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여기 우리는 초기 3'-테르미니의 공평한 결정 뿐만 아니라 단일 가닥 DNA 분자의 mutational 프로필을 제공 하는 깊은 시퀀싱 방법을 제시. 주요 응용 프로그램은 초기 retroviral 보완 DNAs (cDNAs) retroviral 반전 녹음 방송 과정 중에 생성 된 중간체의 특성 이다.
바이러스 복제 중 핵 산 중간체의 모니터링 바이러스 DNA 합성에 효과 항 바이러스 화합물 및 호스트 세포 단백질의 행동의 메커니즘에 대 한 통찰력을 제공 합니다. 여기 우리가 정의 retroviral 반전 녹음 방송 중간체 생리의 컨텍스트 내에서 바이러스 감염의 수 있는 세포 기반, 높은-범위, 그리고 고해상도 분석 결과의 부족을 해결 합니다. 설명된 방법은 3'-테르미니 단일 뉴클레오티드 해상도 에이즈-1 감염 된 세포 내에서 초기 보완 DNA (cDNA) 분자의 캡처. 프로토콜 전체 세포 DNA, 바이러스 성 DNA 통해 하이브리드 캡처, 어댑터 결 찰, 젤 정화, PCR 증폭, 깊은 시퀀싱 및 데이터 분석에 의해 크기 분류의 대상된 농축의 수확을 포함 한다. 중요 한 단계 3'-DNA 테르미니 열 접합 기 분자의 효율적이 고 공평한 결 찰 이다. 설명된 방식 주어진된 샘플에 각 특정 길이의 역 증명서의 풍부를 결정합니다. 그것은 또한 어떤 잠재적인 돌연변이 역 증명서 및 그로 인하여 (내부) 시퀀스 변화에 대 한 정보를 제공합니다. 일반적으로, 분석 결과 DNA 3'-확장, 관련 된 모든 질문에 대 한 적합 한 서식 파일 시퀀스 알려져 있다 합니다.
해 부하 고 바이러스 복제 완전히, 점점 더 세련 된 복제 캡처 기술을 이해 중간체가 필요 합니다. 특히, 감염 된 세포의 컨텍스트 내에서 바이러스 성 핵 산 종의 정확한 정의 날짜 필요가 많은 바이러스 성 복제 메커니즘 새로운 통찰력을, 제공할 수 있습니다 되었습니다 고립 생체 외에서 반응 검사. 대표적인 예는 레트로 바이러스, 인간 면역 결핍 바이러스 1 (hiv-1) 등에서 반전 녹음 방송 과정입니다. 에이즈-1 반전 녹음 방송, 동안 바이러스 성 효소 역전사 (RT) 복사 단일 가닥 RNA 게놈 이중 가닥 DNA의 다양 한 단계 순화 된 단백질으로 뇌관 확장 분석 실험에서 주로 공부 하 고 핵 되었습니다. 산1,2,3,,45. 기본 원리는 설치 되었다, 하는 동안 이러한 분석 모든 바이러스 및 세포질 구성 요소를 포함 하지 않습니다 그리고 관련된 요인의 생물학 관련 stoichiometries 반영 되지 않을 수 있습니다. 따라서, 우리는 그들의 정확한 cDNA 3'-테르미니 (즉, 그들의 정확한 길이 결정)와 생활의 감염의 맥락에서 뉴클레오티드 순서 반전 녹음 방송 중간체의 스펙트럼을 결정 하는 강력한 기술 설계 셀6. 시간 과정 실험 항 바이러스 분자 또는 단백질, 효율성 및 processivity DNA 합성에 영향을 미칠 수의 존재 등 다양 한 조건 하에서 증명서의 프로 파일을 비교에 이용 될 수 있다에서 데이터 수집 및 축적입니다. 이것은 종종 대상된 약물 설계 및 성공적인 치료 적 개입에 대 한 기초 자연 병원 체 라이프 사이클의 더 상세한 이해가 있습니다.
일련의 다음 빼기 가닥 강한 정지 라는 짧은 단일 가닥 cDNA 녹취 록을 생산 하는 RT에 의해 확장 된 게놈 RNA 서식 파일에 tRNA 뇌관의 어 닐 링에 의해 시작 하는 연속 이벤트를 구성 하는 V-1 반전 녹음 방송 (-sss) (참조 그림 1)입니다. 그 후,-sss cDNA에서에서 전송 됩니다 5'-긴 단말기 반복 (LTR)는 3'-LTR 게놈 RNA, 그것 anneals와 역할 계속된 RT에 대 한 입문서 중재 마이너스의 신장으로 가닥 DNA의 (반전 녹음 방송1 리뷰 보기 , 2 , 3 , 4).이 첫 번째 가닥 전송 반전 녹음 방송;의 속도 제한 단계 중 하나입니다 따라서,-sss cDNA 축적으로 알려져 있다. 감염 된 세포에 반전 녹음 방송 제품을 잡으려고 기본 워크플로 및 라이브러리 디자인 그림 2a에 설명 되어. 특정 뇌관 및 분석 프로토콜에 사용 되 고 표 1 에 나열 된 설정을 대상으로 모두 일찍 반전 전사 cDNA 중간체 23에서 ~ 650의 길이 범위 내에서 nt, 180-182 nt sss DNA를 포함 됩니다. 그러나, 전략에 적절 한 부 적응 하면 후반 반전 녹음 방송 제품 뿐만 아니라 다른 바이러스 및 시스템, 응용 프로그램 목표 3'-OH 포함 DNA 끝을 감지 하는 있습니다. 고려해 야 할 중요 한 제한 포함 최종 PCR 제품의 길이 범위 도서관; 특히, 서식 파일에는 오픈 3'-말단에 어댑터와 업스트림 뇌관 사이트 사이 거리 초과 ~ 1000 nt 것입니다 가능성이 덜 효율적으로 시퀀싱 할 잠재적으로 라이브러리 준비 (동안 기술 편견 오해 소개 자세한 내용 및 적응 제안에 대 한 토론 참조).
이전 3'-테르미니 핵 산 물가의 체계적인 측정 보고 기법 RNA, DNA, 분자에 집중 했다. 하나의 예제 3' 레이스 (cDNA 끝의 급속 한 확대)7, mRNA의 polyadenylation에 의존 하는. 또한, 어댑터 결 찰 기반 전략 RNA ligases 고용 개발 되었다, RLM-레이스 (RNA 리가 중재 경주)8 또는 레이스 (cDNA 끝의 결 찰 기반 확대)9는 포함. 그것은 결 찰 기반 확대는 어떤 바이어스도 자체 결 찰 반응에 의해 도입에 민감한 강조 하는 것이 중요입니다. 예를 들어 결 찰 3' 위치, 순서, 총 분자 길이, 또는 로컬 구조체에 특정 염기에 따라 더 효율적일 수 있습니다. 리가 환경 설정 같은 분자와 우리와 다른9,10관찰 판독에 허위 진술의 불완전 한 캡처 이어질. 여기에 설명 된 프로토콜의 어댑터 추가 단계 동안 결 찰 바이어스를 최소화 하기 위해 우리는 결 찰 전략의 수를 테스트 하 고 T4 DNA 리가 머리 핀 단일 가닥 DNA 접합 기의 사용을 발견 (곽 외에 의해 설명된대로. 11) 유일한 프로시저를 결 찰 효율 제어 oligonucleotides6특별히 선택 된 세트와 함께 평가 하는 때에 큰 차이가 발생 하지 않았다 양적 결 찰에 가까운 것. 이 결 찰 전략의 선택은, 그러므로,이 프로토콜의 성공에 주요 기능.
날짜 하려면, 감염 된 세포에 있는 에이즈-1 RT 진행의 모니터링 주로 성취 되어 고유 하 게 측정 하는 짧은 지 또는 긴지를 뇌관 프로브 세트를 사용 하 여 양이 많은 PCR (정량)와 다양 한 길이의 반전 녹음 방송 제품을 측정 하 여 (초기와 늦게, 각각) cDNA 제품12,,1314. 이 정량 접근은 셀룰러 시스템에서 반전 녹음 방송 과정의 본질적인 효율성을 결정 하는 적절 한, 출력 시퀀스 정보 없이 파생 되 고 상대적으로 낮은 해상도입니다. 우리의 새로운 접근, 기술 격차 최적화 된 어댑터 결 찰, PCR 중재 라이브러리 생성 및 깊은 시퀀싱 주소에 기반 하 고 양적 및 단일 뉴클레오티드에 에이즈-1 감염 시 반전 녹음 방송 모니터링 하는 기회 제공 해상도입니다.
우리 두 제안 된 모델에 대 한 HIV-1 제한 요소 APOBEC3G의 용량 (apolipoprotein B mRNA 편집 효소 촉매 polypeptide 같은 3 세대) 방해 하 사이 구별 하는 연구에서이 메서드의 유틸리티 설명가지고 바이러스 역 사본6의 생산입니다.
참고: 특정 시 약 및이 프로토콜에 사용 된 장비에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.
1. 바이러스 생산 및 세포 감염
주의: 감염 에이즈-1만 승인된 biosafety 제약 실험실에서 처리 되어야 합니다.
참고:15,16인간 미 발달 신장 (HEK) 293T 세포에 설명 된 대로 1.1 단계, 표준 절차 이며 되었습니다의 과도 transfection에 의해 HIV-1 입자의 생산 기술 이전. 일반 세포 배양 절차는 기술 이전17.
2. DNA 추출, 에이즈-1 DNA 정량화, 및 하이브리드 캡처에 의해 농축
3. 어댑터 결 찰
4. 어댑터 제거 및 크기 분리
5. PCR 증폭 및 라이브러리 준비
6. 도서관 평가
7. 높은 처리량 시퀀싱 실행
8. 데이터 분석
이 문서에서 설명 하는 기술은 HIV-1 반전 녹음 방송 투여 인간의 단백질 APOBEC3G에 의해 (A3G)의 억제를 기본 메커니즘을 해결 하기 위해 광범위 한 연구에 적용 된6. 그림 3 은 CEM-SS T-세포에 감염 된 vif에서 샘플에서 프로토콜을 채용 후 얻은 대표적인 결과-A3G의 존재 또는 부재에 부족 한 HIV-1. 고유한 읽기의 총 수 같은 6 어떤 PCR 중복 항목을 필터링 후 각 샘플에서 얻은 nt 바코드와 동일한 길이 (제공 하는 분석 소프트웨어에서 수행 됨)에 그림 3는그려집니다. A3G의 증가 수준을 RT 중재 cDNA 합성 이전 설명 하 고 측정 하는 정량6,13,,2122에 A3G의 억제 효과 반영 하는 총 읽기 수를 줄일 수 있습니다. 그림 3b, 첫 번째 182 내 각 가능한 길이에 분자의 분수 nt 표시 됩니다. A3G의 부재에 에이즈-1 감염에 대 한 가장 풍부한 종 주 180은 nt 중지 강력한 분자 자체, 일부 축적으로 읽기의 짧은 범위에 (23 ~ 40 nt) (파란 그래프 히스토그램 탑). 이 프로필의 짧은, 날카로운 증가 잘린 몇 가지 매우 구체적인, 재현할 수 위치에서 cDNA의 분자는 A3G 변경의 추가 감지 (중간과 더 낮은 그래프). A3G cytidine deaminase, 시 토 신-uridine (C T로 식별) 이므로 돌연변이 cDNA에서 A3G 감염 virions21,,2324에 때 발생 합니다. 얻은 시퀀싱 정보를 사용 하 여 C T 돌연변이의 비율 (빨간 점선)를 같은 그래프에 플롯 이었다. Mutational 프로필은 모든 독특한 읽기 결합에서 파생 된와 각 뉴클레오티드의 범위는 달라 집니다 주목 한다. 그러나, 시퀀스 정보와 관련 다시 각 분자 수는 특정 3'-말단과 상관 필요한 경우. 제공 하는 데이터는 Pollpeter 그 외 여러분 에서 찍은 6 과 mutational 간의 상관 관계 및 cDNA 길이 프로 파일 때문에 검색 및 분열 세포에 의해 deaminated cDNA의 DNA 복구 기계 시연 했다.
3'-매핑 방법에 대 한 긍정적인 제어 쉽게 알려진된 순서, 길이, 및 농도의 합성 oligonucleotides의 수영장을 처리 하 여 생산 수 있습니다. 이 컨트롤은 단계 3.3.2에서에서 어댑터 결 찰에 추가 하 고 모든 멀티플렉스 라이브러리에 포함 되어야 하는 것이 좋습니다. 컨트롤 샘플에서 가져온 데이터에만 매우 사소한 배경 읽기와 예상된 입력된 비율에서 모든 oligonucleotides 있어야 합니다. 그림 4 는 17 화학적 합성된 oligonucleotides의 긍정적인 컨트롤 집합의 결과 (시퀀스, 표 2참조)는 아데닌 비율에 혼합 했다. 예상 대로, 모든 분자에만 작은 변화 (상단 그래프)와 동등한 풍부에 가까운 나타납니다. 하지는 oligonucleotide로 표현 했다-sss DNA 시퀀스 내에서 대부분 위치 반환 하지만 읽기 수 0, 1 또는 2 nt 실제 제어 oligonucleotides 보다 짧은 부 종을 관찰 합니다. 우리는 이러한 작은 종 더 조사 하지 않은 하지만 저하 또는 불완전 한 제품 구매에 제공된 oligonucleotide 주식에 잠재적으로 존재 나타내는 가정 (oligonucleotides HPLC 정화는으로 지시 했다는 제조 업체 > 80% 순도를 나타냅니다). 아래쪽 그래프 실행, 어디 변이 약간 높은 17 oligonucleotides 사이 이며 더 이상 제어 분자 보다 효율적으로 검색 되는 전체 길이와 상관 관계가 다음 짧은 것 들 다른 라이브러리에서 컨트롤 샘플을 보여 줍니다. 이 PCR 반응에 또는 삽입 크기 최적은 MiSeq 시퀀싱 하는 동안 클러스터링에 사소한 편견 때문일 수 있습니다 하 고 특히 광범위 한 삽입 범위를 운반 하는 라이브러리에서 발생할 수 있습니다. 이 바이어스를 해결 하기 위해 기본적인 방법은 분자 길이 (핑크 라인)을 상호 연결 하는 바이어스를 나타내는 기울기에 따라 정규화 요소의 응용 프로그램입니다. 필요한 계산 분석 프로그램에 포함 되어 있습니다 (프로토콜에 8.3 단계 참조).
그림 1: V-1의 첫 번째 단계 반전 전사 보여주는 다이어그램. 과정 개시와 바이러스 성 cDNA (블루, 2 단계)의 연신 율을 허용 하는 게놈 바이러스 성 RNA (1 단계)에서 뇌관 바인딩 사이트 (PBS)에 tRNA(Lys,3) (오렌지)의 어 닐 링로 시작 합니다. 수반, 템플릿 게놈 RNA RT (3 단계)의 RNaseH 활동에 의해 저하 됩니다. 반전 녹음 방송 과정에서 첫 번째 전체 중간 마이너스 물가 강한-정거장입니다 (-) sss cDNA, RT 촉매 중 합은 5'-말단 gRNA 반복 (R) 지역 (3 단계)에 도달 하면 완료입니다. 중간 (-) sss는 3'-말단 게놈 RNA 서식의 보완 3'-긴 단말기 반복 (LTR) R 영역 어 닐 링에 의해 전송 됩니다. 여기에서 중 합 (4 단계)를 계속합니다. 설명된 방법에 반전 녹음 방송 진행 초기 바이러스 성 cDNA (파란색)의 정확한 길이 매핑하여 결정 됩니다. PPT, polypurine로; U5, 독특한 5'-시퀀스; U3, 독특한 3'-시퀀스 이 그림은 이전 간행물6에서 재 공포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 워크플로 개요 및 어댑터 결 찰 및 PCR 확대 전략의 설계도. (a) 워크플로 개요 설명 기술의 주요 단계 3'-테르미니 에이즈-1의 결정을 반대로 감염 된 세포에서 성적. 그림6이전 간행물 적응입니다. (b)는 접합 기의 결 찰 및 PCR 확대 전략의 회로도 정화 하 고 이전 단계에서 다양 한 길이의 초기 cDNA 분자는 T4 DNA 리가 사용 하 여 단일 가닥 DNA 어댑터에 출혈. 머리 핀 어댑터 (명명 된 "전체 곽 + MiSeq", 표 1참조) 디자인 곽 외에 의해 영감을 했다. 11. 어댑터는 임의의 운반 6 nt 바코드 시퀀스, 결 찰을 촉진 하기 위하여 기본 쌍 수 하 고 동시에 독특한 읽기에 대 한 식별자 역할. 3'-테르미니 어댑터의 스페이서 (SpC3) 각자 결 찰을 방지 하기 위해 수행 합니다. 합자 제품 초과 어댑터에서 변성 시키기 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (페이지)에 의해 구분 됩니다. 젤에 핵 산 스테인드 되며25에서일 우물을 어댑터에서 지역에서 3 개의 별도, 동등한 크기 젤 조각으로 잘라. 차입 후, 강 수, 물의 resuspension, 제품은 어댑터의 알려진된 순서를 단련 하는 뇌관으로 증폭 PCR (뇌관 1, 멀티플렉스 oligonucleotide 키트 재료의 표참조)와 첫 번째 22를 들고 뇌관 에이즈-1의 nt 5'-LTR 시퀀스 직후 tRNA (뇌관 2, MP1.0 + 22HIV). 5'-테르미니 선택한 뇌관의 동일한 라이브러리에서 실행 하는 개별 샘플을 구분 하는 인덱스 시퀀스 뿐만 아니라 선택한 시퀀싱 플랫폼 (P5 및 P7)에 대 한 어댑터를 수행 한다. 시퀀싱의 시작 지점을 읽기 뇌관 표시 됩니다. 파란색 상자는 원래 3'-테르미니 캡처된 분자의 결정에 대 한 관심의 영역을 나타냅니다. 이 그림은 이전 간행물6에서 적응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 대표적인 결과. (a) 총 읽기 수 설명 프로토콜 처리 대표 샘플입니다. 그들의 3'-테르미니 첫 번째 635 내와 에이즈-1 분자의 고유한 읽기로 확인 된 모든 시퀀스를 포함 하는이 마이너스의 nt 물가 cDNA (PPT, 최대 그림 1참조). A3G를 실행 하지 않을 에이즈-1 감염 A3G cDNA 합성을 억제 하 고 그로 인하여 총 읽을 수 감소 하는 반면 읽기의 가장 높은 번호를 생성 합니다. 감염 되지 않은 세포 합성 oligonucleotides 집합이 긍정적인 제어를 제공 하는 동안 부정적인 컨트롤로 제공 됩니다. b) nt 위치 23 182 사이 각 길이 대 한 cDNAs의 상대적인 풍부 (sss 전장 cDNA는 180 182 nt) 에이즈-1NL4.3 의 시퀀스 (x 축) 파란색 히스토그램 (왼쪽된 y 축에 규모)에 표시 됩니다. CDNA의 관계 되는 풍부는 시퀀스 182nt를 측정 하는 모든 읽기의 합으로 나눈-sss cDNA 순서 내에서 주어진된 뉴클레오티드에 종료 또는 더 적은의 절대 수에서 계산 했다. 빨간색 파선에은 읽기 들고 각각 위치 (-오른쪽 y 축에 규모)에 C-T/U 돌연변이의 비율입니다. 그림 3 b 는 이전 간행물6에서 재 공포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 제어 샘플의 대표적인 결과. 아데닌 금액 17 다른 길이 합성 oligonucleotides의 수영장에 대 한 두 개의 프로필은입니다. 이러한 oligonucleotides 에이즈-1NL4.3 에서 시퀀스 있고 다양 한 길이 커버 하는 3'-뉴클레오티드로 존재 하는 모든 4 기지 선정 됐다 ( 표 2참조). 위쪽 그래프 그림 3는에서 긍정적인 컨트롤 샘플을 보여 줍니다. 분자 길이 나는 오픈 3'-테르미니 향해 아무 중요 한 바이어스 검출 된다. 하단 그래프는 시퀀싱에 작은 길이 바이어스 생산 실행 다른 라이브러리를 보여 줍니다. 이 경우에, 그것은 크기 바이어스를 나타내는 기울기 (분홍색으로 표시)에서 파생 되는 정규화 요소를 적용 하는 것이 좋습니다. 이 그림은 이전 간행물6에서 재 공포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
올리고 이름 | Nt에 길이 | 시퀀스 | 목적 | 제조업체 (정화) | ||||||||||||||
전체 곽 + MiSeq | 61 | 5'-포-tgaagagcctagtcgctgttcannnnnnctgcccatagagagatcggaagagcacacgtct-SpC3-3' | 어댑터 | IDT DNA 기술 (HPLC) | ||||||||||||||
2xBiotin SS 미끼 | 40 | 5'-비오 틴-cagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggac-비타민 b 복합체-3' | 하이브리드 캡처 | MWG Eurofins (HPLC) | ||||||||||||||
Ss biotin 1-16 | 22 | 5'-cagtgtggaaaatctctagcag-BiTEG-3' | 하이브리드 캡처 | MWG Eurofins (HPLC | ||||||||||||||
Biotin tRNA + CTG | 16 | 5'-cagtggcgcccgaaca-BITEG-3' | 하이브리드 캡처 | MWG Eurofins (HPLC) | ||||||||||||||
MP1.0 + 22HIV | 82 | 5'-aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatctcactgctagagattttccacactg-3' | PCR 증폭 | MWG Eurofins (HPLC |
표 1: 등 길이, 시퀀스, 활용 하는 수정 설명 프로토콜에서 oligonucleotides의 테이블. 테이블은6이전 간행물 적응. 이 테이블을 excel 파일로 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
올리고 이름 | Nt에 길이 | 시퀀스 | 제조업체 (정화) | |||||||||||||
HTP 죄수 긴 C | 120 | 5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagctttattgaggcttaagc-3' | MWG Eurofins (HPLC) | |||||||||||||
HTP 죄수 긴 G | 119 | 5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagctttattgaggcttaag-3' | MWG Eurofins (HPLC) | |||||||||||||
HTP 죄수 긴 T | 116 | 5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagctttattgaggctt-3' | MWG Eurofins (HPLC) | |||||||||||||
HTP 콘 긴 A | 118 | 5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagctttattgaggcttaa-3' | MWG Eurofins (HPLC) | |||||||||||||
C 중반 HTP 콘 | 76 | 5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcac-3' | MWG Eurofins (HPLC) | |||||||||||||
G (a) 중반 HTP 콘 | 71 | 5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacg-3' | MWG Eurofins (HPLC) | |||||||||||||
G (b) 중간 HTP 콘 | 72 | 5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgg-3' | MWG Eurofins (HPLC) | |||||||||||||
A 중간 HTP 콘 | 69 | 5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacaga-3' | MWG Eurofins (HPLC) | |||||||||||||
T 중반 HTP 콘 | 85 | 5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactt-3' | MWG Eurofins (HPLC) | |||||||||||||
HTP 콘 짧은 A | 40 | 5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgaggga-3' | MWG Eurofins (HPLC) | |||||||||||||
HTP 죄수 짧은 T | 33 | 5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggt-3' | MWG Eurofins (HPLC) | |||||||||||||
HTP 죄수 짧은 G | 41 | 5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgaggg-3' | MWG Eurofins (HPLC) | |||||||||||||
HTP 죄수 짧은 C | 34 | 5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtc-3' | MWG Eurofins (HPLC) | |||||||||||||
HTP 콘 46 (T) | 46 | 5'-ctgctagagattttccacactg actaaaagggtctgagggatctct-3' | MWG Eurofins (HPLC) | |||||||||||||
HTP Con 83 (C) | 83 | 5'-ctgctagagattttccacactg actaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactac-3' | MWG Eurofins (HPLC) | |||||||||||||
HTP Con 103 (C) | 103 | 5'-ctgctagagattttccacactg actaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagc-3' | MWG Eurofins (HPLC) | |||||||||||||
HTP 콘 107 (A) | 107 | 5'-ctgctagagattttccacactg actaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagcttta-3' | MWG Eurofins (HPLC) |
표 2: 긍정적인 컨트롤 샘플으로 사용 하는 17 합성 컨트롤 oligonucleotides의 표. 상위 13 oligonucleotides 크기에 따라 선정 됐다 [긴 (116 ~ 120 nt), 중간 (69 ~ 85 nt), 짧은 (33 41 nt)] 그들의 3'-테르미니에 뿐만 아니라. 테이블은6이전 간행물 적응. 이 테이블을 excel 파일로 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
빠르고, 안정적이 고 비용 효율적인 딥 시퀀싱의 가용성 시퀀싱 기반 분석에 훌륭한 깊이 허용 하는 생명 과학의 분야에서 여러 측면을 혁명 있다. 나머지 도전 시퀀싱 라이브러리는 혁신적인 디자인 및 대표의 창조에 있다. 여기는 초기 바이러스 성 cDNA 분자, 특히 에이즈-1 반전 녹음 방송 과정의 중간체를 잡으려고 프로토콜에 설명 합니다.
이 전략에서 가장 중요 한 단계 양적이 고 공평한 방법으로 한 어댑터는 오픈 3'-테르미니에의 결 찰입니다. 두 ssDNA 테르미니 사이 ligations의 효율성, 둘 다 간-및 intramolecular, 조사 및 다양 한 애플 리 케이 션11,26,27,,2829에 대 한 최적화 되었습니다. 3.3 단계에 설명 된 조건에서 T4 DNA 리가와 머리 핀 어댑터를 사용 하 여의 선택은 우리가 다른 ligases, 어댑터 및 대표 하는 합성 oligonucleotides의 결 찰에 대 한 시 약을 평가 하는 경험적 최적화의 결과 에이즈-1 시퀀스 (표 2) (데이터 표시 되지 않음). 이러한 생체 외에서 시험 반응에서 우리 확인 T4 DNA 리가 머리 핀 접합 기의 결 찰 중재 곽 외에 설명 된 대로. 11, 매우 낮은 바이어스를가 하 고 초과에서 어댑터를 사용할 때 수락자 분자의 완전 한 결 찰 근처 달성 한다. 결 찰 효율은 멀티플렉스 뇌관 시스템에 대 한 호환 되는 어댑터를 렌더링을 뉴클레오티드 순서의 추가 의해 영향을 받는 ( 그림 4참조). 비교에서는, 우리가 발견 한 내 5' DNA/RNA 리가 ("A 리가" 참조 테이블의 자료 여기에 비해 정확한 ligases), 인 한 조작된 RNA 리가 일부 개발 된 ssDNA 수락자로 결 찰 효율 개선 27, RNA 리가 (이 하 "리가 B") 하지만 단일 기본 길이 차이 [표 2 oligonucleotides 사이 결 찰 효율에 강한 차이와 중요 한 바이어스를 했다 보다 두 ssDNA 분자 ligating에서 실제로 더 효과적 이었습니다. ; HTP G (a)와 (b) 중반 죄수]. 또한, 우리 발견만 최소한의 편견 반응에는 무작위로 5'-테르미니 들고 어댑터와 함께 "리가 C" (전략 "리가 C"의 알려진된 뉴클레오티드 바이어스를 오프셋 하는 데 사용; 딩 외예를 참조 하십시오. 그러나 30)., "리가 C"-중재 intermolecular ligations 완료, 렌더링 T4 DNA 리가 시스템 우수한 선택 했다.
프로토콜의 과정 및 긍정적이 고 부정적인 컨트롤의 포함 몇 가지 품질 관리 단계 분석 결과 계속 하기 전에 잠재적인 문제 탐지에 대 한 허용 하 고 노력을 해결 하기 위한 지침을 제공. 2.2.2 및 2.3.12 단계에서 정량 quantifications 입력된 자료의 양이 충분 한지 확인 합니다. 전형적인 cDNA에서 약 10, 000에 300, 000 µ L 당 200 µ L (단계 2.1)에서 차입 범위에 복사 번호. 하이브리드 캡처 단계 전체 에이즈-1의 일부 손실 될 수 있습니다 cDNA 수량을 농축 하 여 전후 genomic DNA를 정할 적절 한 뇌관을 사용 하 여 결정 될 수 있는 세포 DNA에 특정 HIV-1 cDNA의 강한 농축 초래 한다 하지만 정량 Pcr 또는 총 DNA 농도 측정 하 여. 복구 된 HIV-1 cDNA 하이브리드 캡처 단계 후 입력의 적어도 10% 되어야 합니다. 낮은 시작 물자 그렇지 않으면 성공적인 oligonucleotide 긍정적인 통제를 설명할 수 있습니다 (단계 3.3.2 참조) 읽기 샘플에서 달성만 국한. 낮은 읽기 전체 숫자 또한 MiSeq 어댑터 없이 없는 DNA의 존재로 인해 라이브러리 농도의 과대평가 의해 설명 될 수 있었다. 이 낮은 클러스터 밀도 귀 착될 것입니다 그리고 fluorometric 분석 실험에 의해 DNA 총계 뿐만 아니라 정량 하 여 라이브러리에 있는 에이즈-1 시퀀스의 농도 결정 하 여 향상 시킬 수 있습니다. 방법의 매우 민감한 성격 때문에 특별 한 주의 낮은 수준의 오염 뿐만 아니라 실험실 장비에서 (특히에서 높은 농도 제어 oligonucleotide 주식) 다른 샘플에서 둘 다 피하기 위하여 취해야 한다. UV 살 균 PCR 워크스테이션에서이 점에서 유리 하다. 마지막 도서관 (6.1.2 단계)의 자동화 된 젤 전기 이동 법은 더 품질 관리 조치 이다. 일반적으로 관찰 하는 핵 산 크기 범위는 150 ~ 500 nt. 뇌관 PCR 후 고 정화 (단계 5.2에서에서 참고) 수 결 석 하기 전에 선택적 컨트롤에서 검출 될 수 있는 사이입니다. 대표적인 결과 샘플 강도 곡선 피크는 약 160에서 170 nt와 두 번째 선명 피크 약 320 ~ 350 nt. 이 가능성이 상대적으로 짧은 (1 ~ 20 nt 삽입 길이) 역방향 성적표와 전체 길이 강한 정지 (180 182 nt 삽입 길이)에서 자주 본 더 높은 풍부를 반영 한다 (그림 3b).
제시 프로토콜 및 선택 된 뇌관은 초기 HIV-1 반전 녹음 방송 구조에 대 한 특정, 방법은 오픈 3'-테르미니 DNA의 결정을 목표로 모든 연구에 일반적으로 적용 됩니다. 다른 컨텍스트에서 필요한 주요 수정 하이브리드 캡처 및 뇌관 디자인 전략에 대 한 방법 있을 것입니다. 예를 들어 대상이 늦은 HIV-1 성적 증명서에 적응 될 경우, 많은 수는 cDNA의 길이 어 닐 링 하는 다른 캡처 biotinylated oligonucleotides의 권장 것 그리고 하이브리드 캡처 단계에서 손실 가능성이 줄어듭니다. 소개에서 설명 했 듯이, 그것은 한계는 3'-테르미니 바이어스의 다른 소스를 피하기 위해 감지 하는 범위를 설계할 때 고려 하는 것이 중요. 첫째, 있을 수 있습니다 편견 PCR 반응에는 어댑터와 템플릿은 훨씬 다양 한 길이의 경우입니다. 둘째, 시퀀싱 플랫폼 여기 사용 (예: MiSeq)는 최적의 클러스터링 원하는 삽입 길이 범위 고 훨씬 짧고 긴 제품 수 있습니다 하지 시퀀싱 할 같은 효율으로. 부분에서,이 계산, 선형 길이 바이어스에 대 한 수정 계수를 계산 하 여 이루어졌다 해결할 수 있습니다 ( 그림 4, 하단 그래프 참조). 그러나, 3'-테르미니 매핑을 원하는의 영역이 긴 경우 (> 1000 nt), 그것은 더 합자 녹취 록과 함께 반응 고 여러 업스트림 뇌관을 사용 하 여 3'-테르미니 섹션에서 평가 하는 것이 좋습니다.
분석 프로그램 자체 고정된 어댑터 시퀀스에 인접 한 HIV-1 시퀀스의 마지막 뉴클레오티드 모두는 물론 모든 돌연변이 식별 하기 위해 모든 기지의 기본 변화 분석의 특정 목적을 위해 작성 되었습니다. 다음을 구성 하는 개별 단계: 첫째, 어댑터 시퀀스 fastx 0.0.13 툴킷;를 사용 하 여 손질은 다음, (의미는 바코드를 포함 하 여 동일한 시퀀스) 중복 되는 모든 시퀀스는 제거 됩니다. 모든 나머지 독특한 읽기 다음 Bowtie (http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml)를 사용 하 여 3 개의 기초에서 설정 최대 불일치와 에이즈-1 시퀀스에 정렬 됩니다. 서식 파일 시퀀스의 첫 번째 635 구성 에이즈-1 cDNA (NL4.3 스트레인)-sss 시퀀스 및 polypurine 트랙 (U5-R-U3-PPT; 그림 1참조)까지 첫 번째 가닥 전송 제품의 nt. 따라서, 제공 된 소프트웨어 및 서식 파일 (V-1NL4.3의 초기 역 증명서의 감지) 같은 응용 프로그램에 대 한 메서드를 사용 하는 경우 직접 적당만 하다. 다른 대상 시퀀스에 대 한 만들 수 조정 해야한다. 3'-테르미니 각 읽기에 대 한의 위치 맞춤에 위치에 의해 결정 되었다. 각 위치에 대 한 기본 호출 기록 하 고 돌연변이 속도 변화, 읽기는 서로 다른 길이의 긴 삽입 하지 적용 될 수 있습니다 완전히 Read2에 125 기반 시퀀싱으로 각 베이스의 전체 범위에서 계산 됩니다.
결론, 설명된 방법 연구의 많은 유형 위한 유용한 도구가 될 믿습니다. 확실 한 응용 프로그램 기본 투여 약물 또는 셀룰러 제한 요소를 통해 반전 녹음 방송 억제 메커니즘의 조사를 포함 합니다. 그러나,만 비교적 작은 조정 3'-테르미니 다른 단일 가닥 DNA 바이러스 중간체, parvovirus 복제에서 예를 들어, 나타나는 내 매핑 시스템에 맞게 해야 한다. 또한, 방법, 특히 그것의 최적화 된 결 찰 단계, 원칙 elongations 세포 이중 가닥 DNA에 의해 촉매를 포함 하 여 모든 3'-DNA 확장 특성에 대 한 라이브러리 준비 디자인의 핵심 부분을 제공할 수 있습니다. polymerases입니다.
저자 들은 아무것도 공개 선언 합니다.
저자 인정 말림 실험실, 루이스 아폴로, Jernej Ule, 그리고 레 베 카 Oakey의 구성원에서 지원 합니다. 저자는 왕의 대학 런던 게놈 센터에서 매트 Arno와 데 비 휴즈 대학 대학 런던 (UCL)에 감사, 연구소 시설에 대 한 신경과 다음 세대 시퀀싱, MiSeq 시퀀싱에 대 한 실행 됩니다. 일 부여 계약 영국 의료 연구 위원회 (G1000196와 미스터/M001199/1 mm은), Wellcome 신뢰 (106223/Z/14/Z mm은 하), 유럽 위원회의 일곱 번째 기구 프로그램 (FP7 2007-2013 년)에 의해 지원 되었다 아니. PIIF-가-2012-329679 (D.P.), 하와는 보건 통해 남자와 세인트 토마스 ' NHS 재단 건강 연구 종합 메디컬 연구 센터 수상 국립 보건원 왕의 대학 런던 그리고 임금의 협력에 대 한 신뢰 대학 병원 NHS 기초 신망입니다.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Gibco | 31966-021 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15150-122 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
HeraCell Vios 250i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51030966 | |
Laminar flow hood - CAS BioMAT2 | Wolflabs | CAS001-C2R-1800 | |
10mm TC-treated culture dish | Corning | 430167 | |
TrypLE™ Express (1x), Stable Trypsin Replacement Enzyme | Gibco | 12605-010 | |
OptiMEM® (Minimal Essential Medium) | Gibco | 31985-047 | |
HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) | NIH Aids reagent program | 114 | |
Polyethylenimine (PEI) - MW:25000 | PolySciences Inc | 23966-2 | dissolved at 1mg/ml and adjusted to pH7 |
RQ1- Rnase free Dnase | Promega | M6101 | |
Filter 0.22 μm | Triple Red Limited | FPE404025 | |
15 mL polypropylene tubes | Corning | CLS430791 | |
Sucrose | Calbiochem | 573113 | |
Phosphate Buffered Saline (1x) | Gibco | 14190-094 | |
Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344060 | |
Ultracentrifuge | Sorval | WX Ultra Series | Th-641 Rotor |
Alliance HIV-1 p24 antigen ELISA kit | Perkin Elmer | NEK050001KT | |
CEM-SS cells | NIH Aids reagent program | 776 | |
Roswell Park Memorial Institute Medium | Gibco | 31870-025 | |
CoStar® TC treated multiple well plates | Corning | CLS3513-50EA | |
Benchtop centrifuge: Heraus™ Multifuge™ X3 FR | Thermo Scientific | 75004536 | |
TX-1000 Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientific | 75003017 | |
Microcentrifuge: 5424R | Eppendorf | 5404000060 | |
Total DNA extraction kit (DNeasy Blood and Tissue kit) | Qiagen | 69504 | |
Nuclease free H2O | Ambion | AM9937 | |
Cutsmart buffer | New England Biolabs (part of DpnI enzyme) | R0176S | |
DpnI restriction enzyme | New England Biolabs | R0176S | |
Oligonucleotides for qPCR | MWG Eurofins | N/A | HPSF purification |
TaqMan PCR Universal Mastermix | Thermo | 4304437 | |
LoBind Eppendorf® tubes | Eppendorf | 30108078 | |
Axygen™ aerosol filter pipette tips, 1000 μL | Fisher Scientific | TF-000-R-S | |
Axygen™ aerosol filter pipette tips, 200 μL | Fisher Scientific | TF-200-R-S | |
Axygen™ aerosol filter pipette tips, 20 μL | Fisher Scientific | TF-20-R-S | |
Axygen™ aerosol filter pipette tips, 10 μL | Fisher Scientific | TF-10-R-S | |
PCR clean hood | LabCaire | Model PCR-62 | |
DynaMag™2-magnet | Thermo | 12321D | |
Streptavidin MagneSphere® paramagnetic particles | Promega | Z5481 | |
Casein | Thermo Scientific | 37582 | |
End over end rotator, Revolver™ 360° | Labnet | H5600 | |
Tris-Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
Hydrochloric Acid | Sigma | H1758-100ML | |
EDTA disodium salt dihydrate | Electran (VWR) | 443885J | |
Sodium Chloride | Sigma | S3014 | |
Dri-Block® Analog Block Heater | Techne | UY-36620-13 | |
PCR tubes and domed caps | Thermo Scientific | AB0266 | |
PCR machine | Eppendorf | Mastercycler® series | |
T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202M | |
40% Polyethylene glycol solution (PEG) in H2O, MW: 8000 | Sigma | P1458-25ML | |
Betaine solution, 5M | Sigma | B0300-1VL | |
Gel loading buffer II (formamide buffer) | Thermo Scientific | AM8546G | |
Precast 6% TBE urea gels | Invitrogen | EC6865BOX | |
Mini cell electrophoresis system | Invitrogen, Novex | XCell SureLock™ | |
Tris/Borate/EDTA solution (10x) | Fisher Scientific | 10031223 | |
Needle 21 G x1 1/2 | VWR | 613-2022 | |
SYBR Gold nucleic acid stain (10000x) | Life Technologies | S11494 | |
Dark Reader DR46B transilluminator | Fisher Scientific | NC9800797 | |
Ammonium acetate | Merck | 101116 | |
SDS solution 20% (w/v) | Biorad | 161-0418 | |
Centrifuge tube filter | Appleton Woods | BC591 | |
Filter Glass Fibre Gf/D 10mm | Whatman (VWR) | 512-0427 | |
polyadenylic acid (polyA) RNA | Sigma | 10108626001 | |
Glycogen, molecular biology grade | Thermo Scientific | R0561 | |
Isopropanol (2-propanol) | Fisher Scientific | 15809665 | |
Ethanol, molecular biology grade | Fisher Scientific | 10041814 | |
Accuprime™ Supermix I (DNA polymerase premix) | Life Technologies | 12342-010 | |
NEBNext® Multiplex Oligo for Illumina (Index Primer Set 1 and 2) | New England Biolabs | E7335S; E7500S | |
Tapestation D1000 Screentape High sensitivity | Agilent Technologies | 5067- 5584 | |
Tapestation D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067- 5585 | |
2200 Tapestation - automated gel electrophoresis system | Agilent Technologies | G2965AA | |
Agencourt® AMPure® beads XP | Beckman Coulter | A63880 | |
Qubit™ dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | |
Qubit™ 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
Topo™ TA cloning Kit | Invitrogen | 450071 | |
Sequencing platform: MiSeq System | Illumina | ||
Experiment Manager (Sample sheet software) | Illumina | Note: Use TruSeq LT as a template | |
Miseq™ Reagent kit V3 (150 cycle) | Illumina | MS-102-3001 | |
Sequencing hub: Basespace | Illumina | https://basespace.illumina.com | |
Ligase A: Thermostable 5’ App DNA/RNA ligase | NEB | M0319S | Not used in this protocol, but tested in optimization process with results described in the discussion. |
Ligase B: T4 RNA ligase 1 | NEB | M0204 | Not used in this protocol, but tested in optimization process with results described in the discussion. |
Ligase C: CircLigase | Epicentre | CL4111K | Not used in this protocol, but tested in optimization process with results described in the discussion. |
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