수지상 가지 및 방향자동 식별

요약

제시된 것은 2D 형광 심상에서 신경 수지상 분기의 방향을 간단하고 직접 자동적으로 측정할 수 있는 계산 도구입니다.

초록

신경 수 지상 나무의 구조는 뉴런에서 시 냅 스 입력의 통합에 중요 한 역할을. 따라서, 원점의 형태의 특성화는 신경 기능의 더 나은 이해를 위해 필수적이다. 그러나, 수지상 나무의 복잡성, 고립 될 때 특히 신경 네트워크 내에 있을 때, 완전히 이해 되지 않았습니다. 우리는 2D 신경 배양의 형광 심상에서 수지상 분기의 방향을 자동 측정할 수 있는 새로운 계산 도구인 SOA (세분화 및 방향 분석)를 개발했습니다. Python으로 작성된 SOA는 세분화를 사용하여 수지상 분기를 이미지 배경과 구별하고 각 분기의 공간 방향에 데이터베이스를 축적합니다. 그런 다음 데이터베이스는 네트워크에서 수지상 분기의 방향 분포 및 병렬 수지상 분기 성장의 보급과 같은 형태학적 매개 변수를 계산하는 데 사용됩니다. 얻어진 데이터는 뉴런 활동 및 생물학 및 약리학 자극에 응하여 원달의 구조적 변화를 검출하기 위하여 이용될 수 있습니다.

서문

수지상 형태 발생은 수지상 나무의 구조가 뉴런^1,2,3에서 시냅스 통합의 전산 특성에 영향을 미치기 때문에 신경 과학의 중심 주제입니다. 더욱이, 수지상 분지의 형태학적 이상 및 수정은 퇴행성 및 신경 발달 장애^4,5,6에 연루됩니다. 수지상 파급 효과가 더 쉽게 시각화 될 수있는 신경 배양에서, 비 자매 수지상 분기 사이의 상호 작용은 분기를 따라 시냅스 클러스터링의 사이트와 정도를 조절, 시냅스 호형성 및 가소성에 영향을 미칠 수있는 행동^7,8,9. 따라서, 2차원(2D) 뉴런 배양을 이용한 수지상 나무의 형태학적 파라미터의 특성화는 뉴런의 단일 및 네트워크의 수지상 형태 발생 및 기능을 이해하는 데 유리하다. 그러나 수지상 분기는 "단순화된" 2D 신경 배양에서도 복잡한 메시를 형성하기 때문에 어려운 작업입니다.

수지상 구조물을 자동으로 추적하고 분석하기 위해 여러 가지 도구가 개발되었습니다10,11,12,13. 그러나 이러한 도구의 대부분은 3D 뉴런 네트워크를 위해 설계되었으며 2D 네트워크와 함께 사용하기에는 자연적으로 너무 복잡합니다. 반면, 덜 진보된 형태학적 분석 도구는 일반적으로 컴퓨터 지원 수동 노동의 중요한 구성 요소를 포함하며, 이는 매우 시간이 많이 걸리고 작업자 바이어스¹⁴에 취약합니다. '^ImageJ'15'(커뮤니티에서 개발한 생물학적 이미지 분석 도구의 방대한 컬렉션을 갖춘 NIH 오픈 소스 이미지 처리 패키지)와 같은 기존 반자동 도구는 사용자 수동 노동을 크게 줄입니다. 그러나 이미지 처리 중에 일부 수동 개입이 여전히 필요하며 세분화의 품질은 바람직하지 않을 수 있습니다.

이 백서는 2D 뉴런 네트워크 내의 수지상 분기의 직접 세분화 및 방향 분석을 허용하는 간단한 자동화 된 도구 인 SOA를 제공합니다. SOA는 2D 이미지에서 다양한 라인과 같은 물체를 감지하고 형태학적 특성을 특성화할 수 있습니다. 여기에서 는 SOA를 사용하여 수지상 의 2D 형광 이미지에서 수지상 분기를 배양했습니다. 이 소프트웨어는 수지상 분기를 식별하고 병렬 및 공간 분포와 같은 형태학적 매개 변수의 측정을 성공적으로 수행합니다. SOA는 다른 세포 모형의 세포 프로세스의 분석 및 비 생물학 네트워크를 공부하기 위한 쉽게 적응될 수 있습니다.

프로토콜

참고 : 이스라엘 보건부는 실험 동물의 윤리적 사용을 위해 프로토콜 IL-218-01-21에 따라 마우스의 사용을 승인했다. SOA는 윈도우와 호환 10 파이썬 3.9. 오픈 소스 코드로 사용할 수 있습니다: https://github.com/inbar2748/DendriteProject. 이 링크에는 README도 있습니다. 소프트웨어를 다운로드하기 위한 길찾기가 있는 DM 파일, 소프트웨어 웹 사이트에 대한 링크 및 모든 패키지의 필수 버전에 대한 정보가 포함된 요구 사항 파일입니다. 소프트웨어를 사용하여 수행된 분석의 추가 예도 이곳에 제공되었습니다.

그림 1: 세분화 및 성장 방향 분석을 위한 SOA 워크플로우입니다. 다음은 수지상 네트워크 및 데이터 분석의 형광 이미지의 처리 단계입니다. 2D 이미지는 업로드되고 세분화되어 있습니다(두 단계로 수지상 분기가 선으로 감지된 다음 관련 선이 병합됨) 각 수지상 분기의 공간 정보를 얻습니다. 데이터는 이미지의 모든 수지상 분기에 대해 수집됩니다. 마지막으로, 데이터는 원하는 형태학적 매개 변수를 제공하기 위해 분석된다. 약어: SOA = 세분화 및 방향 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1. SOA 응용 프로그램을 엽니 다.

1. URL 주소 열기: https://mega.nz/folder/bKZhmY4I#4WAaec4biiGt4_1lJlL4WA, SOA.zip 지퍼 폴더를 찾아, 두 번 클릭하여 ZIP 파일을 다운로드합니다.
2. SOA.zip 마우스 오른쪽 단추로 클릭하여 폴더의 압축을 풀고 파일 추출을 선택합니다. 열리는 추출 경로 및 옵션 창과 추출된 파일에 대한 경로를 표시하는 대상 주소 텍스트 상자를 관찰합니다. 다른 위치로 추출하려면 창 오른쪽 패널의 폴더 중 하나를 클릭하여 대상 폴더로 만듭니다. 확인을 클릭하여 해당 폴더로 파일을 추출합니다.
3. 추출된 SOA 파일을 열고 SOA.exe 두 번 클릭합니다. 검은 색 창이 열리기를 기다린 후 응용 프로그램이 나타납니다.

그림 2: SOA의 GUI를 사용하는 워크플로의 예입니다. 왼쪽 열: 워크플로의 GUI 섹션입니다. 중간 열: 워크플로 중에 처리된 수지상 네트워크의 이미지(배율 막대: 20 μm). 오른쪽 열: 중간 열 이미지에서 빨간색 사각형으로 표시된 영역의 배율(배율 막대: 4 μm). 1단계: 이미지 선택 및 업로드. 2단계: 세분화의 첫 번째 단계는 식별된 수지상 분기를 나타내는 선의 검출입니다. 3단계: 세분화의 두 번째 단계는 개별 수지상 분기에 있는 세그먼트 라이닝의 근접 기반 합병입니다. 모든 단계의 설정을 수정할 수 있습니다. 약어: SOA = 세분화 및 방향 분석; GUI = 그래픽 사용자 인터페이스. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 분석할 이미지를 엽니다.

1. SOA 뷰어 업로드 메뉴 표시줄| 파일 | 선택 컴퓨터 파일에서 이미지를 선택| .png .jpg .tif .bmp | 오픈 | 파일의 경로를 | 다음.

3. 세분화 최적화

참고: SOA 뷰어 속성 메뉴 모음에서 선택한 매개 변수의 값을 변경하여 세분화 프로세스 설정을 조정합니다. 임계값과 같은 매개 변수에 대한 자세한 설명은 보충 재질에 제공됩니다.

1. Edge에서 임계값을 선택하고 숫자를 입력하여 디스플레이의 임계값을 조정합니다.
   참고: 임계값의 수가 낮을수록 더 많은 선이 감지됩니다. 임계값은 0에서 255까지의 숫자입니다. 기본 값이 0으로 설정되었습니다.
2. 병합 선:
   1. 병합할 최소 거리를 선택하고 숫자를 입력 하는 Min 거리를 선택하여 디스플레이에 병합할 최소 거리를 조정합니다.
      참고: 병합할 최소 거리는 0~30픽셀입니다. 기본 값은 20으로 설정됩니다.
   2. 병합할 최소 각도를 선택하고 숫자를 입력 하는 Min 각도를 선택하여 디스플레이에 병합할 수 있습니다.
      참고: 병합할 최소 각도 는 0~30°입니다. 기본 값은 10으로 설정됩니다.
3. 미리 보기 세분화 이미지 만들기를 클릭합니다.
   참고: 분할 결과의 미리 보기 이미지가 업데이트된 값에 따라 표시됩니다. 또한 병합 하기 전에 선 수와 병합 후 줄의 수가 표시됩니다.
4. 세그먼트의 최대 식별을 위해 매개 변수를 변경합니다. 속성을 변경해야 하는 경우 창 닫기 버튼을 클릭하고 3.1-3.4 단계를 따릅니다.

4. 출력 파일을 만듭니다.

1. 확인을 눌러 세분화 이미지와 분석 그래프를 시각화합니다. .xlsx 파일이 저장되는 위치를 선택하기 위해 나타나는 창을 관찰합니다.
2. 파일 이름 | 삽입 저장 | 선택 데이터가 있는 .xlsx 파일을 만들고 저장할 때까지 기다립니다.
   참고: .xlsx 파일 외에도 원본 이미지를 표시하는 파일, 선 인식 이미지, 분할의 최종 이미지 및 세 가지 분석 그래프를 표시하는 파일이 자동으로 표시됩니다.

5. 탐색 도구 모음

참고: 탐색 도구 모음은 모든 그림 창에 포함되어 있으며 데이터 집합을 탐색하는 데 사용할 수 있습니다. 도구 모음 하단의 각 단추는 아래에 설명되어 있습니다.

1. 이전에 정의된 뷰 사이를 앞뒤로 이동하려면 앞으로 및 뒤로 단추를 사용합니다.
   참고: 홈, 포워드 및 뒤로 단추는 웹 브라우저의 홈, 포워드 및 백 컨트롤과 유사합니다. 홈 은 기본 화면인 원본 이미지로 돌아갑니다.
2. 확대/축소 버튼을 사용하여 이동 및 확대/축소합니다. 패닝 및 확대/축소를 활성화하려면 줌 버튼을 누릅니다.
   1. 그림을 이동하려면 왼쪽 마우스 버튼을 길게 누릅니다. 마우스 버튼을 놓고 이미지의 선택한 점이 새 위치에 나타납니다. 패닝하는 동안 x 또는 y 키를 길게 누르면 모션을 x 또는 y 축으로 제한합니다.
   2. 확대/축소하려면 오른쪽 마우스 버튼을 길게 누르고 새 위치로 드래그합니다. 오른쪽으로 이동하여 x축을 확대하고 왼쪽으로 이동하여 x축을 축소합니다. y축 및 위/아래 모션에서도 동일한 작업을 수행합니다. 확대/축소할 때 마우스 아래의 점이 고정되어 있어 해당 점을 확대하거나 축소할 수 있습니다. 수정자 키 x, y 또는 CONTROL 을 사용하여 줌을 각각 x, y 또는 종횡비 보존으로 제한합니다.
3. 확대/축소-사각형 모드를 활성화하려면 확대/축소-사각형 단추를 클릭합니다 . 커서를 이미지 위에 놓고 왼쪽 마우스 버튼을 누릅니다. 단추를 들고 마우스를 새 위치로 드래그하여 직사각형 영역을 정의합니다.
   참고: 왼쪽 마우스 버튼을 누르면 축 보기 제한이 정의된 영역으로 확대됩니다. 오른쪽 마우스 버튼을 누르면 축 보기 제한이 축소되어 정의된 영역에 원래 축을 배치합니다.
4. 서브플롯 구성 도구를 사용하여 하위 플롯의 모양을 구성합니다.
   참고: 서브플롯의 왼쪽, 오른쪽, 위쪽 및 아래쪽 측면과 행과 열 사이의 공백은 연장하거나 압축할 수 있습니다.
5. 파일 저장 대화 상자를 열려면 저장 단추를 클릭하고 파일을 .png. .ps, .eps, .svg 또는 .pdf 다음 형식으로 저장합니다.

결과

문화에서 수지상 네트워크의 이미지에 대한 대표적인 분석이 수행되었습니다. 세포는 바란 외에 의해 설명된 바와 같이 추출되었다. ^16,17. 간략하게, 해마 세포는 산후 쥐의 두뇌에서 추출되고 1-2 주 동안 2D 유리 덮개에 경작되었습니다. 배양은 수지상 단백질 마커, 마이크로튜드 관련 단백질 2(MAP2)에 대한 항체를 사용하여 간접면역형광을 통해 ?...

토론

2D 심상에서 형태학적 정보를 추출하기 위한 효과적인 전략은 생물학적 이미징 데이터를 따라잡기 위해 시급히 필요합니다. 이미징 데이터는 몇 시간 안에 생성될 수 있지만 이미지에 대한 심층 분석은 시간이 오래 걸립니다. 그 결과, 이미지 처리는 분명히 많은 분야에서 주요 장애물이되었다. 이것은 특히 생물학적 샘플을 다룰 때 데이터의 복잡성이 높기 때문입니다. 또한 많은 사용자가 특수 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Matplotlib	2002 - 2012 John Hunter, Darren Dale, Eric Firing, Michael Droettboom and the Matplotlib development team; 2012 - 2021 The Matplotlib development team.	3.4.2	a Python 2D plotting library
matplotlib-scalebar	Philippe Pinard	0.7.2	artist for matplotlib to display a scale bar
NumPy	The NumPy community.	1.20.3	fundamental package for scientific computing library
OpenCV	OpenCV team	4.5.2.54	Open Source Computer Vision Library
PyCharm	JetBrains	2020.3.1 (Community Edition) version	Build #PC-203.6682.86, built on December 18, 2020. Runtime version: 11.0.9.1+11-b1145.37 amd64. VM: OpenJDK 64-Bit Server VM by JetBrains s.r.o. Windows 10 10.0. Memory: 978M, Cores: 4
PyQt5	Riverbank Computing	5.15.4	manage the GUI
python	Python Software Foundation License	3.9 version
Qt Designer	The QT Company Ltd.	5.11.1 version
scipy	Community library project	1.6.3	Python-based ecosystem of open-source software for mathematics, science, and engineering
Seaborn	Michael Waskom.	0.11.1	Python's Statistical Data Visualization Library.
Windows 10	Microsoft
Xlsxwriter	John McNamara	1.4.3	Python module for creating Excel XLSX files