마이크로 로르 나를 사용한 네이티브 단백 입자의 농축과 그에 따른 절대/상대 미세 유 변 함량 및 셀룰러 전송 속도의 후속 측정

요약

여기서, 정량적 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 기반 프로토콜은 지 단백질 입자의 천연 마이크로 RNA 함량 (절대/상대)의 결정을 위해 제시 된다. 또한, 마이크로 RNA 레벨을 증가 시키는 방법 뿐만 아니라, 지 단백질 입자의 세포 흡수 율을 결정 하는 방법이 입증 되어 있다.

초록

단백 입자 주로 지질과 혈 류에서 콜레스테롤의 전송기. 또한, 그들은 소량의 비 부호화 마이크로 로르 (miRNA) 가닥을 포함 합니다. 일반적으로, miRNA는 메신저 RNA (mRNA)와의 상호작용으로 인해 단백질 발현 프로필을 변경 한다. 따라서, 지 단백질 입자의 상대적이 고 절대적인 miRNA 함량의 지식은 세포 입자 흡수의 생물학적 효과를 추정 하는데 필수적 이다. 여기서, 정량적 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (qPCR) 기반 프로토콜은 지 단백질 입자의 절대적 miRNA 함량을 결정 하기 위해 제시 되 고-천연 및 miRNA 농축 된 단백질 입자에 대 한 것으로 예시 된다. 상대 miRNA 함량은 다 웰 미세 유체 어레이 카드를 사용 하 여 정량화 됩니다. 더욱이,이 프로토콜은 과학자 들이 세포 miRNA을 추정 하 고, 따라서, 지 단백질 입자 흡수 율을 추정할 수 있게 합니다. MiRNA와 인위적으로 로드 된 고밀도 지 단백질 (HDL) 입자를 사용할 때, 네이티브 HDL 입자와의 인큐베이션이 오히려 낮은 miRNA 콘텐츠로 인해 큰 영향을 미치지 않는 반면, 세포 miRNA 수준의 현저한 증가가 관찰 됩니다. 대조적으로, 저밀도 지 단백질 (LDL) 입자의 세포 흡수는 네이티브 miRNA도 인위적으로 로드 되지 않으며, 셀룰러 miRNA 수준을 변경 하지 않았습니다.

서문

단백 입자는 콜레스테롤 에스테 르 및 트리 글리세라이드 지방의 코어를 둘러싸는 양친 매 성 지질과 콜레스테롤의 단층으로 구성 됩니다. 입자의 생물학적 기능을 정의 하는 멤브레인 임베디드 apolipoproteins 전체 입자가 안정화 됩니다. 지 단백질 입자는 그들의 각각 증가 하는 조밀도에 따라 구별 될 수 있고, 따라서, 아주 저밀도 지 단백질 (IDL), LDL 및 HDL 입자와 같은 크기를 감소 시킵니다. 혈 류에서 불용 성 성분의 수송에도 불구 하 고, HDL 입자가 miRNA^1,2의 비 코딩 가닥을 수행 하는 것이 입증 되었습니다. 마이크로-rnas는 매우 짧은 (일반적으로 2 다스 뉴클레오티드) RNA 가닥으로 서,이로 인해 내 식 상보성 mRNA 가닥을 분해 하 고 특정 단백질의 발현 프로필을변경 합니다. ⁶. 더욱이, miRNA 프로 파일의 변경은 다양 한 질병에서 발견 되었으며, 따라서, 프로 파일은 진단과 예 후에 대 한 바이오 마커로 서 적용 가능 하다. 단백질 입자를 통해 세포 사이의 miRNAs의 세포 외 수송은 세포 간 mRNA 레벨 변조를 위한 추가 메커니즘으로 작용할 수 있다. 생물학적 효과를 정량적으로 추정 하기 위해, 지 단백질 입자의 절대적 및 상대적인 miRNA 함량에 관한 지식이 필요 하다.

정량적 실시간 PCR은 이러한 정보를 얻기에 적합 하 고 비교적 빠른 방법 이다. 따라서, 상대 정량 (RQ) 값은 계산 될 수 있고, 상이한 샘플과 지 단백질 분 획 간의 상대적인 차이는 추정 가능 합니다. 다 웰 미세 유체 어레이 카드는 샘플에서 miRNAs의 상대적인 존재 (RQ 값과 동일)를 결정 하는 빠르고 사용 하기 쉬운 방법입니다. 다 웰 미세 유체 어레이 카드는 미세 유체 장치에 내장 된 개별 qPCR 반응에 대해 96 또는 384 개별 반응 챔버로 구성 됩니다. 각 챔버에는 하나의 개별 miRNA에 필요한 가수분해 프로브 및 특정 qPCR 프라이 머가 포함 되어 있습니다. 표준화, 간단한 워크플로우 및 피 펫 팅 단계 수 감소로 인 한 짧은 처리 시간입니다. 또한 필요한 샘플 볼륨이 최소화 됩니다. 상대적인 정량화와는 대조적으로, 절대 miRNA 함량은 miRNA 가닥의 알려진 절대 수의 표준 곡선과 qPCR 샘플 결과의 비교를 필요로 한다. 상대적으로 낮은 miRNA 함량으로 인해 표준 및 또한 단일 분자 민감성 이미징 기술이 실현 가능 하지 않기 때문에 miRNA을 가진 지 단백질 입자의 인공 농축은 세포를 연구 하는 데 불가피 합니다. 단백 입자 상호 작용 및 miRNA 전송. 이와 관련 하 여, HDL 입자의 delipidation는 후속 성물 함⁷ 의 통합을 허용 하 고, 따라서, miRNA 가닥으로 농축. MiRNA를 가진 LDL 입자의 유사한 농축은 LDL 입자의 주요 성분 인 apoB-100 단백질의 소수 성으로 인해 실현 가능 하지 않습니다. 그러나, 지질 막에 침투할 수 있는 극성 용 매 디 메 틸 설 폭 사이드 (DMSO)를 첨가 함으로써, LDL 입자는 miRNA 가닥과 함께 인위적으로 로딩 될 수 있다.

고속 원자 힘 현미경 검사 법 (HS-AFM)은 서브 나노미터 공간 및 2 초 시간 분해능을 제공 하는 생물학적 표본의 특성화를 위한 강력한 도구입니다⁸. 따라서, 천연/재구성/라벨링 된 지 단백질 입자가 근 생리 적 환경 하에서 이미징 될 수 있으므로 변형 된 단백질 입자의 품질 관리를 위한 잘 적합 한 기술입니다.

여기서, qPCR 기반 프로토콜은 지 단백질 입자 및 세포 샘플의 절대적/상대적인 miRNA 함량을 결정 하기 위해 단계별로 제시 되며,이는 세포 단백질 입자 흡수 율의 추정을 가능 하 게 한다. 더욱이, miRNA와 함께 지 단백질 입자의 농축을 위한 방법이 입증 된다. 이 방법은 단백 콘텐츠의 일반적인 조작을 위해 적응 될 수 있고, 따라서, 약물 전달을 위한 표적으로 서 지 단백질 입자의 적용을 입증 한다.

프로토콜

혈액 기부금은 비엔나의과 대학 윤리 위원회에 의해 승인 되었습니다 (511/2007, EK-Nr. 1414/2016). 명명법은 정량적 실시간 PCR 실험 (MIQE)⁹ 지침의 공표를 위한 최소 정보에 따라 이다.

1. 인간 혈액에서 단백 입자 분리

1. Ultracentrifuge을 4°c로 냉각 시킵니다. 하룻밤 금식 후 건강 한 지원자 로부터 혈액을 채취 하십시오.
   참고: 일반적으로 3 명의 기증자, 각각 80 mL를 기부 하 고, ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)을 항 응고 제를 포함 하는 혈액 채취 튜브가 필요 합니다.
2. 2000 x g 에서 4 ° c에서 20 분간 원심 분리 하 고 혈장을 수확 (상); 전단 력을 피하십시오. 총 부피 V 를 결정 하 고 필요한 경우 인산 완충 식 염 수 (PBS)를 사용 하 여 원심 분리 튜브 부피의 배수를 조정 한다. 1 mL 3x의 질량을 측정 하 고 평균 밀도 ρ을 계산 합니다.
3. 다음의 수학식¹⁰ 을 사용 하 여 밀도 조절을 위한 칼륨 브롬 화물 (kbr)의 필요한 양을 계산 하 고 (그램/밀리 리터에서 원하는 밀도를 위해 = 1.019을 이용 하 고 kbr의 특정 부피에 대해서는 0.364 ml/g를 사용 하십시오). Kbr을 플라즈마에 넣고 부드럽게 저 어 서 KBr이 완전히 용 해 될 때까지 전단 력을 피하십시오.
   
4. 1.2 단계에서 설명한 바와 같이 밀도를 측정 하 고 필요한 경우 더 많은 KBr을 추가 하 여 다시 조정 합니다. 플라즈마로 초 원심 분리 적합 한 원심 분리기 튜브를 채우고 밀봉 하십시오. 기포를 피하십시오. 그렇지 않으면 튜브가 붕괴 될 수 있습니다. 제조업체의 지침에 따라 회전자에 튜브를 놓고 4°c에서 20 시간 동안 214000 x g 에 원심 분리기를 놓습니다.
5. 제조업체의 지침에 따라 튜브를 열고 VLDL 및 IDL을 포함 하는 상부 상을 버립니다. 총 부피 V 를 결정 하 고 필요한 경우, PBS를 사용 하 여 원심 분리 관 부피의 배수를 조정 한다.
6. 하단 분수의 밀도 ρ 을 결정 합니다. 밀도 조절을 위해 필요한 KBr의 양을 계산 합니다 (= 1.063 사용). KBr이 용 해 될 때까지 전단 력을 피하기 위해 부드럽게 저 어 주세요. 1.4 단계를 반복 합니다.
7. LDL 입자를 포함 하는 상부 상을 제거 하 고 수집 한다. 4°c에서 불활성 기체 분위기 하에서 LDL 입자 용액을 저장 한다. 총 부피 V 를 결정 하 고 필요한 경우, PBS를 사용 하 여 원심 분리 관 부피의 배수를 조정 한다. 1.2 단계에서 설명한 바와 같이 하단 분 율의 밀도 ρ 을 결정 한다.
8. 밀도 조정에 필요한 KBr의 양을 계산 하 고 (= 1.220 을 사용 하 여) 추가 합니다. KBr이 용 해 될 때까지 전단 력을 피하기 위해 부드럽게 저 어 주세요. 1.4 단계를 반복 합니다.
9. HDL 입자를 포함 하는 상부 상을 제거 하 고 수집 한다. 총 부피 V 를 결정 하 고 필요한 경우 PBS를 사용 하 여 원심 분리 튜브 부피의 배수를 조정 한다. 밀도 ρ를 결정 합니다. 4 ° c에서 20 시간 동안 214000 x g 의 상 측의 2 차 원심 분리 단계를 알 부 민을 제거 하는 것이 좋다. 필요한 경우 1.8 단계를 반복 합니다. HDL 입자를 포함 하는 상부 상을 제거 하 고 수집 한다.
10. 적어도 20l의 투 석 완충 액 (0.9% 염화 나트륨, 0.1 7.4%)을 4°c까지 준비 하 고 미리 냉각 시킨다. 사전 습식 투 석 관 (분자량 컷오프: 12 ~ 14 kDa) 및 제조업체의 지침에 따라 LDL 및 HDL 입자 용액을 추가 합니다. 4°c에서 5 L 투 석 완충 액을 Dialyze 후 1, 2 및 4 시간 후에 완충 액을 변경 한다.
11. 24 시간 후, 석 관 으로부터 지 단백질 입자 용액을 회수 하 고 브래드포드 어 세이 (¹¹ ) 또는 다른 적절 한 것을 사용 하 여 단백질 농도를 결정 한다. 4 ° c에서 불활성 가스 분위기 하에서 HDL 및 LDL 입자 용액을 저장 합니다.

2. 합성 miRNA

참고: RNA 올리고 뉴클레오티드를 취급할 때, RNase가 없는 작업을 하십시오. 신선 하 고 일회용 플라스틱 소모품 으로만 작업 하 고 항상 장갑을 착용 하 여 자주 변경 해야 합니다. 뉴 클레 아 제 없는 용액만을 사용 하십시오. 항상 얼음으로 작업 하십시오.

1. 제조 업체에서 획득 한 바이 알을 최대 힘으로 스핀 다운 하 여 동결 건조 된 합성 miRNA 펠 렛을 형성 한다. 최종 농도 10 µ m (재고 농도) miRNA에 적합 한 10 mM 트리 스 (hydroxymethyl) 아미노 메탄 (트리 스) 완충 7.5 액의 적정 부피를 첨가 한다.
2. 소생을 위해 몇 번 부드럽게 위아래로 피 펫 합니다. 멸 균 튜브에 각각 100 µ L을 준비 하십시오. 즉시 사용 하지 않을 경우-20°c에 보관 하십시오. 반복 해 동 및 동결을 피하십시오.

3. HDL 입자의 재구성

1. Delipidation
   1. 완충 액 A (150 mm 염화 나트륨 0.01, 10mm 트리 트리/HCl [pH 8.0])를 준비 한다. 원심 분리기를-10°c로 냉각 시킵니다. 에탄올의 혼합물의 100 mL의 프리 쿨: 디 에틸 에테르 (3:2)-20°c에서.
      주의: 매우 가연성이 고 피부에 유해한 데 디 에틸 에테르를 처리 하는 동안 적절 한 개인 보호 장비를 착용 하 고 연기 후드에서 작업 하십시오.
   2. 5 mg의 HDL 입자에 상응 하는 부피를 미리 냉각 된 에탄올 50 mL와 혼합 하 고: 디 에틸 에테르 (3:2) 혼합물을-20°c에서 2 시간 동안 배양 하였다. 2500 x g 에서 10 분 동안-10°c에서 원심 분리기.
   3. 상 등 액을 버리고, 미리 냉각 된 에탄올 50 mL로 펠 렛을 소생 시키고: 다이 에틸 에테르 혼합물을 vortexing 하 여,-20°c에서 2 시간 동안 배양 한다. 10°C에서 10 분 동안 2500 x g 에서 다시 원심 분리기.
      참고: 원할 경우, HDL 입자의 지질 분 율에서 miRNA 함량의 분석을 위해 상층 액을 동결 건조 한다.
   4. N2 가스 흐름 하에서 펠 릿을 건조 하 고 버퍼 A의 250 µ l에서 소생 시킵니다 (3.1.1 단계 참조). 브래드 퍼 드 단백질 분석 법 또는 다른 적절 한 것을 사용 하 여 단백질 농도를 결정 하 고 완충 액 A의 단백질 1 mg/250 µ L의 최종 농도로 희석 한다.
      참고: 여기서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. 용액을 불활성 기체 분위기 하에서 4°c에서 밤새 보관 한다.
2. 재구성
   1. 5.6 mg의 PC/m l의 농도로 클로로 포 름: 메탄올 2:1)의 혼합물을 사용 하 여 포스 파티 딜 콜린 (PC) 원 액을 제조 하였다. 마찬가지로, 콜 레스트 릴 올레 인산 (5mg/ml)의 스톡 용액과 콜레스테롤 (5mg/ml)을 준비 한다. 모든 솔루션을-20°c에 보관 하십시오.
   2. 깨끗 한 유리 튜브에 500 µ L의 PC, 100 µ의 CO 및 13.5 µ의 C를 섞는다. 이 부피는 100 PC의 대략적인 몰 비에 해당 한다: 22co: 4.8 c. 튜브를 회전 시키면서 N2 가스 흐름 하에서 혼합물을 건조 시켜 균질 한 표면 층을 얻었다.
      참고: 여기서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. -20°c의 불활성 기체 분위기 하에서 유리 바이 알 (원할 경우 비축이 가능)을 저장 한다.
   3. 완충 액에 신선한 30mm 스 페 광산 용액을 준비 합니다. 합성 2.2 miRNA의 1 개의 분 취 (100 µ l, 10µ m)을 혼합 하 여 100 µ l를 사용 하 여 30 ° c에서 30 분간 배양 한다.
      참고: 네거티브 컨트롤 실험의 경우, miRNA 및/또는 spermine 용액을 동일한 양의 버퍼 A로 교체 하십시오.
   4. 3.2.3 단계에서 PC/CO/C 마스터 혼합물을 혼합 하 여 녹 인 다.
   5. 버퍼 A에서 나트륨 deoxycholate의 30 mg/ml의 용액을 준비 하 고 3.2.4 단계에서 용액에 50 µ L을 추가 한다. 4°c에서 2 시간 동안 저 어 줍니다.
   6. 단계 3.1.4에서 delipidated HDL 솔루션의 250 µ L을 추가 합니다. 이 볼륨은 100 PC의 대략적인 몰 비에 해당: 22 CO: 4.8 c-1 delipidated HDL 단백질. 밤새 4°c에서 저 어 주세요.
3. 투 석
   1. 4°c에서 적어도 15l의 PBS를 미리 냉각 시킵니다. 50 g의 흡착 제 비드를 이중 증류수 (Ddh2o)의800 mL에 넣고 1 분간 저 어 주십시오. 15 분 정도 기다린 후 상층 액을 decant 하 고 PBS로 절차를 반복 하십시오.
   2. 전처리 투 석 카세트 (분자량 컷오프: 20kda) 또는 적절 한 투 석 관 및 제조업체의 지침에 따라 주사기를 사용 하 여 3.2.6 단계에서 솔루션을 추가 합니다.
   3. 3.3.1 단계에서의 흡착 제 비드를 추가 하 여 4°c에서 3 L의 PBS로 dialyze. 1 시간 및 2 시간 후에 버퍼와 비드를 변경 합니다.
   4. 24 시간 후에는 재구성 된 HDL (rHDL) 입자 용액을 회수 하 고 브래드포드 분석을 사용 하 여 단백질 농도를 확인 합니다. RHDL 입자 용액을 4°c의 불활성 기체 분위기 하에 보관 하십시오.

4. LDL 입자의 라벨링

1. 10 배 LDL 완충 액 (1.5 M 염화 나트륨 3mm EDTA 에틸렌 글리콜 비스 (β 아미노 에틸 에테르) 7.4 n을 제조 하 고 상 온에서 저장 하 여이를 보관 하 고 있습니다.
2. RNase가 없는 물에 신선한 30mm spermine 솔루션을 준비 하십시오. 합성 2.2 miRNA의 분 취 액 (100 µ l, 10µ m)을 혼합 하 여 100 µ l을 사용 하 여 30 ° c에서 30 분간 배양 하십시오.
   참고: 네거티브 컨트롤 실험의 경우, miRNA 및/또는 spermine 용액을 동일한 양의 1x LDL 버퍼로 교체 하십시오.
3. 4.2 단계의 miRNA/spermine 용액에 DMSO 100 µ L을 추가 하 고 1.2 mL의 1x LDL 완충 액으로 더 희석 하십시오.
4. 약 4 mg/mL의 최종 농도로 LDL 입자 용액을 PBS로 희석 하 고 50 µ L의 10 배 LDL 완충 액으로 450 µ L을 섞어 줍니다. 얼음 위에서 10 분간 배양 합니다.
5. 이전 단계의 LDL 입자 용액과 miRNA/spermine/DMSO 용액 (4.3 단계에서)을 결합 하 여 40 ° c에서 2 시간 동안 배양 하였다.
6. 3.3 항에 기재 된 바와 같이 투 석을 수행 하 고 그에 따라 표지 된 LDL 입자 용액을 저장 한다.

5. 재구성/표지 된 지질 입자의 품질 관리

참고: 품질 관리를 위해, 단백질 입자의 직경과 일반적인 모양은 예를 들어 AFM 또는 전자 현미경 (EM)을 사용 하 여 결정 될 수 있습니다. 여기서, HS-AFM은 천연/재구성/라벨링 된 지 단백질 입자의 크기 분포를 측정 하는 데 사용 됩니다.

1. HDL/LDL 입자 용액을 PBS (1:100~11000)에 희석 하 고 갓 절단 된 마이 카에 5 분간 배양 합니다. 운 모 (¹²)를 클 리 빙 하는 경우, 테이프를 벗으 면 서 기판에 접착 테이프를 누르고 상부 운 모 층을 제거 하십시오.
   참고: 특정 AFM 계기, 관측 영역 및 초기 입자 농도에 따라, 희석 인자는 개별 입자를 관찰 하도록 조정 되어야 한다.
2. 인큐베이션 후에, PBS로 샘플을 헹 구 고 캔틸레버 k_캔 트 ≪ 0.2 n/m의 스프링 상수를 갖는 태핑 모드에서 pbs와 두드리는 모드로 HS-AFM 이미징을 수행 합니다. 1 µm² < 스캔 크기를 사용 하 고 이미징 힘을 최대한 낮게 유지 하는 것이 좋습니다.
3. 적합 한 소프트웨어로 운 모 표면과 관련 하 여 이미지 된 입자의 높이를 결정 합니다.
   1. 데이터를 Gwyddion 온 (프리웨어)에 로드 하 고 곡물 분석 (임계 값으로 곡물 표시)을 통해 입자를 감지 하 고 기판 배경 위에 임계 값을 설정 하십시오. 이미지 병합 (다항식 배경 제거) 마스크 된 영역 제외 옵션을 선택 합니다.
   2. 감지 된 파티클의 높이 값을 내보내고 (다양 한 그레인 특성의 분포) 기록 된 모든 이미지에 대해 이러한 단계를 반복 합니다. 히스토그램을 생성 하거나 획득 한 입자 높이의 확률 밀도 함수를 계산 하 여 통계 분석을 수행 합니다.
4. 기본으로 재구성/레이블이 지정 된 지질 입자와 5.1 ~ 5.3 단계를 반복 하 고 얻어진 결과를 비교 하 여 입자 품질을 확인 합니다. 이물질 및/또는 대기업 관찰 하는 경우 샘플을 버립니다.

6. 세포 배양

1. Confluency 함에 도달할 때까지 확립 된 프로토콜 (예를 들어 ldlA7-SRBI¹³)에 따라 부착 세포를 성장 시키십시오.
   참고: 실험의 수에 따라 여러 개의 독립적 인 챔버 (권장 실험 설정 당 두 개의 챔버) 및 음성 제어 실험 (권장 하는 단백질 입자의 추가 없이 두 개의 챔버가 필요 합니다). 또한, 셀 번호의 결정을 위해 두 개의 챔버가 필요 합니다.
2. 미리 데워 진 행 크의 균형 잡힌 염 용액 (HBSS)을 사용 하 여 셀 3x를 부드럽게 세척 하 여 세포 잔해를 제거 하 고 적절 한 양의 무 혈 청 성장 배지로 세포 층을 덮으 십시오. 50 µ g/mL 지 단백질 입자의 최종 농도에 도달 하기 위해 적절 한 양의 지 단백질 입자 용액을 첨가 하십시오. 16 시간 동안 37 ° c에서 5% co2를 배양 합니다.
   참고: 실험 설계 및 세포 주에 따라, 배양 시간은 세포 miRNA 수준에서 충분 한 (즉, 측정 가능한) 증가를 달성 하도록 조정 되어야 한다.
3. 37 세포 잔해/지 단백질 입자를 제거 하 고 적절 한 양의 무 혈 청 배지로 세포 층을 덮으 십시오.
4. 6.3 단계에서 시료 부피의 세포 수를 계산 하기 위해 적어도 2 개의 독립 된 챔버에서 적절 한 방법 (예를 들어, 혈액 세포 측정기, 자동 세포 계수기)을 사용 하 여 세포 밀도를 결정 한다. 이 숫자는 정규화에 사용 됩니다.

7. 세포 및 단백 입자 샘플에서 miRNA 추출

주: 세포 로부터의 miRNA의 추출은 다음의 수정과 함께 miRNA 추출 키트를 사용 하 여 수행 된다.

1. 세포 샘플
   1. 원심 분리기를 4°c로 냉각 시켰다. 세포를 포함 하는 두 개의 챔버에 각각의 용 해 시 약 350 µ L을 추가 합니다. 음성 대조 실험으로 서, 세포 없이 챔버를 사용 한다.
      주의: 페 놀과 이세티 포함 된 용 균 시 약을 처리 하는 동안 적절 한 개인 보호 장비를 착용 하 고 연기 후드에서 작업 하십시오.
   2. 셀 분리에 대해 3 ~ 5 분 (셀 라인에 따라 다름)을 기다리십시오. 필요한 경우, 명시 야 현미경으로 세포 분리를 확인 하십시오. 1.5 mL 튜브에 두 챔버의 내용물을 풀.
   3. 20 G 바늘과 5Ml 주사기를 사용 하 여 시료를 5 ~ 10 배 더 균질 화/파괴 하 여 흡 인 및 3 분 동안 배양 합니다. 140 µ L을 클로로 포 름 (CHCl₃)에 넣고 15 초 동안 힘차게 흔들어 준 후 삼 분간 배양 합니다.
   4. 4 ° c에서 15 분 동안 12000 x g 에서 원심 분리기. 그런 후 원심 분리기 냉각을 중지 하십시오.
   5. 상부 수성 상을 새로운 1.5 mL 튜브로 이송 하는 단계; 단계 혼합/오염을 방지 상호 단계 DNA를 포함 하 고 낮은 단계는 단백질을 포함. 100% 에탄올 부피의 1.5 배를 추가 하 고 파이 펫 팅을 통해 철저히 섞어 줍니다.
   6. 2 mL 수집 튜브에 스핀 칼럼을 배치 하 고 단계 7.1.5에서 혼합물의 700 µ L을 추가 합니다. 실 온에서 15 초 동안 8000 x g 에서 원심 분리기. 플로우 쓰루를 버리고 잔류 샘플 체적으로이 단계를 반복 하십시오.
   7. 흐름을 무시 하 고 첫 번째 세척 버퍼의 700 µ L을 스핀 열에 추가 합니다. 실 온에서 15 초 동안 8000 x g 에서 원심 분리기.
   8. 흐름을 무시 하 고 두 번째 세척 버퍼의 500 µ L을 스핀 열에 추가 합니다. 실 온에서 15 초 동안 8000 x g 에서 원심 분리기. 이 전체 단계를 2 분간 원심 분리 시간으로 두 번 반복 하십시오.
   9. 스핀 칼럼을 새로운 2ml 수집 튜브에 넣고 1 분간 최대 속도로 원심 분리 하 여 멤브레인을 건조 시킵니다.
   10. 스핀 칼럼을 1.5 mL 컬렉션 튜브에 넣습니다. 용 출을 위해 멤브레인의 중앙에 30 µ L의 RNase가 없는 물을 첨가 하 고 1 분 동안 8000 x g 의 원심 분리기로 분리 합니다 .이 전체 단계를 제 1 흐름을 통해 용 리 용액으로 다시 한번 반복 한다. 역 전사 단계는 추출 직후에 이루어지며; 그렇지 않으면 추출 된 miRNA 샘플을-20°c에 보관 하십시오.
2. 단백 입자
   1. 가장 낮은 단백질 농도로 샘플의 부피를 100 µ (= 최대 샘플 부피)로 설정 합니다. 농도에 반비례 하 여이 정규화에 따라 다른 샘플의 샘플 부피를 계산 합니다. 음성 대조 실험의 경우, RNase가 없는 물 100 µ L을 사용 하십시오.
      참고: 정규화는 필요 하지 않지만 qPCR 단계 및 분석 중에 결과의 직접 비교를 단순화 합니다.
   2. 원심 분리기를 4°c로 냉각 시켰다. 단계 7.2.1의 샘플 부피에 700 µ L의 용 해 시 약을 추가 하십시오.
   3. 7.1.3-7.1.10 단계에 따라 miRNA 추출을 수행 합니다.

8. 역 전사

참고: miRNA의 역방향 전사는 다음과 같이 수정 된 역방향 전사 키트를 사용 하 여 수행 됩니다.

1. 키트 시 약 및 역방향 전사 프라이 머를 얼음에 해 동 한다. 얼음에 반응 튜브에 다음과 같은 마스터 믹스를 준비: 45.7의 RNase-프리의 µ L, 16.5 µ l의 역 전사 효소의 11 µ l, rnase 억제제의 2.1 µ l 및 dntp 혼합의 1.7 µ l. 부드럽게 섞으 세요, 소용돌이 하지 마십시오.
   주: 축척은 샘플 수량에 따라 다릅니다. 여기서, 10 반응에 대해 계산 된다.
2. 이에 따라 0.2 mL 튜브를 혼합 하 고 7.1.10 단계에서 추출 된 샘플의 5 µ L을 사용 하 여 8.1 단계에서 마스터 믹스의 7 µ L을 역방향 전사 프라이 머의 3 µ l에 섞어 주었다. 부드럽게 섞은 후, 잠시 원심 분리 하 고, 혼합물을 얼음에 보관 하십시오.
3. 각 세포 주에 대해 동일한 세포 번호를 사용 하기 위해, 더 높은 전체 세포 수를 갖는 세포 주에 대 한 샘플 부피를 감소 시킨다; 이것을 잔류 체적으로 사용 하 여 RNase가 없는 물의 5 µ L의 총 샘플 부피에 도달 합니다.
   주: 단백 입자 샘플은 단계 7.2.1에서 이미 정상화 되었습니다. 표준 곡선 준비를 위해 RNase가 없는 물에서 miRNA의 분 취를 순차적으로 희석 하 고 샘플 부피 당 가닥 수를 계산 합니다. 생성 된 샘플 정량 사이클 (cq) 값의 범위 내에서 적어도 5 개의 데이터포인트가 필요 하다. 일반적으로, 총 희석 요인은 10² 에서 10⁶ 에 이르기까지 적합 합니다.
4. 튜브를 써 모 시스템에 넣고 다음 프로그램을 시작 합니다: 16°c에서 30 분 (어 닐 링 단계) 85 ° c에서 30 분 (역 전사), 42에서 5 분 (용융 단계), 4°c에서 일시 정지. 역전사 직후의 qPCR 단계를 수행 하 고; 그렇지 않으면, miRNA 샘플 로부터 합성 된 상보성 DNA (cDNA)를-20°c에서 저장 한다.

9. qPCR

1. 다음과 같은 수정으로 상업적으로 입수 가능한 검정 ( 재료 표참조)을 이용 하 여 CDNA의 Qpcr (miRNA 로부터 전사)를 수행 한다.
2. 모든 시 약 (슈퍼 믹스, RNase가 없는 H2o), cDNA 샘플 (8.4 단계에서) 및 얼음에 대 한 프라이 머. Ice의 반응 튜브에 다음 마스터 믹스를 준비: 75 µ L의 슈퍼 믹스, 47.5의 RNase-프리의 µ L,7.56 µ l 프라이 머. 부드럽게 섞으 세요, 소용돌이 하지 마십시오.
   주: 축척은 샘플 수량에 따라 다릅니다. 여기서, 10 반응에 대해 계산 된다.
3. 0.2 mL 튜브에 라벨을 부착 하 고 cDNA 샘플의 2 µ L을 마스터 믹스의 13 µ L에 넣고 부드럽게 섞어 줍니다. 일반적으로 각 샘플 2x를 측정 합니다.
   참고: 적어도 두 개의 네거티브 컨트롤 샘플이 필요 합니다-샘플로 RNase 없는 물을 사용 합니다. 검 량 곡선이 샘플과 동일한 실행에서 결정 되지 않은 경우, 교정 곡선 측정의 한 샘플도 필요 합니다. 각 개별 실행을 동일한 반응 효율로 보정 하는 데 사용 됩니다.
4. PCR 기계에 튜브를 놓고 다음 프로그램을 시작 하십시오: 50 ° c에서 2 분, 95 ° c에서 10 분, 95 ° c에서 15 초 및 60 s에서 60 ° c. 프로그램의 마지막 두 단계를 최대 50 배까지 반복 합니다.
5. PCR 기계의 소프트웨어 패키지를 사용 하 여 c_q 값을 분석 하려면 dynamictube 정규화 (각 샘플 추적의 두 번째 미분을 사용 하 여 다양 한 배경 레벨의 보상) 및 노이즈 기울기를 활성화 합니다. 보정 (노이즈 레벨에 대 한 정규화).
   참고: 음수 컨트롤의 c_q 값은 가장 높은 샘플 c_q 값 보다 여러 사이클이 높아야 합니다.
   1. 보정 곡선 분석의 경우, 소프트웨어 패키지의 자동 찾기 임계값 기능을 사용 하 여 각 miRNA의 표준 곡선에서 개별적으로 각 miRNA 대 한 c_q 계산에 대 한 임계값을 결정 하 고이를 일정 하 게 유지 합니다. 각 특정 miRNA.
   2. 샘플 분석의 경우, 필요한 경우 검 량 곡선 샘플에서 데이터 포인트로 실행 되는 샘플의 다양 한 반응 효율을 보정 합니다. 이 소프트웨어는 각 교정 곡선 측정의 임계 수준에서 샘플의 c_q 값을 계산 합니다.

10. miRNA 콘텐츠 계산

1. 보정 곡선
   1. MiRNA 가닥의 초기 수 100 (10 µ m miRNA, 데이터 시트의 분자량) 및 후속 일련 희석 단계 (8.3 단계에서의 5 miRNA l 샘플 볼륨)에 대 한 샘플 부피의 µ 가닥 수를 계산 합니다.
      참고: 역방향 전사 효율 1을 가정 하면,이 수는 cDNA 가닥의 수와 동일 하다.
   2. 9.3 단계에서 2 µ L의 샘플 부피에서 cDNA 가닥의 수를 계산 한다. 7.5 8.4 단계에서의 추가적인 희석 율을 고려 하 여 9.4 단계 로부터 15 µ l 샘플 부피 로부터 2 µ의 샘플 부피를 측정 하였다.
   3. 9.5.1 semilogarithmic 플롯의 10.1.2 단계에서 계산 된 스트랜드 n_가닥 의 수를 기준으로 스텝에서 c_q 값을 플로팅하 고 데이터 포인트를 다음 회귀 곡선 (M = 선형의 기울기)에 맞춥니다. 회귀 곡선 B = 오프셋).
      
      라인에 대 한 상관 계수 (r2)가 > 0.99 인지 확인 합니다.
2. 단백 입자
   1. 측정 된 샘플 c_q 값 (단계 9.5.2)을 사용 하 여 샘플 부피 당 miRNA 가닥의 수를 계산 하 고 다음 방정식 (M 및 B 는 특정 miRNA의 캘리브레이션 곡선 파라미터)을 이용 한다.
      
   2. 단계 7.2.1 (100 µ L)의 부피에서 시작 하 여 시료 부피에서 지 단백질 입자의 상응 하는 수를 계산 하 고, 그의 공지 된 농도 및 후속 희석 단계 (100 µ에서 > 30 µ L 샘플 부피 > 7.1.10 L [희석 1:6] > 8.4 단계에서 15 µ l의 총 부피에서 시료를 9.4 단계에서 2 µ l [희석 17.5]). 250 kDa의 HDL 입자 및 3 개의 LDL 입자에 대 한 MDa 및 miRNA 추출 단계 동안 miRNA의 100% 회수 (분자량에 대 한 지질 기여를 무시 하 고 miRNA 가닥 수에 대 한 약간의과 대 평가를 산출 한다고 가정 합니다. 단백질 입자).
   3. 단계 10.2.1에서 miRNA 가닥의 수를 이전 단계에서 계산 된 입자 수로 나누어 miRNA 가닥 당 단백질 입자 수를 얻었다.
3. 셀
   1. 단계 10.2.1에 따라 샘플 부피 당 miRNA 가닥의 수를 계산 합니다.
   2. 단계 10.2.2에 따라 샘플 체적에서 상응 하는 개수의 셀을 계산 하 고, 6.4 단계에서 측정 된 초기 세포 수 농도를 시작 한다.
   3. 10.3.1에서 miRNA 가닥의 수를 이전 단계에서 계산한 셀 수로 나누어 셀 당 miRNA 가닥 수를 산출 합니다.
   4. MiRNA/입자 비율에 의해 음성 대조 실험 으로부터 얻어진 세포의 배경 miRNA 수준에 대 한 보정 후 이전 단계에서 miRNA 가닥의 총량을 분할 하 여 단백 입자의 흡수 율을 계산 한다 (단계 10.2.3 ) 및 인큐베이션 시간 (16h)은 6.2 단계 참조).

11. 다 웰 미세 유체 어레이

1. miRNA 추출
   1. 7 단계에서 설명한 바와 같이 miRNA 추출을 수행 합니다.
2. 역 전사
   1. 역방향 전사 용 프라이 머, 역 전사 키트 성분 및 MgCl 2(25mm)를 얼음 위에 해 동 한다. 8 개의 샘플에 대 한, µ의 역 전사 프라이 머의 2.25 µ l, dttp 100를 가진 dntps의 16.88 µ l, 50 역전사 µ의 역 전사 완충 액, 9.00 µ l의 mgcl 2의 10.12 µ l를 혼합 하 여 rnase 억제제 (20 U/µ l) , 뉴 클레 아 제 없는 물 1 µ L.
   2. 가볍게 섞어서 원심 분리기를 짧게 하십시오. 4.3 µ L을 추가 하 여 3.5 µ L의 역 전사 반응 믹스를 튜브에 넣고 혼합 하 고, 스핀 다운 하 고, 얼음을 5 분간 배양 합니다. 온도 조절기 기계에 튜브를 놓고 다음 프로그램을 시작 하십시오. 16 ° c에서 2 분 동안, 42 ° c에서 1 분 동안 및 50 ° c에서 1 초 동안 총 40x를 반복 하 고, 이어서 정지 반응으로 서, 85 ° c에서 5 분간 정지 하 고 정지할 때까지 4°c에서 유지 한다.
3. 전치 증폭
   1. 얼음에 프라이 머를 해 동 하 고 짧게 원심 분리기. 전치 증폭 마스터 믹스 (2 배)를 병에 소용돌이 세요. 8 개의 샘플에 대 한 다음의 지시에 따라 프리 증폭 반응 믹스를 준비 한다: 112.5 µ L의 프리 증폭 마스터 믹스 (2x), 22.5 µ L의 전치 증폭 프라이 머 및 뉴 클레 아 제가 없는 물의 67.5 µ L. 반전 및 원심 분리기를 짧게 합니다.
   2. 11.2.2 단계에서의 역방향 전사 반응 산물의 2.5 µ L을 혼합 하 여 이전 단계에서의 전치 증폭 반응 혼합을 22.5 µ와 반전 및 원심 분리기를 짧게 하였다. 얼음 위의 시료를 5 분간 배양 합니다.
   3. 열 경 화성 기에 튜브를 놓고 다음 설정에서 배양 합니다: 95 ° c에서 10 분 동안, 55에서 2 분 동안 어 닐 링 하 고, 72 ° c에서 변성로 2 분간 소 둔 하 고, 두 번 반복 하 여 1 ~ 4 분 동안에는 95 ° c에서 15 초 동안 고 어 닐 링/60 연장 합니다. , 효소 불 활성화를 99.9 ° c에서 10 분간, 4°c에서 4 ° c로 한다.
   4. 스핀 다운, 7.5 µ L (pH 8.0) 및 뉴 클레 아 제 없는 물, 반전 및 원심 분리기의 67.5 µ L을 추가 하십시오. 샘플은 최대 1 주일 동안-20°c에서 보관할 수 있습니다.
4. qPCR
   1. 마스터 믹스를 병에 소용돌이 세요. 1 개의 카드에 대 한 PCR 반응 혼합을 준비: 450 µ L의 마스터 믹스, 441 µ L의 뉴 클레 아 제가 없는 물 및 11.3.4 단계 로부터의 프리 증폭 샘플의 9 µ L. 반전 및 원심 분리기를 짧게 합니다.
   2. 제조 지침에 따라 준비 된 PCR 반응 혼합의 100 µ L을 사용 하 여 멀티 웰 미세 유체 배열 카드의 각 충전 저장소를 로드 하 고 3000 x g에서 1 분 동안 2 배를 원심 분리 합니다. 2 개의 연속적인 원심 분리 단계 동안 가속도는 카드를 적절 하 게 채우는 데 중요 합니다. 제조업체의 지침에 따라 카드를 밀봉 하십시오.
   3. 다음 프로그램으로 PCR 시스템을 사용 하 여: 95 ° c에서 10 분 동안 효소 활성화 후 40x를 반복 하 고 변성에서 15 초 동안 95 ° c에서 1 분 동안 60 ° c에서 소 둔/연장.
   4. PCR 시스템에서 결과 파일을 가져오고 다음 분석 설정으로 시스템의 소프트웨어 패키지를 사용 하 여 RQ 값을 계산 합니다. 최대 허용 되는 c_q 값 40.0, 계산에 포함 된 최대 c_q 값 및 이상치 중 복제 제외. Benjamini-호크 버그 잘못 된 검색 비율을 p값 조정 (가양성의 발생의 수정) 및 정규화 방법으로 전역정규화 (모든 샘플에 대 한 중앙값 임계값 사용)에 대 한 옵션으로 활성화 합니다. ¹⁵).

결과

단백 입자 분리의 일반적인 계획
도 1 은 순차 부유 초 원심 분리 (¹⁶)을 사용 하 여 전 혈에서 시작 되는 지 단백질 입자 분리의 일반적인 계획을 보여준다. 원한다 면, VLDL 및 IDL 입자와 같은 다른 단백 입자 분 획을이 프로토콜 중에 수확 할 수 있습니다. 고정 앵글 티타늄로 터는 폴 리 프로필 렌 퀵 씰 튜브와 결합 하 여 원심 분리 력을 견딜 수 있습니다. 관 붕괴를 방지 하기 위해, 튜브에 기포를 방지 하는 것이 중요 하다. 원심 분리는 단백질 분해를 최소화 하기 위해 4°c에서 수행 된다. 일반적으로 혈장 (기증자 당 60-80 mL)에서 시작 하 여 3 명의 자원 봉사자의 공동 헌 혈 기부를 1-3 mg/ml의 범위에서 농도별로 각각 3 mL의 LDL 및 HDL 입자 용액 부피의 수율을 기대할 수 있다. 혈액 기증에서 시작 하는 전체 절차는 7 일 정도 걸렸습니다.

그림 1: 단백 격리의 순서도. 진공 용기 튜브의 건강 한 지원자 로부터 혈액을 원심 분리 하 고 플라즈마 (상)를 수집 합니다. 그 밀도를 KBr을 사용 하 여 ρ = 1.019 g/mL로 조정한 후, 용액을 4°c에서 20 시간 동안 214000 x g 에서 원심 분리기. 하 부 분 획의 밀도를 KBr을 사용 하 여 ρ = 1.063 g/mL로 조정한 후, 4°c에서 20 시간 동안 214000 x g 에서 용액을 다시 원심 분리 한다. LDL 입자를 포함 하는 상부 분 획을 4°c에서 임시 저장 한다. KBr을 사용 하 여 ρ = 1.220 g/mL에 대 한 하 부 분 율의 밀도를 조정한 후, 용액을 4°c에서 20 시간 동안 214000 x g 에서 두 번 원심 분리기. HDL 입자를 포함 하는 상부 분 획을 수집 하 고, HDL 및 LDL 입자 용액을 모두 dialyze, 1, 2 및 4 시간 후에 완충 액을 교환 한다. 24 시간 후, 단백질 농도를 결정 하 고 4°c에서 불활성 기체 하에 샘플을 저장 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

HDL 입자의 재구성
HDL 입자의 재구성은 이전에 조나스⁷에 의해 발표 된 프로토콜에 따라 수행 되었다. 제 1 단계는 도 2a에 도시 된 바와 같이 HDL 입자의 delipidation이 고,이 어 지질 PC, CO 및 C를 사용 하 여 도 2b에 도시 된 바와 같이 (즉, 재구성)의 제 2 단계를 miRNA 및 spermine의 혼합물에 첨가 하였다. 우리는 미르-223이 높은 풍부 함을 나타내고 미르-155은 단백 입자¹⁷에서 드문 때문에 인간 성숙한 미르-223 및 미르-155을 선택 했다. 일반적으로 두 단계는 2 개의 순차적 일에 수행 됩니다. 재구성 하는 동안, 다른 친지 성 및/또는 양친 매 성 구성 요소를 원하는 대로 추가할 수 있습니다. PC, CO 및 C의 에탄올/디 에틸 에테르 및 메탄올/클로로 포 름 용 매의 완전 한 증발이 매우 중요 하였다. 마지막 단계- 도 2c에 도시 된 바와 같이-무료 지질/miRNA/세제 로부터 재구성 된 HDL 입자 (rhdl)를 분리 하는 투 석 절차가 있었다. 이것은 추가 1-2 일이 걸렸습니다. 투 석 용액에 흡수 성 비드를 첨가 하 여 투 석 막을 따라 밀도 구배를 일정 하 게 유지 시켰다. RHDL 입자의 50%의 수율을 기대할 수 있습니다.

그림 2: HDL 입자 재구성의 순서도. (A): HDL 입자 용액을 미리 냉각 된 에탄올/다이 에틸 에테르와 혼합 하 고-20°c에서 2 시간 동안 배양 한다. 상층 액을 버리고 나면, 펠 렛을 소생 하 고 절차를 반복 합니다. 상기 펠 렛을 N2 가스로 건조 하 고이를 완충 액 A에서 소생 시켰다. 농도의 결정 후, 4 ° c에서 불활성 가스 분위기 하에 delipidated HDL을 저장 합니다. (B) 재구성: 포스 파티 딜 콜린 (PC), 콜 레 스 콜 레이트 올레 에이트 및 콜레스테롤 (C)을 혼합 한 후 튜브를 회전 시키면서 n2 가스를 사용 하 여 용 매를 증발 시킵니다. MiRNA 액을 30 ° c에서 30 분 동안 정액으로 배양 하 고, deoxycholate 나트륨을 첨가 하 고 건조 된 지질 필름을 소생 시켰다. 4°c에서 2 시간 동안 시료를 교 반 하 고, delipidated HDL 용액을 첨가 하 고,이 시간은 불활성 기체 분위기 하에서 4°c에서 밤새 다시 저 어 주었다. (C) 투 석: 재구성 된 Hdl (rhdl) 입자가 포함 된 패널 B 로부터 투 석 막 챔버 (분자량 컷오프: 20kda)로 용액을 전달 하 고 4°c에서 PBS 및 흡수 비드에 대해 dialyze. 버퍼와 비드를 1 시간 및 2 시간 후에 교환 한다. 24 시간 후 rHDL 입자 용액을 회수 하 고, 농도를 확인 하 고, 4°c에서 불활성 기체 분위기 하에 시료를 저장 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

LDL 입자의 라벨링
HDL 입자에 대해 입증 된 miRNA (도 3)로 ldl 입자의 라벨링은 ldl 입자의 주성분 인 apob-100 단백질의 소수 성으로 인해 실현 가능 하지 않았다. DMSO는 LDL 입자의 지질 단층의 침투를 위해 사용 되었고, 따라서, miRNA 연결을 매개 하였다. 전체 절차는 100%에 가까운 수율로 1-2 일을 했다.

그림 3: LDL 입자 라벨링의 흐름도. 30°c에서 30 분 동안 miRNA 액을 spermine 용액으로 배양 하 고 DMSO 및 LDL 완충 액을 추가 합니다. Ldl 샘플 재치 LDL 완충 액을 얼음에 10 분간 배양 하 고 miRNA/spermine/DMSO 혼합물을 첨가 한다. 40 ° c에서 2 시간 동안 인큐베이션 한 후, 용액을 투 석 막 챔버 (분자량 컷오프: 20kda)로 이송 하 고 + 4°c에서 PBS 및 흡수 비드에 대해 dialyze. 교환 완충 액과 구슬 1 & 2 시간 후에 라벨링 된 LDL 입자 용액을 24 시간 후에 회수 하 고, + 4°c에서 불활성 기체 분위기 하에서 농도 및 저장을 결정 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

단백질 입자의 품질 관리
HS-AFM는 운 모에 있는 네이티브 및 재구성/표지 된 단백 입자의 크기 및 모양을 검토 하기 위하여 이용 될 수 있습니다. 사용 직전에, 운 모는 깨끗 하 고 평평한 표면을 제공 하기 위해 (접착 테이프를 사용 하 여 상부 층을 제거 하는) 새로 절단 해야 합니다. 운 모에 HDL/LDL 입자를 배양 할 때, 희석 계수 (및/또는 인큐베이션 시간)는 개별 입자를 관찰 하기 위해 조정 될 필요가 있다. 클러스터는 입자 치수의 결정을 허용 하지 않습니다. HDL 입자는 운 모에 이동 합니다. HS-AFM 대신에 종래의 AFM을 사용 하는 경우, 고 정화 프로토콜은 측면 입자 이동성을 감소 시키기 위해 (완충, 표면 코팅) 적절 하 게 적응 될 필요가 있다. 샘플을 스캔 하는 동안 입자의 변형을 방지 하기 위해 이미징 력이 낮게 유지 되어야 합니다 (태핑 모드) .이는 결과적으로 측정 된 값에 영향을 미칩니다. 데이터 분석을 위해, 입자는 임계 알고리즘 (예를 들어, Gwyddion 온에서 곡물 > 임계 값으로 표시)을 통해 검출 되었고, 그 높이는 마이 카 표면에 대하여 결정 되었다. 명백한 측면 치수가 끝 모양에 의해 확대 되므로 입자의 높이를 측정 하는 것이 입자 크기를 결정 하는 가장 정확한 방법입니다 ( 그림 4의 예시 이미지 참조). 입자 높이의 확률 밀도 함수 (pdf)는 다양 한 단백 입자의 통계적 평가 및 크기 분포의 비교를 위해 계산 되었다. 도 4 에 나타난 바와 같이 네이티브 및 miRNA 표시 된 ldl 입자의 비교는 가능 하 게 표지 된 및 비 표지 된 (즉, 네이티브) 지 단백질 입자 간의 주요한 유사성을 확인 합니다 (miRNA의 첨가 없이 ldl 입자로 표지 됨/ spermine 혼합물은 라벨링 절차 자체에 대 한 컨트롤로 표시 됩니다). 전체 절차는 약 1 일이 걸렸습니다.

그림 4: HS-AFM 측정의 순서도 및 대표적인 결과 PBS (1:10²-1:10³)에 HDL/LDL 입자 샘플을 희석 하 고 5 분 동안 갓 절단 된 마이 카에 배양 한 후 PBS로 조심 스럽게 헹 구 어 (정전기가 없는) 입자가 제거 됩니다. HS-AFM 이미징을 수행 하 고 표면의 입자 밀도를 확인 합니다. 실 온에서 PBS로 측정을 수행 합니다. 이 그림의 상위 이미지는 너무 높은 입자 밀도를 보여줍니다. 하단 이미지는 분석에 적합 합니다. 단일 입자의 높이는 임계 화 및 고유 (검정 곡선) 및 재구성/표지 된 (적색 및 녹색 곡선) 입자를 통계적 인 평가에서 비교 하 여 분석 하였다. 스케일 바 = 100 nm. 이 그림은 Axmann 외¹⁹에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

miRNA 추출, 역 전사 및 qPCR
천연/인위적으로 농축 된 단백질 또는 세포 샘플 로부터 miRNA의 추출은 도 5a에 도시 된 바와 같이 miRNA 추출 키트를 사용 하 여 수행 하였다. 이로써 RNase가 없는 환경은 매우 중요 했습니다. 이 단계는 약 1 시간 정도 걸렸습니다. 추출 된 miRNA 샘플의 역 전사 (도 5b)는 제조자에 의해 기술 된 바와 같은 표준 생화학 적 절차를 사용 하 여 수행 하였다. 이 단계는 약 1.5 h를 했다. 최종적으로, 마지막 단계 동안 얻어진 cDNA의 양은 qPCR을 이용 하 여 측정 하였다 (도 5c). 얻어진 c_q 값을 절대 miRNA 가닥 번호에 연관 시키는 표준 곡선은 초기 샘플의 절대 miRNA 컨텐츠를 산출 했습니다. 이것은 약 2.5 h를 했다.

도 5: miRNA 추출, 역 전사 및 qPCR의 흐름도. (A) miRNA 추출: 샘플을 용 해 시 약과 혼합 하 고 주사기를 사용 하 여 흡 인을 통해 분해 합니다. 5 분간 배양 하 고 CHCl₃을 추가 합니다. 15 초 동안 힘차게 흔들어 3 분간 배양 합니다. 1200 x g 에서 원심 분리 한 후 4°c에서 15 분 동안, 상부 상을 수집 하 고이를 에탄올과 혼합 한다. 용액을 스핀 칼럼 (최대 부피 < 700 µ L)으로 전송 하 고 15 초 동안 8000 x g 에서 원심 분리 합니다. 용 리 액을 버리고 나머지 용액으로 마지막 단계를 반복 하십시오. 첫 번째 세척 완충 액을 추가 하 고 15 초 동안 8000 x g 에서 원심 분리기를 첨가 합니다. 용 리 액을 버리고, 두 번째 세척 완충 액을 넣고, 15 초 동안 8000 x g 에서 원심 분리기를 추가 합니다. 마지막 단계를 2 분의 원심 분리 시간으로 반복 하십시오. 원심 분리를 통해 멤브레인을 최대 속도로 1 분 동안 더 건조 하 고, miRNA를 1분 동안 8만 x g 에서 원심 분리기를 사용 합니다. 추출 된 miRNA 샘플을-20°c에 보관 하십시오. (B) 역전사: 10 배 버퍼, H2o, dntp 혼합 억제제 및 얼음에 대 한 효소를 해 동 하 고 마스터 믹스를 준비 한다. 추출 된 miRNA를 패널 a 에서 마스터 믹스 및 역방향 전사 프라이 머에 추가 하 고 써 모 시스템을 사용 하 여 역 전사를 수행 한다. CDNA 샘플을-20°c에 보관 한다. (C) qpcr: 슈퍼 믹스를 동결 해제 하고 얼음에 프라이 머를 넣고 마스터 믹스를 준비 한다. CDNA를 패널 B 에서 마스터 믹스에 추가 하 고 qpcr을 수행 한다. 데이터를 분석 하 여 c_q 값을 가져오고 샘플의 절대 miRNA 내용을 계산 합니다 ( 그림 6 및 자세한 내용은 대표적인 결과 참조). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

절대 miRNA 콘텐츠 및 전송 속도
네이티브 및 인위적으로 농축 된 HDL 및 LDL 입자의 절대 miRNA 함량은 도 6에 도시 된 바와 같이 각각의 miRNA의 샘플 및 표준 곡선의 c_q 값 으로부터 계산 되었다. 도 6a 는 분석 소프트웨어에 의해 계산 된 데이터를 보여준다 (각각의 샘플 추적의 두 번째 미분을 사용 하 여 상이한 배경 레벨의 보상을 위한 활성화 된 dynamictube 정규화 ) 및 노이즈 슬로프 보정 [노이즈 레벨로 정규화]). 표준 곡선의 c_q 값은 qpcr 기계에 의해 측정 된 정규화 된 형광 신호에 대 한 소프트웨어 패키지의 자동 찾기 임계 함수를 사용 하 여 결정 하였다. 이로써, 소프트웨어는 표준 곡선의 적합성의 R-값을 최대화 하였다. 임계 수준은 각 특정 miRNA 샘플 분석에 대해 일정 하 게 유지 되었다. 이어서, miRNA 가닥 수의 함수로 서 c_q 값이 플롯 되 고 회귀 라인이 계산 되었다. 샘플 c_q 값은 도 6b에 도시 된 바와 같은 임계 수준으로 결정 되었다; 상이한 qPCR 실행 들 간의 반응 효율 차이는 각 런에 포함 된 하나의 추가 검 량 곡선 샘플을 사용 하 여 소프트웨어에 의해 자동적으로 보상 되었다. 회귀 선 방정식을 사용 하 여 샘플에서 알 수 없는 양의 miRNA를 계산할 수 있습니다. 상기 단백 입자 수는 초기 단백질 농도 및 그것의 평균 분자량 (MW_HDL ~ 250 kDa) 으로부터 추정 되었다. 이를 통해, 분자량에 대 한 지질 기여는 없다고 가정 하였다-따라서, 지 단백질 입자 당 miRNA 가닥의 수는 약간과 대 평가 되었다. 더욱이, miRNA 추출 단계 동안 miRNA의 100% 회수율을 가정 하였다. 더욱이, HDL 입자로 인큐베이션 전후의 세포의 miRNA 함량을 측정 하였으며, 도 6c에 도시 된 바와 같이 miRNA 전송률을 계산 하였다.

그림 6: 절대 miRNA 콘텐츠 및 전송 속도 계산 순서도. (A) 미르-155에 대 한 표준 곡선: mir-155 분 취 액 (100 µ, 10µ m)은 지시 된 바와 같이 RNA 없는 물로 순차적으로 희석 하였다. qPCR은 소프트웨어 패키지의 자동 찾기 임계값 기능을 사용 하 여 각 시리얼 희석 샘플에 대 한 c_q 값 (2 회 측정)을 산출 했습니다. 음의 대조 실험 (miRNA의 추가 없이)은 > 35의 c_q 값을 산출 했다. 샘플 부피 당 miRNA 가닥 수의 함수로 서의 c_q 값의 데이터 포인트 (초기 농도 및 시리얼 희석 으로부터 계산)는 제시 된 방정식 (적색 선, 우측 이미지)에 끼워 지 며 M =-3.36을 산출 하 고 B = 42.12. 결정 된 PCR 효율은 0.98 이었다. 오차 막대는 실험적 반복의 결과 로부터 계산 되었고, 데이터 포인트 원의 직경 보다 작다. (B) c_q /인위적으로 농축 된 HDL 입자의 값은 패널 A 에서 결정 된 것과 동일한 임계 수준으로 결정 되 고 Qpcr 샘플 부피에서의 miRNA 가닥의 수로 변환 되었다. 원본 시료의 miRNA의 절대 비율은 시료 부피 (3.2 입자)에서 HDL 입자의 수 (농도) 로부터 계산 하였다. (C) 세포 샘플 (세포 선 ldlA7)을 인위적으로 농축 된 HDL 입자 (50 µ/g)와 함께 16 시간 동안 인큐베이션 하 고 유사 하 게 분석 하였다. 결정 된_cq 값은 세포에 대해서만 22.5, 22.5 및 19.3이 고, 세포에 대해서는 네이티브 hdl로 배양 되거나 rhdl 입자 용액 (모두 50 µ/g)으로 인큐베이션 된 세포에 대해 각각. 이러한 값은 패널 B에서 수행 되는 miRNA 가닥 수로 변환 되었습니다. 인큐베이션 후에 miRNA 가닥의 수 (7.3 x 106)는 인큐베이션 전 miRNA 가닥의 수를 감산 하 여 보정 하였다 (8.6 x¹⁰⁵). 그 결과는 시료 부피 (3100)의 세포 수, miRNA의 입자 비 (1.5 x 104) 및 인큐베이션 기간 (16시간)으로 나누어진다. 이것은 miRNA 통풍 관 (세포 및 초 당 240 HDL 입자 흡수 이벤트)을 통해 단백 입자의 전송 속도를 산출 했습니다. 이 그림은 Axmann 외¹⁹에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

멀티 웰 미세 유체 어레이
MiRNA 추출의 작은 수율로 인해, 추출 된 miRNA의 역 전사는 전치 증폭 단계를 따른다. 마지막으로, 도 6에 도시 된 바와 같이, qpcr이 수행 되었다. 모든 단계에 대 한, 표준 생화학 절차는 제조 업체에 의해 설명 된 대로 사용 되었습니다. 여기서, 대 식 세포 (¹⁸ ) 로부터 콜레스테롤 불렀습니다에 대 한 CRF의 영향에 대 한 연구를 위해 모집 된 요 독 환자의 HDL 입자에 대 한 글로벌 miRNA 프로 파일의 일부가 도시 되어 있다. 이 연구에서, 콜레스테롤 수용 체 HDL 또는 혈 청에서-다른 사람 외에 — 17 젊은 성인 요 독 환자 (CKD 단계 3-5) 및 14 젊은 성인 혈액 투 석 환자 관련 된 질병 및 일치 하는 통제 없이 측정 하였다. 데이터를 분석 하기 위해 기본 설정이 사용 되었습니다 (최대 CT 값: 40.0, 계산에서 최대 CT 값을 포함 하 고 복제 간에 이상치 제외). P값은 Benjamini berg의 거짓 발견 율 (거짓 긍정의 발생에 대 한 정정)을 이용 하 여 조정 하였으며, 정규화 방법으로 서 글로벌 정상화 를 선택 하 여 모든 중에서 일반적인 분석 법을 찾는다. 중앙값을 사용 하 여 정규화 를 위해 샘플을 추출 합니다. 대표적인 결과에서, 요 독 환자의 HDLs 로부터 분리 된 miRNAs의 일부 RQs가 묘사 된다 (제어의 RQs는 1). 명백 하 게, miR-122 및 miR-224은 요 독 환자의 HDLs에서 높게 발현 된다. 이 전체 단계는 약 1 일이 걸렸습니다.

그림 7: 멀티 웰 미세 유체 어레이의 순서도 및 대표적인 결과. 도 5a에 도시 된 바와 같이 miRNA 추출 후, miRNA 샘플을 역방향 전사 프라이 머와 10 배 완충 액, H2o,Dntp 혼합 억제제, mgcl₂및 효소를 포함 하는 마스터 믹스와 혼합 한다. 5 분간 얼음에 인큐베이션 한 후, 써 모 제를 사용 하 여 역 전사를 수행 한다. 프리 증폭 마스터 믹스를 추가 하 고, 얼음에서 5 분간 배양 한 후, 써 모 제 시스템을 사용 하 여 전치 증폭을 수행 합니다. 0.1xte (pH 8.0)를 추가 하 고 매 취를 PCR 마스터 믹스와 H2o를 혼합 한 후 pcr 반응 혼합을 다 웰 미세 유체 어레이의 충전 포트에 넣고 1 분 동안 3000 x g 에서 2 회 회전 시킵니다. PCR 시스템을 이용 하 여 qPCR을 수행 하 고 데이터를 분석 하 여 RQ 값을 산출 한다 (여기서, 건강 한 대조 군¹⁸에 비해 요 독 증 환자의 HDL 입자의 RQ 값을 보여준다).  이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

토론

여기서, 인간 혈액 으로부터 지 단백질 입자 분 획의 분리 및 그들의 개별적인 miRNA 함량의 결정은 단계별로 설명 된다. 분리 되 고 합성 된 miRNA를 처리 하는 동안 RNase가 없는 환경에서 작업 하는 것이 중요 합니다-입자-임베디드 miRNA는 분명히 효소 분해 로부터 보호 됩니다. 네이티브 지 단백질 입자의 miRNA/입자 비율이 다소 낮기 때문에, miRNA를 사용한 인공 농축은 세포의 홀로 입자 흡수를 연구 하는 데 필요 합니다. 따라서, 앞서 설명한 바와 같이 HDL 입자의 재구성 은 miRNA 가닥을 통합 하도록 변형 된다. 추가적으로,이 절차 도중 지질과 단백질 분 율의 별거는 과학자가 지 단백질 입자¹⁹의 지질 및 단백질 관련 성분을 검사할 것을 허용 합니다. 유사한 방법으로, LDL 입자의 라벨링 절차가 적응 된다. 흥미롭게도, miRNA의 자연 안정제 인 spermine을 첨가 하면 입자 비율에 영향을 미치지 않습니다. 원칙적으로,이 방법은 단백질 입자 내에서 miRNA 보다 다른 물질의 인 폴딩을 허용 한다는 점에 유의 해야 합니다. 물론 전체 크기의 HDL (지름: 5-12 nm) 및 LDL 입자 (직경: 18-25 nm)에 기초한 물질의 물리적 크기에 대해서는 한계가 있다.

재구성/라벨링 된 지 단백질 입자의 품질 관리와 관련 하 여, HS-AFM은 단일 입자 수준에서 HDL/LDL 입자를 특성화 하는 적용 가능한 방법입니다. EM에 비해, 그것은 짧은 준비 시간 및 가까운 생리 적 조건 (습식, 실 온)을 허용 한다.

고유 한 감도와 증폭으로 인해 qPCR은 낮은 miRNA 농도를 감지 하는 방법입니다. 양자 택일로, 개별 분자 조차 검출할 수 있는 단 하나 분자 과민 한 형광 현미경 검사 법은, 예를 들면, 입자 당 형광 표지 된 miRNA 가닥의 낮은 사격 량 때문에 적당 하지 않을 것입니다. 따라서, 네이티브 지 단백질 입자 당 miRNA 가닥의 비율은 10^-8이 되는 것으로 밝혀졌다. 인공 농축은 세포 단백 흡수 율의 추정을 용이 하 게 하는 1만의 비율로 비율을 증가 시킵니다 (네이티브 지 단백질 입자 ¹⁹를 사용 하 여 유의 한 차이가 검출 되지 않음). QPCR의 높은 감도는 인큐베이션 시간 및 miRNA/입자 비율 후에 miRNA 가닥의 수를 측정 하 여이 흡수 율을 결정할 수 있게 합니다. 계산 된 값은 세포 분해 및 miRNA의 방출을 무시 하 고, 따라서, 지 단백질 입자 흡수 율에 대 한 적어도 낮은 제한을 나타낸다.

앞으로,이 방법은 세포에서 제약 물질 (특히 친 유성 것 들)을 전달 하 고 세포내 농도에 대 한 그들의 생물학적 효과를 상관 (지 단백질 입자의 흡수 율을 통해 결정) 하도록 조정 될 수 있다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ultracentrifuge	Beckman	Optima L-100 XP	Lipoprotein isolation
Ultracentrifuge rotor	Beckman	TI 55.2	Lipoprotein isolation
Vacutainer (EDTA)	Becton Dickinson	366643	Lipoprotein isolation
Kaliumbromid	Sigma Aldrich	2110	Lipoprotein isolation
Ultracentrifuge tubes	Beckman	342414	Lipoprotein isolation
Ultracentrifuge tube sealer	Beckman	342428	Lipoprotein isolation
Sodiumchlorid	Carl Roth GmbH	P029.2	Lipoprotein isolation
EDTA	Fisher Scientific	D/0650/50	Lipoprotein isolation
Dialysis tubes, MWCO 12 - 14k	Spectra	132700	Lipoprotein isolation
synthetic miRNA	microSynth	-	synthetic miRNA
TRIS buffer pH 7	Ambion	AM9850G	synthetic miRNA
TRIS buffer pH 8	Ambion	AM9855G	synthetic miRNA
sterile tubes	Carl Roth GmbH	ENE8.1	synthetic miRNA
Photometer	Eppendorf	Eppendorf Biophotometer	Bradford assay
Cuvette	Carl Roth GmbH	XK20	Bradford assay
Coomassie G-250 Stain	BioRad GmbH	161-0786	Bradford assay
Sodiumchlorid	Carl Roth GmbH	3957.1	Delipitation
EDTA	Fluka Analytical	03690-100ML	Delipitation
TRIS buffer pH 8.0	Ambion	AM9855G	Delipitation
Ethanol 100%	AustrAlco	Ethanol Absolut 99.9%	Delipitation
Diethyl ether	Carl Roth GmbH	3942.1	Delipitation
Centrifuge	Thermo Scientific	Multifuge X3R	Delipitation
Chloroform	Carl Roth GmbH	3313.1	Reconstitution
Methanol	Carl Roth GmbH	4627.1	Reconstitution
Phosphatidylcholine	Sigma Aldrich GmbH	P3556-25mg	Reconstitution
Cholesterol oleate	Sigma Aldrich GmbH	C-9253-250mg	Reconstitution
cholesterol	Sigma Aldrich GmbH	C8667-500mg	Reconstitution
glass tubes	Carl Roth GmbH	K226.1	Reconstitution
spermine	Sigma Aldrich GmbH	S3256-1G	Reconstitution
Thermomixer	Eppendorf	Thermomixer comfort	Reconstitution
Sodium deoxycholate	Sigma Aldrich GmbH	3097-25G	Reconstitution
Magnetic stir bar	Carl Roth GmbH	0955.2	Reconstitution
100µL micropipettes	Carl Roth GmbH	A762.1	Reconstitution
PBS	Carl Roth GmbH	9143.2	Dialysis
Amberlite XAD-2 beads	Sigma Aldrich GmbH	10357	Dialysis
Slide-A-Lyzer casette (cut-off 20 kDa)	Thermo Scientific	66003	Dialysis
Syringe	Braun	9161406V	Dialysis
Syringe needle	Braun	465 76 83	Dialysis
EGTA	Carl Roth GmbH	3054.2	Labeling of LDL particles
DMSO	life technologies	D12345	Labeling of LDL particles
Atomic Force Microscope	RIBM	SS-NEX	Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles
Muscovite Mica (V-1 Grade)	Christine Gröpl	G250-1/V1	Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles
AFM Cantilever	Nanoworld	USC-F1.2-k0.15	Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles
Gwyddion 2.49	Czech Metrology Institute	http://gwyddion.net	Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles
Chamber slides, Nunc Lab-Tek	VWR	734-2122	Cell culture
HBSS	Carl Roth GmbH	9117.1	Cell culture
Cell counter	Omni Life Science GmbH	Casy	Cell culture
miRNeasy Mini Kit	QIAGEN	217004	miRNA extraction
Centrifuge	Eppendorf	5415R	miRNA extraction
20G needle	Braun	Sterican 465 75 19	miRNA extraction
5ml syringe	Becton Dickinson	309050	miRNA extraction
PCR cabinet	Esco	PCR-3A1	Reverse Transcription
TaqMan Reverse Transcription Kit	Thermo Scientific	4366596	Reverse Transcription
Rnase-free water	Carl Roth GmbH	T143	Reverse Transcription
0.2 ml tubes	Brand	781305	Reverse Transcription
Centrifuge	Carl Roth GmbH	Microcentrifuge AL	Reverse Transcription
Thermocycler	Sensoquest	Labcycler	Reverse Transcription
TaqMan Primer	Thermo Scientific	-	qPCR
iTaq Universal probe supermix	BioRad GmbH	1725131	qPCR
PCR machine	Corbett	Rotor-Gene RG-6000	qPCR
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystems	4366596	TaqMan Array
Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1	Applied Biosystems	4399966	TaqMan Array
TaqMan PreAmp Master Mix	Applied Biosystems	4391128	TaqMan Array
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1	Applied Biosystems	4399933	TaqMan Array
TaqMan Universal Master Mix II, no UNG	Applied Biosystems	4440040	TaqMan Array
TaqMan Advanced miRNA Human A Cards	Applied Biosystems	A31805	TaqMan Array
Nuclease-free water	Thermo Scientific	R0581	TaqMan Array
MgCl2 (25mM)	Thermo Scientific	R0971	TaqMan Array
TE, pH 8.0	Invitrogen	AM9849	TaqMan Array
7900HT Fast Real-Time PCR System	Applied Biosystems	4351405	TaqMan Array
TaqMan Array Card Sealer	Applied Biosystems	-	TaqMan Array