4 μL
waters HPLC system	Waters		2489 UV detector and 2535 quaternary gradient module, 20 mL loop in a FlexInject housing
ESI-MS: Finnigan LTQ	Thermo Fisher Scientific
lyophylizer instrument	FreeZone 2.5 Plus
Tecnai Spirit BioTWIN	FEI		electron microscope equipped with a LaB6 gun and a 4K x 4K FEI Eagle CCD camera (FEI) and operated at 80 kV
37 °C shaking  incubator	Infors HT multitron Standard
Biophotometer plus	Eppendorf