감지 응용 을 위한 무기 구조물의 DNA 종이접기 중재기 나노patterning

요약

여기서, 우리는 DNA 종이 접기 모양을 안내 템플릿으로 사용하여 기판에 이산적이고 정확한 무기 나노 구조를 만드는 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 투명 기판 (사파이어)에 플라스모닉 골드 나비 넥타이 모양의 안테나를 만들어 입증된다.

초록

구조 DNA 나노 기술은 DNA를 건축 자재로 사용하여 상향식에서 건물을 위한 실행 가능한 경로를 제공합니다. 가장 일반적인 DNA 나노 제조 기술은 DNA 종이 접기라고하며, 나노 미터 수준의 정밀도로 정확하고 다재 다능 한 구조의 높은 처리량 합성을 허용합니다. 여기서, DNA 종이접기의 공간 정보가 상향식 DNA 종이접기를 종래 에 사용되는 하향식 리소그래피 접근법과 결합하여 금속 나노 구조로 전달될 수 있는 방법을 보여준다. 이를 통해 선택된 기판에 한 단계 의 작은 나노 구조를 제조할 수 있습니다. 이 방법은 나비 DNA 종이 접기를 사용하여 실리콘 질화물 또는 사파이어 기판에 금속 나비 넥타이 모양의 안테나 구조를 만드는 것으로 입증되었습니다. 이 방법은 종이 접기 증착 기판 위에 실리콘 산화물 층의 선택적 성장에 의존, 따라서 다음과 석판 화 단계를위한 패터닝 마스크의 결과. 이러한 나노 구조 장착 표면은 분자 센서 (예를 들어, 표면 강화 라만 분광법 (SERS)) 및 작은 특징 크기 (sub-10 nm)로 인해 가시 파장 범위에서 다양한 다른 광학 응용 분야에서 더 사용할 수 있습니다. 이 기술은 방법론적 수정을 통해 다른 재료로 확장 될 수있다; 따라서, 생성된 광학 활성 표면은 메타물질 및 메타표면의 개발에 이용될 수 있다.

서문

구조DNA 나노기술은 최근 10년동안 급속히 진화해^왔으며,이 분야에서 가장 영향력 있는 발전은 틀림없이 DNA 종이접기^3,4의발명이었다. DNA 종이 접기 기술은 정확한 구조 적 특징^3,4와거의 모든 나노 모양의 제조를 할 수 있습니다. 이 강력한 방법은 탄소 나노 튜브^5,금속 나노 입자^6,7,8과같은 다른 나노 물체의 (sub)나노 미터 정밀 공간 배열 및 앵커링에 사용할 수^{있습니다. 9,}효소/단백질^{10,11,12, 13및} 치료 재료^14,15,16,17 . 중요한 것은, 이러한 구조는 단지 정적 이 아니라, 그들은 또한 동적 방식으로 작동하도록 프로그래밍 할 수 있습니다^18,19. DNA 종이 접기의 수많은 응용 프로그램은 약물^{전달20,21,22에서} 분자 전자 / plasmonics^{5,23,24, 25} 및 재료 과학^26,27에서 새로운 이미징 및 교정 기술^28.

위에서 언급 한 응용 프로그램 외에도 DNA 종이 접기 모양의 극단적 인 공간 해상도는 나노 패턴 및 섬세한 나노 스케일 리소그래피^29,30에서활용 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 DNA 종이 접기 템플릿을 사용하여 기판에 이산적이고 정확한 무기 나노 구조를 만드는 리소그래피 방법을 설명합니다. 이러한 템플릿은 다양한 형상 및 대량^31로효율적으로 생산될 수 있으며,^32개의대규모 스케일에서 선택된 기판에 손쉽게 증착될 수 있다. 이러한 특성은 일반적으로 사용되지만 오히려 느린 전자 빔 리소그래피 또는 다른 스캐닝 기반 나노 제조 기술과 는 반대로 한 단계에서 수십억 개의 나노 구조를 매우 병렬로 제작 할 수 있습니다.

본 명세서에서, 제조 공정은 질화 실리콘 및 사파이어 기판에 금 나비타이 모양의 구조를 만들어 입증된다; 즉, DNA 종이 접기의 공간 정보는 완전히 금속 나노 구조로 전송됩니다. 여기서 논의된 바와 같이, 이 기술은 선택된 나비타이 DNA 종이접기 구조에 한정되지 않으며, 이 방법은 사실상 모든 DNA 종이접기 형상의 사용을 가능하게 하기 때문에. 더욱이, 체계적인 변형을 통해, 이 기술은^{메타표면(33)의}제조를 향한 길을 포장하는 상이한 금속 및 기판으로 확장될 수 있다.

DNA 종이 접기 매개 제조로 패턴화 된 표면은 다목적 센서로 작용할 수 있습니다. 예를 들어, 표면 강화 라만 분광법 (SERS)에 사용할 수 있습니다. 개별 나노 셰이프의 작은 치수의 결과로, 생성 된 표면은 가시 파장 범위에서 광학 및 플라스모닉 응용 프로그램에서 사용을 찾을 수 있습니다.

프로토콜

1. DNA 종이 접기의 디자인

참고: 이 프로토콜에서, 나노패터닝 과정은 2차원(2D) 나비타이 DNA 종이접기 구조를 사용하여 설명된다(도1)^34. 새로운 DNA 종이 접기 모양을 디자인하려면 아래 지침을 따르십시오.

1. caDNAno^35를사용하여 DNA 종이 접기의 원하는 모양과 필요한 스테이플 가닥 서열을 디자인합니다. 플랫, 단일 레이어 종이 접기를 생산하려면 caDNAno의 사각형 격자 옵션을 사용하여 설계의 일부 베이스를 건너뛰고 크로스 오버 간격을 수동으로 조정합니다(그림 1 및 보조 caDNAno 파일 참조)을 사용하여 구조적 비틀기를 제거합니다. 정사각형 격자 포장^36,37에서.
2. 폴리-T (8 nt) 오버행을 포함하는 가닥으로 각 DNA 나선의 끝을 확장; 이렇게 하면 무딘 끝 베이스 스태킹 상호작용(그림 1 및 보조 caDNAno 파일)을 통해 개체의 다중 화를 방지할 수 있습니다.
3. 설계의 계산 분석을 실행합니다. CanDo^38,39는 DNA 종이접기의 3차원(3D) 형상 및 구조적 강성을 예측하는데 사용될 수 있다. CanDo는 비틀기 보정에 필요한 기본 건너뛰기 수를 반복하고 그에 따라 설계를 조정하는 데 유용한 도구이기도 합니다.
4. caDNAno에서 선호하는 스캐폴드 길이를 선택하고 구조를 접는 데 필요한 스테이플 가닥을 생성합니다. 나비 넥타이 구조의 경우, 7249 nt 긴 M13mp18 스캐폴드와 205 개의 독특한 스테이플 가닥이 사용됩니다 (보조 caDNAno 파일 참조).
   참고 : DNA 종이 접기 구조^{40,41,42,43을}설계하는 데 사용할 수있는 다른 계산 도구도 있습니다. 선택한 도구 /소프트웨어에 따라 다른 시뮬레이션 도구도^43,44를사용할 수 있습니다.

2. DNA 종이 접기의 조립

1. 나비 넥타이 구조 (총 205 스테이플)에 필요한 모든 올리고 뉴클레오티드의 동일한 양을 혼합하여 스테이플 가닥의 주식을 확인^34. 올리고뉴클레오티드는 모두 동일한 초기 농도를 가져야 한다(예를 들어, RNase 자유물에서 100 μM).
2. M13mp18 스캐폴드 가닥(p7249형, 100 nM)의 20 μL을 혼합하여 0.2 mL PCR 튜브에 100 μL 수량으로 DNA 종이 접기 접이식 반응 혼합물을 준비, 각 가닥이 500 nM에 있는 스테이플 스톡 솔루션의 40 μL(100nM에서) 스캐폴드)와 40 μL의 2.5배 접이식 버퍼(FOB)를 FOB는 트리스 - 아세트산 - 에틸렌디아미네테트라 아세트산 (EDTA) 완충제 (TAE) MgCl_2로보충됩니다. FOB 성분 농도는 표 1을 참조하십시오.
3. 90°C 에서 27°C까지의 열사이클러에서 반응 혼합물을 어닐린. 표 2에 제시된 열 접이식 램프를 사용하십시오.

3. DNA 종이 접기의 정화

참고 : 스테이플 가닥의 과잉 양은 비 파괴 폴리 (에틸렌 글리콜) (PEG) 정제 방법을 사용하여 DNA 종이 접기 용액에서 제거 할 수 있습니다. 프로토콜은 Stahl et al.^45에서적응됩니다.

1. 조립된 DNA 종이접기 구조의 200 μL을 1x FOB의 600 μL로 희석(표 1참조)하여 800 μL의 시작 부피를 얻었다.
2. 희석된 DNA 종이접기 용액을 1:1과 800 μL의 PEG 침전 완충액(15% PEG 8000(w/v), 1x TAE, 505 mM NaCl)과 혼합하고 앞뒤로 파이펫팅하여 철저히 섞습니다.
3. 14,000 x g 및 실온에서 30 분 동안 혼합물을 원심 분리합니다.
4. 조심스럽게 파이펫을 사용하여 상급을 제거합니다.
5. 1x FOB 200 μL을 넣고 파이펫팅으로 부드럽게 섞습니다. 원하는 DNA 종이 접기 농도를 얻기 위해 1x FOB의 상이한 양을 첨가할 수도 있다.
6. DNA 종이 접기 구조 (튜브의 바닥에있는 작은 투명 펠릿)를 재용해하려면 PEG 정제 DNA 종이 접기 구조를 실온에서 밤새 배양하십시오.
7. UV/Vis 분광광도계를 사용하여 260 nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 PEG 정제 후 DNA 종이 접기 농도를 추정하였다. 맥주 램버트 법칙과 1.1∙10⁸ M^-1 cm^-1의 소멸 계수를 계산^6에사용한다. PEG 정제 후 전형적인 DNA 종이 접기 농도는 15-20 nM이다.
8. PEG 정제 DNA 종이 접기 구조를 4°C에 저장합니다. DNA 종이 접기 구조는 일반적으로 수개월 동안 안정적이므로 대량의 재고를 나중에 사용할 수 있습니다.
   참고: 스테이플 가닥의 과량은 또한 스핀^여과(47)및 속도 구역 원심분리(48) 및 아가로즈 겔^{추출(49)과}같은 다른 정제 기술(46)을 사용하여 제거될 수 있다. DNA 종이접기 구조는 다양한^{완충액(50)에서}안정하며, 필요한 경우, 저장 매체는 스핀 여과(51)를 통해 PEG 정제 후 변경될 수 있다.

4. 아가로즈 젤 전기 동동

참고 : 아가로즈 젤 전기 동거의 품질을 사용하여 접기 및 과도한 스테이플 가닥의 제거를 확인할 수 있습니다.

1. 아가로즈 1 g과 1x TAE 45 mL를 Erlenmeyer 플라스크에 추가하여 ~ 2% (v) 아가로즈 젤을 준비합니다. 아가로즈가 완전히 용해될 때까지 전자레인지에서 혼합물을 가열하고 명확한 용액이 생성됩니다.
2. 플라스크가 편안하게 만질 수 있도록(50-60°C)가 될 때까지 흐르는 물 에서 용액을 식힙니다.
3. 용액에 110 mM MgCl₂ 및 40 μL의 에티듐 브로마이드 용액 (0.58 mg mL^-1)을첨가하고 혼합물을 부드럽게 흔들어 줍니다.
   주의: 에티듐 브로마이드는 발암 물질일 수 있으며 주의해서 다루어야 합니다.
4. 젤 주조 트레이를 설정하고 액체 아가로즈를 주조 트레이에 붓습니다. 젤을 실온에서 적어도 30 분 동안 고화시키십시오.
5. 주조 트레이에서 젤을 제거하고 젤 전기 동공 챔버에 넣습니다. 실행 버퍼로 챔버를 채웁니다 (11 mM MgCl_2로1 x TAE).
6. 시료 용액 5 μL당 6x 젤 로딩 염료 1 μL을 넣고 완전히 섞습니다. 원하는 양의 샘플 용액을 별도의 젤 포켓에 조심스럽게 파이펫팅하여 샘플을 로드합니다.
7. 아가로즈 겔을 95V의 일정한 전압에서 45분 동안 실행합니다.
8. 겔 이미징 시스템을 사용하여 자외선 하에서 젤을 시각화합니다(그림2A).

5. 기판 준비(그림 3A)

참고: 다음 단계는 SiO₂ 성장(9단계)을 제외한 클린룸 내에서 모두 수행됩니다. 이 공정이 기판에서 모든 잔류물을 제거하기에 충분하지 않은 경우 세척 단계는 표준 피라냐 용액 기반 세척으로 대체 될 수 있습니다.

1. 기판으로 사용되는 웨이퍼에서 7mm x 7mm 칩을 절단합니다. SiN의 경우 실리콘 톱, 다이아몬드 커터 펜 또는 이와 유사한 기구를 사용합니다. 다이싱 사파이어 (Al_2O3)는특수 공구 또는 톱날이 필요합니다. 칩 크기가 정확할 필요는 없습니다.
2. 칩 청소.
   1. 다이싱된 칩을 뜨거운 아세톤(52°C로 가열)으로 유리에 담그고 적어도 15분 동안 가열합니다.
   2. 그들은 여전히 뜨거운 아세톤 욕조에있는 동안, 부드럽게 기계적으로 모든 잔류 물을 제거하는 면봉으로 칩을 문질러.
   3. 핀셋을 사용하여 뜨거운 아세톤에서 칩을 들어 올리고 세척 병을 사용하여 실온 아세톤으로 헹구십시오.
   4. 이소프로판올과 초음파 를 2 분 동안 유리에 담그세요.
   5. 핀셋으로 이소프로판올에서 칩을 들어 올리고 질소 흐름을 사용하여 즉시 완전히 건조시면 됩니다. 핀셋으로 덮인 영역이 제대로 건조되지 않아 접촉 부위에 잔류물 및 기타 오염이 발생할 수 있으므로 칩의 측면과 모서리만 만지고 잡습니다. 최상의 결과를 얻으려면 가능한 한 높은 유량을 사용하고 칩 표면을 유동 방향과 평행하게 유지하십시오.
3. 나중에 사용할 수 위해 칩을 덮인 용기에 클린룸 내부에 보관하십시오.

6. 비정질 실리콘 (a-Si) 층의 플라즈마 강화 화학 증착 (PECVD)(그림 3B)

1. 칩을 PECVD 장비에 넣습니다.
2. 증착 파라미터를 설정하여 약 50 nm의 비정질 실리콘(a-Si)을 성장시다. 정확한 설정은 장비 모델 및 교정에 따라 다릅니다. 여기에 사용된 매개 변수는 표 3을 참조하십시오. a-Si 증착 프로그램을 실행하여 레이어를 성장시고자 합니다.
3. 가공 후, 칩을 커버된 용기에 표준 클린룸 상태로 보관하십시오.

7. A-Si 층의 산소 플라즈마 처리(그림 3B)

참고 :이 단계는 DNA 종이 접기 구조가 나중에 효과적으로 추가 마그네슘 이온의 도움으로 표면에 흡착 될 수 있도록, 약간 음전하 및 친수성 기판 표면을 만들 것입니다.

1. 칩을 반응성 이온 에칭(RIE) 장비에 넣습니다.
2. 산소 플라즈마를 생성하기 위해 에칭 파라미터를 설정합니다. 다시 말하지만, 정확한 설정은 장비 모델 및 교정에 따라 다릅니다. 여기에 사용된 매개 변수는 표 3을 참조하십시오. 산소 플라즈마 처리 프로그램을 실행합니다.
3. 치료의 효과가 빠르게 악화될 때 즉시 다음 단계로 계속하십시오. 전형적으로, 기판은 플라즈마 처리 후 다음 30분 이내에 사용되어야 한다.

8. DNA 종이 접기의 증착(그림 3C)

1. 접이식/정제된 DNA 종이접기 용액 5 μL(~20 nM)을 1x FOB 4 μL과 1 M MgCl_2의1 μL로 혼합하여 증착을 위한 DNA 종이 접기 혼합물을 준비합니다. 생성된 용액에는 ~ 10 nM DNA 종이 접기 와 Mg^{2 +}약 100 mM이 포함되어 있습니다.
2. DNA 종이접기 혼합물의 10 μL을 산소 플라즈마 처리 칩 상에 침전시키고 실온에서 5분 동안 배양한다. 덮개는 의도하지 않은 건조를 방지하고 나중에 외부 소금과 DNA 종이 접기 구조를 제거하는 데 도움이됩니다.
3. 배양 후, 먼저 칩에 증류수(예를 들어, 밀리큐)의 100 μL을 파이펫팅하여 표면을 세척한다. 칩의 중앙에 닿지 않도록 하면서 파이펫으로 물을 앞뒤로 몇 번 헹구어 보시기 합니다. 파이펫으로 표면에서 대부분의 물을 제거합니다. 이것은 단지 제대로 흡착 종이 접기 표면에 남아 발생합니다.
4. 이 세척 주기(8.3단계)를 3-4회 반복합니다.
5. 세척 후 질소 흐름으로 즉시 샘플을 건조시. 기판 제제에서 건조와 동일한 방식으로 수행한다(단계 5). 가능한 한 철저하게 시료를 건조하는 것이 중요합니다.
   참고 : 증착 된 구조의 밀도 및 따라서 금속 나노 구조의 밀도는 증착 용액에서 DNA 종이 접기 및 Mg^{2 +의} 농도를 조정하여 수정 할 수 있습니다. 더 높은 Mg²⁺ 농도는 DNA 종이 접기 접착력을 향상시키고 따라서 밀도를 증가시킵니다, 그러나 결국 또한 DNA 종이 접기 구조물의 응집을 일으키는 원인이 될 것입니다. 따라서, 주로 DNA 종이 접기 농도를 먼저 조정해야합니다.

9. SiO₂ 마스크의 성장(그림 3D)

참고: 이 단계는 클린룸 외부에서 수행할 수 있습니다. 다음 버전은 음의 톤 패턴을 생성하지만 대신 양수 톤 패턴을 생성하도록 프로세스를 수정할 수 있습니다. SiO₂ 성장 과정은 Surwade et al.^52에서적응되어 저자^53에의해 추가로 개발되었으며, 마침내 이 프로토콜에 최적화되었다.

1. 밀봉 가능한 데시케이터(1.5L), 데시케이터 내부에 맞는 페트리 접시(선택 사항) 및 건조기 내부의 플랫폼역할을 할 수 있는 천판 접시를 가져가라.
2. 실리카 젤 100 g을 페트리 접시에 30g의 증류수와 섞거나 건조기에서 직접 섞습니다. 실리카 겔이 안정화될 수 있도록 미리 24시간 이상 이 단계를 수행하는 것이 바람직하다.
   참고 : 이것은 건조기 내부의 습도를 제어하는 데 사용되므로 SiO₂ 필름의 성장 속도와 형태도 제어합니다. 습도가 높을수록 더 높은 속도와 거친 구조가 발생합니다. 대안적으로, 실리카 겔은 기후 시험 챔버에서 경화될 수 있다.
3. 실리카 젤을 데시케이드에 놓고 천충판으로 분리합니다.
4. 흡착 된 DNA 종이 접기뿐만 아니라 (신선한) 테트라에틸 오르토실리 케이트 (TEOS)의 10 mL의 오픈 바이알과 탈수 된 플랫폼에서 25 % 25 % 수산화 암모늄 (NH₄OH)의 또 다른 바이알로 칩을 배치하십시오. 시료의 반대편과 가까운 바이알을 설정합니다. 바람직하게는 플라스크 코르크 또는 이와 유사한 플랫 받침대를 사용하여 플랫폼에서 칩을 약간 올린다.
   주의: NH₄OH와 TEOS는 피부 접촉시 유해하며 증기는 눈과 호흡기 모두에 자극을 일으킬 수 있습니다. 통풍이 잘 되는 장소에서 사용하고 보호 장갑, 눈 보호 및 보호 복을 착용하십시오.
5. 챔버를 밀봉하고 실온에서 20 시간 동안 배양하십시오. 이것은 DNA 종이 접기 구조가 위치하지 않는 영역에 SiO₂ 필름을 성장시키고, DNA 종이 접기 모양의 구멍이있는 10-20 nm 패턴 마스크를 만듭니다(그림 4).
6. 배양 후 챔버에서 샘플을 제거합니다. 커버된 용기에 보관하십시오. 여기서 처리를 일시 중지할 수 있습니다. 사용된 TEOS 및 NH₄OH를 폐기합니다. 실리카 겔의 배치는 사용 사이에 건조기 내부에 밀봉되어 2-3 주 이내에 사용되면 2-3 회 사용할 수 있습니다.

10. SiO₂ 및 A-Si의 반응성 이온 에칭(RIE)(그림 3E)

1. 칩을 반응성 이온 에칭(RIE) 장비에 넣습니다.
2. SiO 2_마스크의 구멍 아래에 있는 a-Si 층을 드러내기 위해 에칭 파라미터를 SiO_2의 2-5nm만 에칭하도록 설정합니다. 정확한 설정은 개별 장비에 대해 실험적으로 결정해야 합니다. 여기서 사용되는 매개 변수는 표 3에표시됩니다. 이방성 SiO₂ 플라즈마 에칭 프로그램을 실행합니다.
3. 50 nm a-Si 층을 관통하도록 에칭 파라미터를 설정합니다. 여기서 사용되는 매개 변수는 표 3에다시 표시됩니다. 등방성 a-Si 플라즈마 에칭 프로그램을 실행합니다.
4. RIE 장비에서 샘플을 제거하고 덮여 저장합니다. 여기서 처리를 다시 일시 중단할 수 있습니다.

11. 금속의 물리적 증착 (PVD)(그림 3F)

1. 칩을 PVD 계측기의 증발 챔버에 로드합니다.
2. 대상 금속을 선택합니다. 먼저 접착제 금속을 선택합니다. 여기서, 2 nm의 크롬(Cr)이 사용된다.
3. 대상 재료 및 두께에 대한 두께 제어 프로그램을 설정합니다. 제어 방법은 계측기에 따라 다릅니다. 여기서, 쿼츠 크리스탈 마이크로밸런스(QCM)가 사용된다. 측정된 두께는 대상 재료 밀도 및 Z 계수에 의해 조정되며 장치 및 각 대상 재료에 특정한 실험적으로 결정된 툴링 계수에 의해 수정되어야 합니다.
4. 전자 빔을 시작하고 빔을 대상에 정렬하고 0.05 nm/s의 증착 속도에 도달 할 때까지 빔 전류를 증가시다. 최종 두께 2 nm에 도달 할 때까지 증발하십시오.
5. 챔버를 배출하거나 공정을 중단하지 않고 두 번째 대상 금속(예: 금)을 선택합니다. 중단 또는 환기는 접착제 금속이 산화를 시작하고 접착제로서의 유용성을 감소시킬 수 있게 합니다.
6. 11.3단계에서 11.4단계 반복합니다. 20 nm에 도달 할 때까지 증발. 이것은 총 높이가 22 nm인 SiO₂ 마스크 구멍을 통해 DNA 종이 접기 모양의 금속 구조를 생성합니다.
7. 챔버를 배출하고 샘플을 제거합니다.
8. 샘플이 덮여 저장되는 경우 처리를 일시 중지할 수 있습니다.

12. 수소 불소산 (HF)을 가진 리프트 오프(그림 3G)

1. 적합한 플라스틱 용기에 50% HF 기반 에칭 액을 붓습니다. HCl은 샘플에서 Cr을 에칭하기 때문에 혼합물에 대해 HCl을 사용해서는 안됩니다.
   주의: HF는 매우 부식성이 있고, 심한 자극과 화상을 일으키며, 피부 접촉이나 흡입시 치명적일 수 있습니다. 보호 앞치마, 내화학성 장갑 및 얼굴 바이저가 있는 전용 연기 후드 또는 통풍이 잘 되는 습식 벤치에서만 HF를 사용하거나 완전한 화학 적 보호를 하십시오.
2. 샘플을 HF 기반 에찬트에 담그고 플라스틱 핀셋으로 부드럽게 저어줍니다.
3. SiO₂ 층이 완전히 식각되고 금속 층이 분리 될 때까지 기다립니다. 시간은 마스크 구멍의 밀도에 따라 눈에 띄게 달라집니다. 구멍수가 많을수록 에칭 속도가 빨라집니다. 금속 층이 벗겨지기 어려운 경우 5 ~ 10 s의 간단한 초음파를 사용할 수 있습니다.
4. 금속 필름이 분리되면 이중 증류수와 이소프로판올로 샘플을 헹구십시오.
5. 헹구후, 기판 제제에 대해 지시된 것과 동일한 방식으로 질소 흐름으로 샘플을 건조시(단계 5). 핀셋이 칩 센터와 접촉하지 않도록 하여 형성된 나노 구조를 파괴할 수 있습니다.
   참고: 샘플을 저장하고 처리하면 여기에서 일시 중단될 수 있습니다.

13. 남은 A-Si의 RIE(그림 3H)

1. 칩을 반응성 이온 에칭(RIE) 장비에 넣습니다.
2. A-Si의 모든 50nm를 철저히 제거하기 위해 에칭 파라미터를 설정합니다. 파라미터는 10단계에서와 동일할 수 있지만, 모든 A-Si를 제거하기 위해 약간 더 긴 에칭 시간(40s)을 사용할 수 있습니다. 여기에 사용된 매개 변수는 표 3을 참조하십시오.  등방성 a-Si 플라즈마 에칭 프로그램을 실행하여 남은 A-Si를 제거합니다.
3. RIE 장비에서 샘플을 제거하고 덮여 저장합니다. 이렇게 하면 샘플 처리가 마무리됩니다.

14. 원자력 현미경 검사법 (AFM)

참고 : 원자력 현미경 검사법 및 주사 전자 현미경 검사법은 필름 성장 및 패터닝의 성공을 모니터링할 뿐만 아니라 접힌 DNA 종이 접기 구조를 이미지화하는 데 사용할 수 있습니다(그림 2B, C). 5-13단계의 처리된 샘플을 이미지화한 경우 다음 샘플 준비 단계를 건너뛸 수 있습니다.

1. AFM을 위한 샘플 준비
   1. 접힌 DNA 종이 접기를 이미지화하려면 운모 기판 의 칩을 가져 가라.
   2. 접착제를 사용하여 유리 현미경 슬라이드에 운운 칩을 부착합니다.
   3. ~20 nM DNA 종이접기 스톡을 1x FOB에서 50회 희석하여 약 0.4 nM의 농도로 DNA 종이접기 용액 10 μL을 준비한다. 희석은 기판의 과밀을 방지하기 위해 수행된다.
   4. 운모 시트의 상단 층을 약한 테이프로 벗겨내어 갓 갈라진 충전된 표면을 얻습니다.
   5. 희석된 DNA 종이접기 용액을 갓 갈라진 운모에 증착하고 실온에서 1분 동안 덮인 샘플을 배양합니다.
   6. 배양 후, 피펫을 사용하여 증류수 100 μL로 표면을 3-4회 세척한다. 이것은 단지 제대로 흡착 종이 접기 표면에 남아 발생합니다.
   7. 운석 표면에 증류수 100 μL을 증착합니다.
   8. 테이블의 현미경 슬라이드를 기울이고 날카롭게 탭하여 물의 대부분을 분리합니다.
   9. 이 세탁 주기를 3-4 회 반복하십시오.
   10. 세척 직후 질소 흐름으로 샘플을 완전히 건조시면 됩니다. 샘플은 AFM 이미징을 위해 준비됩니다.
2. DNA 종이 접기 샘플 또는 처리 된 칩을 AFM에 넣고 스캔을 수행합니다. 1-10 μm의 스캔 크기는 구조물을 적절하게 해결하는 데 적합합니다.

15. 주사 전자 현미경 검사법 (SEM)

1. 샘플을 SEM에 넣습니다. 처리된 칩은 있는 대로 사용할 수 있습니다(추가 시료 전처리가 필요하지 않음).
2. 가속 전압을 선택합니다. 샘플 기판(Al_2O3 또는 SiN)은 절연체이므로 저전압(5-10kV)을 사용하여 충전 효과를 줄입니다.
3. 관심 영역을 스캔합니다. 충전 시간을 최소화하여 충전을 줄이고 오염증을 방지합니다.

결과

나비 넥타이 DNA 종이 접기 디자인의 개략적 인 그림과 구조적 세부 사항은 그림 1에나와 있습니다. 아가로즈 겔 전기동동및 AFM은 DNA 종이접기 접기 및 PEG 정제의 질을 분석하기 위해 사용된다(도2). 나노 리소그래피 단계의 공정 흐름은 그림 3에표시됩니다. SiO₂ 마스크 성장 후 대표적인 AFM 이미지는 도 4에 도시되어 있습니다(이 단계는 도 3D에도시되어 있음), 최종 금속 나노 구조의 SEM 이미지는 도 5에서 볼 수 있습니다(이 단계는 에 도시되어 있습니다) 그림 3H). 도 6은 나비타이 DNA 종이접기에 의해 서식된 금속 나노구조체의 광학적 기능을 나타낸 다.

접이식 버퍼(FOB) 성분 농도 [mM]
	Tris	아세트산	Edta	염화마그네슘	Ph
2.5x FOB	100	47.5	2.5	31.25	~8,3
1x 초점	40	19	1	12.5	~8,3

표 1: 접이식 버퍼(FOB)의 조성물.

온도 범위[oC]	냉각 속도
90-70	-0.2 °C / 8 s
70-60	-0.1 °C / 8s
60-27	-0.1 °C / 2 s
12	멈출 때까지 길게 누를 때

표 2: 나비 넥타이 종이 접기 접기용 열 램프. 어닐링 후, 종이 접기는 프로그램이 수동으로 중지 될 때까지 ^12oC에 저장됩니다.

PECVD 및 RIE 매개 변수
	가스	가스 흐름[sccm]	챔버 압력 [mTorr]	RF 전력 [W]	온도[oC]	지속 시간 [s]
A-Si의 PECVD	N2에서 5% SiH4	500	1000	15	250	90
O2 플라즈마 처리	O2	50	40	200	30	1200
리 오브 시오2	CHF3	25
	아칸소	25	30	100	25	10-22
리에 오브 A-시	O2	8
	SF6	100	90	50	30	35
남은 A-Si의 RIE	O2	8
	SF6	100	90	50	30	35-40

표 3: 플라즈마 강화 화학 증착(PECVD) 및 반응성 이온 에칭(RIE)을 위한 공정 파라미터. 이러한 장치의 공정 파라미터는 개별 계측기와 관련이 있으며 사용할 때 조정해야 할 수 있습니다.

그림 1: 나비 넥타이 DNA 종이 접기의 디자인. (A)코어 구조가 이중 나선으로 표시되고 폴리T 돌출부를 물결 모양의 선으로 묘사하는 나비 넥타이 종이 접기 디자인의 개략적 표현. (B)caDNAno 소프트웨어에서 나비 넥타이 종이 접기 디자인의 일부의 스크린 샷. 빨간색 십자가는 트위스트 보정을 위해 건너뛰는 베이스 쌍을나타내며 T 8-오버행은 무딘 엔드 베이스 스태킹을 방지하기 위해 추가됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 나비 넥타이 DNA 종이 접기 구조의 특성. (A)아가로즈 겔 전기동동간 정제 전과 후 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG) 정화. 7249 개의 뉴클레오티드 긴 스캐폴드가 참조로 사용된다. (B)정화 전에 나비 넥타이 구조의 원자력 현미경 검사법 (AFM) 이미지. (C)PEG 정화 후 나비 넥타이 구조의 AFM 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 제작 공정 흐름의 구성표 (치수는 배율이 없습니다). (A)주사위를 치우고 기판을 청소합니다. (B)혈장 강화 화학 증착 (PECVD)에 의해 A-Si 층을 증착. *A-Si 아래에 추가희생층을 채택하여 HF 이외의 에찬트와 리프트 오프를 가능하게 할 수 있습니다. (C)O₂ 플라즈마로 샘플 표면을 치료하고 DNA 종이 접기를 침전시킬 수 있습니다. (D)SiO₂ 마스크를 건조기에서 성장시. (E)SiO_2의 얇은 층을 에칭하고 반응성 이온 에칭(RIE)에 의해 그 아래에 a-Si를 통과한다. (F)물리적 증착(PVD)에 의해 마스크를 통해 금속을 증착한다. (G)HF(H)로리프트 오프는 RIE에 의해 나머지 A-Si를 제거합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 4: DNA 종이 접기 모양의 패턴을 가진 SiO₂ 필름의 대표적인 AFM 이미지. (A)10 μm x 10 μm 스캐닝 영역은 패턴 형성의 높은 수율을 나타내고 있다. (B)가까운 3 μm x 3 μm 스캔은 SiO₂ 필름에서 정확한 개별 패턴을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5:구조적으로 다른 DNA 종이 접기로 템플릿 된 금속 나노 구조의 대표적인 주사 전자 현미경검사법 (SEM) 이미지. (a)십자형 DNA 종이접기, 즉, 소위 시만 타일 종이 접기^54. (B)보타이 안테나. (C)키랄 더블 L (CDL) 구조. 인세트는 150 nm x 150 nm의 상자 크기로 개별 구조를 표시합니다. 정확한 구조의 제조 수율은 보우 타이 종이 접기의 경우 최대 76 %, 여기에 표시된 다른 구조물의 경우 ~ 50 %입니다^34. 이 그림은 션 외^34에서적응및 수정되었습니다. 이 그림은 저자의 허가를 받아 재현되고 2018년 미국 과학진보협회가 발행합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: 결과 나노 구조의 대표적인 광학 / 기능적 특성. (A)지역화된 표면 플라스몬 공명(LSPR) 편광이 다른 개별 금 나비 넥타이 구조(주황색과 파란색으로 구분된 색상)를 측정합니다. 실선은 스펙트럼을 측정하고 파선은 시뮬레이션 결과입니다. 인세트는 측정된 파티클의 SEM 이미지(왼쪽)와 시뮬레이션에 사용되는 모델(오른쪽)을 표시합니다. (B)표면 강화 라만 분광법 (SERS) 로다민 6G와 2,2-비피리딘은 나비 넥타이 나노 구조로 덮인 표면에서 측정. 각 샘플의 기준선은 나노 구조가 없을 때 신호 레벨을 보여줍니다. 이 그림은 션 외^34에서적응및 수정되었습니다. 이 그림은 저자의 허가를 받아 재현되고 2018년 미국 과학진보협회가 발행합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1: CaDNAno 파일이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 2 : m13mp18 시퀀스이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 3: 스테이플 가닥 시퀀스이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

이 프로토콜은 생산된 나노 구조의 모양에서 큰 자유와 정확성을 제공합니다. DNA 종이 접기의 디자인을 변경함으로써 금속 나노 구조의 모양을 제어 할 수 있습니다. 금속 구조의 최종, 정확한 형상은 마스크 성장 단계(Step 9)에 의해 추가적으로 결정되며, 마스크 에칭(Step 10)에 의해 이방성되지 않아야 한다. 마스크 성장 시간이 충분히 연장되면 마스크의 구멍이 닫히기 시작합니다. 이는 일부 구조의 가장 얇은 특징을 생략하고 갭 크기를 제어하는 데 사용될 수 있으며, 션 등^34에서 입증된 바와 같이 나비타이 종이접기의 분리된삼각형(도 5B). 반대로, 더 얇은 모양은 산화물 성장 시간을 단축하여 더 잘 보존 될 수있다. 이는 사용된 종이접기 디자인을 변경하는 것뿐만 아니라 SiO₂ 필름 성장을 튜닝하여 도 6에표시된 광학 적 특성을 조정할 수 있음을 의미합니다.

마스크 두께가 크게 변경되면 SiO₂ RIE 단계에도 이러한 변경이 반영되어야 합니다. SiO_2의 매우 얇은 층만 에칭 (2-5 nm) 간신히 마스크 구멍을 관통한다. 이것은 전체 프로세스에서 가장 민감하고 중요한 부분입니다. 에칭 시간은 매우 짧기 때문에 10-20s에 불과하므로 새로운 장비를 처음 시도 할 때 정확한 설정을 실험적으로 결정해야합니다. 이것은 또한 일부 SiO_2는 또한 A-Si 에칭 동안 에칭으로 단계 10.4에 대한 사실이다. 에칭된 SiO_2의 범위는 사용된 A-Si 식각 파라미터, 장비 및 개별 장비 교정의 선택성에 의해 결정됩니다. 이 두 공정 동안 전체 SiO₂ 층을 에칭하지 않도록주의해야합니다.

또 다른 민감한 단계는 SiO₂ 성장입니다. 성장 과정은 챔버 습도 및 사용된 TEOS의 현재 활성 둘 다에 의존한다. TEOS는 공기 중에서 물을 흡입할 때 분해되어 나이가 들면서 효과가 떨어집니다. 이 상당히 느린으로 나타날 수 있습니다., 몇 달 이내에 덜 제어 성장 속도 화학 물질의 적절 한 저장으로. ³⁴ 생성된 SiO₂ 층이 의도한 것보다 얇으면 챔버 습도가 아닌 TEOS에 문제가 있음을 나타낼 수 있습니다. 습도가 낮으면 성장 속도가 낮아지고 필름이 얇아질 수 있지만 결과 필름도 평소보다 부드러워야 합니다. 한편 거친 입자와 거친 층은 반대로 높은 습도의 문제를 나타낼 것입니다.

또한 두 가지 요구 사항으로 자유롭게 선택된 다른 기판에서 이 프로토콜을 수행할 수 있습니다: HF 에칭(단계 12)과 PECVD의 200-300°C 온도(6단계)를 모두 허용해야 합니다. 더 민감한 기판을 사용하는 경우 a-Si의 PECVD에 대해 온도를 안전하게 100°C로 낮출 수 있지만, 프로토콜이 설명된 대로 정확하게 따르는 경우 HF를 피할 수 없습니다. HF를 우회하려면 추가 희생 계층을 적용해야 합니다. HF 에칭의 요구 사항이 제거되면 이 프로토콜은 다양한 기판 재료 및 금속 선택과 호환됩니다.

이 프로토콜은 일반적으로 사용되는 강력한 마이크로 및 나노 제조 공정으로 구성되어 있으므로 작은 기능 크기와 복잡한 금속 모양이 필요한 다른 마이크로 제조 프로토콜과 결합 할 수 있습니다. 가까운 장래에, 특히 저비용 DNA 종이 접기 대량 생산^(31)의오고, 인터페이스 기반 나노 포토닉스 및 플라스모닉스 (55)에 대한 일반적인 사용과 높은 처리량 나노 패터닝을 모두 용이하게하는이 방법에 대한 가능성이있다 .

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Honeywell	40289H	Semiconductor grade ULSI, ≥ 99.5 %
Agarose	Fisher Bioreagents	1036603	Low-EEO, multi-purpose and molecular biology grade
Ammonium hydroxide	Fisher Chemical	10652251	25 % ammonia solution, Certified AR for Analysis, d = 0.91
BRANSON 5510	Branson		Ultrasonic bath
Dimension Icon	Bruker		Atomic force microscope
Electron-beam evaporator IM-9912	Instrumentti Mattila		Evaporator for PVD
Ethidium bromide	Sigma Aldrich	E8751	Fluorescent dye for DNA staining
Eon Microplate spectrophotometer	BioTek		UV/Vis spectrophotometer used for DNA origami concentration measurements
Gel Doc XR+ Documentation System	BioRad		Gel imaging system
Gel Loading Dye, Blue (6×)	New England Biolabs	B7021S	Bromophenol blue-based loading dye for agarose gel electrophoresis
G-storm GS1 Thermal cycler	Gene Technologies
HBR 4	IKA		Heating bath
Hydrofluoric acid	Honeywell	40213H	Semiconductor grade, 49.5-50.5 %
Isopropanol	Honeywell	40301H	Semiconductor grade VLSI, ≥ 99.8 %
Magnesium chloride	Sigma Aldrich	M8266	Anhydrous, ≥ 98 %
Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System	BioRad
Plasmalab 80+ PECVD	Oxford Instruments		PECVD system
Plasmalab 80+ RIE	Oxford Instruments		RIE system
Poly(ethylene glycol)	Sigma Aldrich	89510	BioUltra, 8,000
PowerPac HC High-Current Power Supply	BioRad
Sapphire substrate (Al2O3)	University Wafer		Thickness: 430 μm, Polish: DSP, Size: 50.8 mm
Sigma VP	Zeiss		Scanning electron microscope
Silica gel	Merck	1019691000	With indicator (orange gel), granulate ~1-3 mm
Single-stranded Scaffold DNA, type p7249	Tilibit Nanosystems		At 100 nM concentration
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S9888	ACS reagent, ≥ 99.0 %
Staple strands (oligonucleotides)	Integrated DNA Technologies		Sequences can be ordered e.g. at 100 micromolar in Rnase-free water
TAE buffer (50×) pH 8.0	VWR Chemicals	444125D	Electran Electrophoresis grade
Take3 micro-volume plate	BioTek		Used for DNA origami concentration measurements
Tetraethyl orthosilicate	Sigma Aldrich	86578	≥ 99.0 % (GC)