P3HR1 세포주에서 엡스타인-바 바이러스의 분리 및 정량화

요약

이 프로토콜은 phorbol 12-myristate 13-아세테이트로 바이러스 용해 주기를 유도할 때 인간 P3HR1 세포주에서 Epstein-Barr 바이러스 입자의 분리를 허용합니다. 이어서 바이러스 제제에서 DNA를 추출하고 실시간 PCR을 수행하여 바이러스 입자 농도를 정량화합니다.

초록

공식적으로 인간 헤르페스 바이러스 4 (HHV-4)로 지정된 엡스타인-바 바이러스 (EBV)는 최초의 분리 된 인간 종양 바이러스입니다. 전 세계 성인 인구의 거의 90-95%가 EBV에 감염되어 있습니다. 최근 분자생물학 및 면역학의 발전으로 시험관 내 및 생체 내 실험 모델의 적용은 EBV 관련 종양 발생뿐만 아니라 많은 질병에서 EBV의 발병 기전에 대한 깊고 의미 있는 통찰력을 제공했습니다. 이 시각화된 실험 논문의 목적은 P3HR1 세포주의 세포에서 EBV 바이러스 입자를 분리한 후 바이러스 제제를 정량화하는 개요를 제공하는 것입니다. 원래 인간 버킷 림프종에서 분리된 P3HR1 세포는 제2형 EBV 균주인 P3HR1 바이러스를 생성할 수 있습니다. EBV 용균 주기는 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)로 처리하여 이러한 P3HR1 세포에서 유도되어 EBV 바이러스 입자를 생성할 수 있습니다.

EBV 입자의 분리를 위해 이 프로토콜을 사용하여 P3HR1 세포를 35ng/mL PMA를 포함하는 완전한 RPMI-1640 배지에서 37°C 및 5%_CO2 에서 5일 동안 배양합니다. 이어서, 배양 배지를 120 x g 의 속도로 8분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화한다. 그런 다음 바이러스 함유 상청액을 수집하고 16,000 x g 의 속도로 90분 동안 회전시켜 EBV 입자를 펠릿화합니다. 그런 다음 바이러스 펠릿을 완전한 RPMI-1640 배지에 재현탁합니다. 그런 다음 DNA 추출 및 정량적 실시간 PCR을 수행하여 제제에서 EBV 입자의 농도를 평가합니다.

서문

엡스타인-바 바이러스(EBV)^{는 분리된 최초의} 인간 종양 바이러스입니다1. 공식적으로 인간 헤르페스 바이러스 4 (HHV-4)²라고하는 EBV는 헤르페스 바이러스 계열의 감마 헤르페스 바이러스 아과의 일부이며 림프 암호 바이러스 속의 원형입니다. 전 세계 성인 인구의 거의 90-95%가 바이러스에 감염됩니다³. 대부분의 경우 초기 감염은 생후 3 년 이내에 발생하며 무증상이지만 청소년기에 늦게 감염이 발생하면 전염성 단핵구증⁴이라고하는 질병이 발생할 수 있습니다. EBV는 휴지기 B 세포를 감염시켜 바이러스가 잠^{복 감염 상태를} 확립하고 유지하는 증식성 B 림프구가 되도록 유도할 수 있습니다5. EBV는 언제든지 재활성화될 수 있으므로 재발성 감염으로 이어질 수 있습니다⁶.

지난 50년 동안, 일부 바이러스와 인간 악성 종양의 발달 사이의 연관성이 점점 더 명백해졌고, 오늘날 모든 인간 암의 15% 내지 20%가 바이러스 감염과 관련이 있는 것으로 추정된다⁷. EBV를 포함한 헤르페스 바이러스는 이러한 유형의 종양 바이러스⁸에 대해 가장 잘 연구 된 예 중 일부입니다. 실제로 EBV는 버킷 림프종(BL), 호지킨 림프종(HL), 미만성 거대 B 세포 림프종 및 면역저하 숙주 ^9,10의 림프증식성 질환과 같은 다양한 유형의 인간 악성 종양을 유발할 수 있습니다. EBV는 또한 전신성 자가면역 질환의 발병과 관련이 있는 것으로 나타났습니다. 이러한 자가면역 질환의 예로는 류마티스 관절염(RA), 다발성 근염-피부근염(PM-DM), 전신성 홍반성 루푸스(SLE), 혼합 결합 조직 질환(MCTD) 및 쇼그렌 증후군(SS)¹¹이 있습니다. EBV는 또한 염증성 장 질환(IBD)의 발병과 관련이 있습니다¹².

이러한 질병의 대부분은 세포 배양, 마우스 또는 EBV에 감염된 기타 유기체를 사용하여 연구하거나 모델링할 수 있습니다. 그렇기 때문에 EBV 입자는 시험관 내 또는 생체 내 모델^13,14,15,16에 관계없이 세포 또는 유기체를 감염시키는 데 필요하므로 저렴한 비용으로 바이러스 입자를 분리 할 수있는 기술을 개발해야합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 상대적으로 접근 가능한 세포주에서 EBV 입자를 안정적으로 분리하고 대부분의 실험실에서 비용 효율적이고 쉽게 사용할 수 있는 real-time PCR을 사용하여 입자를 정량하는 쉬운 방법에 대한 지침을 제공합니다. 이는 상이한 세포주^17,18,19,20으로부터 EBV를 단리하기 위해 기술된 몇몇 다른 방법과 비교된다.

P3HR-1은 현탁액에서 자라며 EBV 유형 2 균주에 잠복하는 BL 세포주입니다. 이 세포주는 EBV 생산자이며 바이러스 입자를 생성하도록 유도 될 수 있습니다. 이 원고의 목표는 P3HR-1 세포주에서 EBV 입자를 분리한 다음 나중에 시험관 내 및 생체 내 EBV 실험 모델 모두에 사용할 수 있는 바이러스 스톡의 정량화를 허용하는 방법을 선보이는 것입니다.

프로토콜

알림: EBV는 잠재적으로 생물학적 위험 물질로 간주되어야 하므로 생물안전 레벨 2 이상의 격리에서 취급해야 합니다. 실험실 코트와 장갑을 착용해야합니다. 튀김에 노출 될 가능성이있는 경우 눈 보호도 고려해야합니다. 다음 절차는 생물학적 안전 캐비닛에서 수행해야합니다.

1. P3HR1 세포 계수

1. 세포 원심분리 및 재현탁
   1. 진행 중인 P3HR1 세포 배양의 100mm 배양 플레이트(또는 T-25 플라스크)에서 80% 컨플루언시로 세포 현탁액을 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. P3HR-1 세포의 파종 밀도는 1 x 10⁶ 세포/mL입니다. 완전한 RPMI 배양 배지(79% RPMI 배양 배지, 20% 소 태아 혈청, 1% Pen-Strep 항생제)를 37°C 및 5%_CO2에서 유지하고, 3-4일마다 계대배양한다.
   2. 120 x g에서 8분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후, 상청액을 버리고, 세포 펠릿을 1mL의 완전한 RPMI 배양 배지에 재현탁시키고, 잘 혼합한다(이 용액을 현탁액 A라고 함).
2. 계수를 위한 세포 현탁액 준비
   1. 2 μL의 세포 현탁액 A를 8 μL의 배양 배지와 혼합하여 희석된 세포 현탁액 B를 제조한다. 현탁액 B에 0.4% 트리판 블루 10μL를 추가하여 현탁액 C를 얻습니다.
3. 혈구계를 사용한 세포 계수
   1. 혈구계에 유리 커버슬립을 놓고 현탁액 C 10μL를 로드합니다. 혈구계를 광학 현미경 아래에 놓고 40x 현미경 대물렌즈를 사용하여 혈구계 챔버의 4개 사분면 각각에서 파란색으로 염색되지 않은 세포 수를 계산합니다(그림 1).
   2. 트리판 블루는 죽은 세포를 파란색으로 염색합니다. 이러한 세포나 각 혈구계 사분면의 위쪽, 아래쪽, 오른쪽 또는 왼쪽 경계에 닿는 세포는 계산하지 마십시오.
   3. 다음 공식을 사용하여 mL 당 세포 농도를 계산하십시오.
      
      참고 : 계산 된 사분면의 수는 4 개이며 ^10-4mL 는 혈구 측정기의 사각형 부피입니다. 계산해야 하는 4개의 사분면은 그림 1에서 녹색으로 표시됩니다. 수식에서 계산된 총 셀 수는 1, 2, 3 및 4 사분면에 있는 셀 수의 합계입니다. 그림 1 에서 파란색으로 표시된 셀은 계산해야 하지만 빨간색으로 표시된 셀은 사분면의 위쪽, 오른쪽, 아래쪽 또는 왼쪽 테두리에 닿기 때문에 계산해서는 안 됩니다.

그림 1: 혈구계 챔버를 사용한 세포 계수. 4 개의 사분면은 광학 현미경을 사용하여 계산됩니다. 이 사분면은 녹색으로 표시됩니다. 여기에 설명된 프로토콜의 단계 1.3.3에 표시된 공식에서 계수된 총 세포 수는 사분면 1, 2, 3 및 4에 있는 세포 수의 합입니다. 파란색으로 표시된 셀은 계산해야 하지만 빨간색으로 표시된 셀은 사분면의 위쪽, 오른쪽, 아래쪽 또는 왼쪽 테두리에 닿기 때문에 계산해서는 안 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 문화를위한 접시 준비

1. 부피의 세포 현탁액 A를 15mL 원뿔형 튜브에 넣습니다. 필요한 부피는 셀 수에 따라 다릅니다. 세포 수가 100mm 배양 플레이트에 대해 대략 2.2 x 10⁶ 세포가 되도록 부피를 조정합니다.
2. 5mL의 완전한 배양 배지를 튜브에 추가한 다음 튜브의 내용물을 100mm 배양 플레이트로 옮깁니다. 80μL의 디메틸설폭사이드(DMSO)를 배양 플레이트에 추가합니다.
   알림: DMSO는 빛에 민감하므로 내광성 용기에 보관하거나 알루미늄 호일과 같은 불투명 한 재료로 덮어야합니다.
3. 350 μL의 1 mg/mL 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)를 튜브에 추가합니다. PMA의 최종 농도는 35ng/mL이어야 하고 DMSO의 최종 농도는 0.08%여야 합니다.
   주의 : PMA는 독성, 부식성 및 발암 성이므로 극도의주의를 기울여 취급해야합니다. PMA는 빛에 민감하므로 내광성 용기에 보관하거나 알루미늄 호일과 같은 불투명 한 물질로 덮어야합니다.
4. 총 부피가 10mL가 되도록 배양액 4.27mL를 추가합니다. 튜브의 내용물을 기울여 혼합한 다음 내용물을 100mm 배양 플레이트로 옮깁니다. 플레이트를 37°C, 5%_CO2에서 5일 동안 세포 배양 배양기에 방치한다.

3. 엡스타인-바 바이러스 입자의 유도 및 분리

1. 인큐베이터에서 5일 후, 플레이트의 내용물을 120 x g 에서 8분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화한다. 무세포, 바이러스-함유 상청액을 수집하고 세포 펠릿을 폐기한다.
2. 상청액을 16,000 x g 에서 4°C에서 90분 동안 원심분리하여 바이러스 입자를 펠릿화합니다. 상청액을 버리고 바이러스 펠릿을 5mL의 배양 배지에 재현탁시킵니다.
   알림: 인산염 완충 식염수(PBS)를 사용하여 배양 배지 대신 바이러스 펠릿을 재현탁할 수 있습니다.
3. 수득한 바이러스 현탁액을 각각 250μL의 바이러스 현탁액을 함유하는 20개의 튜브로 분취한다. 현탁액을 -80°C에서 보관한다.

4. 바이러스 입자에서 DNA 추출

주의 : 페놀은 독성과 부식성이 있으며 심각한 화상을 입을 수 있으므로 취급 할 때는 각별히주의해야합니다. 페놀은 빛에 민감하며 빛이나 공기와 접촉하면 산화됩니다. 내광성 용기에 보관하거나 알루미늄 호일과 같은 불투명 한 물질로 페놀 튜브를 덮으십시오.

1. DNA에서 단백질 분리
   1. 500μL 튜브 중 하나에 250μL의 TrisCl 포화 페놀을 추가합니다. 100 μL의 물 (수성 상의 부피를 증가시키기 위해)을 첨가하고 잘 와동시켜 분홍색 에멀젼을 얻는다. 9650 x g에서 15분 동안 원심분리합니다.
2. DNA 침전
   1. 상청액(투명, 수성 상)을 수집하여 새로운 1.5mL 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다.
   2. 상청액 부피의 1/10에 해당하는 차가운 아세트산나트륨(3M, pH 5.2)을 넣고 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다. 20mg/mL 글리코겐 1μL를 넣고 피펫팅으로 혼합합니다.
      참고: 이 단계는 선택 사항이지만 글리코겐을 추가하면 DNA 침전이 향상되고 DNA 펠릿을 더 쉽게 시각화할 수 있습니다.
   3. 상청액의 차가운 100 % 에탄올 부피의 3 배를 첨가하십시오. -80°C에서 밤새 보관하십시오.
      참고: 이 절차는 나중에 다시 시작하기 위해 여기에서 중지할 수 있습니다. 샘플은 -80°C에서 1시간 동안 또는 대안적으로 밤새 보관할 수 있습니다. 하룻밤 보관은 DNA 침전을 향상 시키므로 권장됩니다.
3. 바이러스 DNA 분리
   1. 다음날, 4°C에서 15분 동안 9650 x g 에서 원심분리하고, 상층액을 버리고 DNA 펠렛을 얻었다.
   2. 펠릿을 차가운 70% 에탄올 1mL로 3회 세척하고 9650 x g 에서 15분 동안 원심분리한 후 상층액을 버립니다.
   3. 펠릿을 약 10분 동안 자연 건조시킵니다. 10-50 μL의 뉴클레아제가 없는 증류수에 펠릿을 재현탁합니다(DNA 펠릿의 크기에 따라 다름).
   4. 나중에 처리를 위해 샘플을 -20 ° C에서 보관하거나 최대 DNA 용해를 보장하기 위해 밤새 4 ° C에서 보관 한 다음 -20 ° C에서 보관하십시오. 또는 5단계로 직접 진행합니다.

5. DNA 농도 및 순도 확인

1. 섬세한 작업 와이퍼로 마이크로 분광 광도계의 받침대를 청소 한 후 1 μL의 DNA 제제를로드합니다.
2. 샘플의 DNA 농도에 유의하십시오. 와 의 흡광도 비율을 모두 확인하십시오. DNA는 260nm에서, 단백질은 280nm에서, 페놀과 같은 유기 물질은 230nm에서 흡수합니다. 1.8-2의 비율은 실시간 PCR에 충분한 것으로 간주됩니다.

6. 실시간 중합효소연쇄반응에 의한 정량화

1. PCR 반응 혼합물의 제조
   1. 5 μL의 SYBR 녹색 실시간 PCR 혼합물을 0.2 mL PCR 튜브에 넣습니다. 각 튜브에 1μL의 7.5pmol/μL 정방향 프라이머와 1μL의 7.5pmol/μL 역방향 프라이머를 추가합니다. 순방향 프라이머 서열: 5'-CCCTAGTGGTTTCGGACA-3'; 역 프라이머 서열 : 5'- ACTTGCAAATGCTCTAGGCG-3'. EBV 게놈 복제 수를 결정하기 위해 증폭 된 유전자는 엡스타인-바 바이러스 작은 RNA 2 (EBER-2) 유전자입니다.
   2. 튜브 중 하나에 2μL의 뉴클레아제가 없는 물과 1μL의 4단계의 바이러스 DNA를 추가합니다. 반응 혼합물의 총 부피는 10 μL이다.
      알림: 샘플의 DNA 농도에 따라 희석 단계가 필요할 수 있습니다. 희석 계수 F에 유의해야하며 6.3 단계에서 공식에 통합됩니다.
   3. 알려진 EBV 게놈 복제 번호(1000, 2000, 5000, 10,000 및 54,000 사본)를 가진 표준으로 사용할 다른 튜브를 준비합니다.
2. PCR 혼합물을 95°C에서 5분 동안 활성화하는 초기 단계부터 시작하여 95°C 및 58°C에서 각각 15초 및 30초 동안 40사이클(어닐링)하여 실행합니다.
3. 표준 튜브당 EBV 게놈 사본 수의 로그에 대해 표준물질의 Ct 값을 플로팅하여 qPCR 표준 곡선을 생성합니다. 표준 곡선 플롯 방정식을 사용하여, 유도된 바이러스 DNA를 포함하는 PCR 튜브 내의 EBV 게놈 카피의 수를 도출한다. 그런 다음 다음 공식을 사용하여 유도 된 바이러스 제제의 농도를 계산하십시오.
   
   여기서 X는 표준 곡선에서 파생된 EBV 게놈 사본의 수이고 F는 PCR 반응당 활용되는 DNA를 설정하는 데 사용되는 희석 계수입니다.

7. 바이러스 입자의 생물학적 활성/감염성 확인

1. BC-3 세포를 80% 컨플루언시의 100mm 배양 플레이트에서 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. P3HR-1 세포의 파종 밀도는 1 x 10⁶ 세포/mL입니다. 완전한 RPMI 배양 배지(79% RPMI 배양 배지, 20% 소 태아 혈청, 1% Pen-Strep 항생제)를 37°C 및 5%_CO2에서 유지하고, 3-4일마다 계대배양한다.
2. BC-3 세포를 계수하는 것은 P3HR-1 세포와 동일한 방법으로 1단계를 수행하여 계수하였다. 96웰 플레이트에 각 웰에 10개의⁵ BC-3 셀을 추가합니다. 3개, 6개, 9개 또는 12개의 웰을 사용하여 결과의 중요성을 보장하고 오류를 최소화합니다.
3. 단계 6.3에서 결정된 바이러스 제제의 농도에 따라 각 웰에 부피의 바이러스 스톡을 추가합니다. MOI는 다양할 수 있으며 이 프로토콜을 최적화하면 감염에 가장 적합한 MOI가 나타납니다(MOI 범위 2-50 권장). 각 웰에 존재하는 혼합물의 총 부피가 250μL인지 확인하십시오.
   1. 필요한 부피를 결정하려면 바이러스 주식의 농도를 알아야하며 MOI를 선택해야합니다. 예를 들어, MOI가 2이면 추가되는 바이러스 입자의 수는 세포 수의 두 배가되어야합니다. 공식을 사용하여 필요한 바이러스 스톡의 부피 V 를 계산하십시오 : n은 필요한 바이러스 입자의 수이고 C는 바이러스 스톡의 알려진 농도입니다.
4. 96-웰 플레이트의 내용물을 5일 동안 배양한다. 5일 후 각 웰의 내용물을 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
5. 튜브를 120 x g 에서 8분 동안 원심분리하여 바이러스 함유 배양 배지에서 세포를 분리합니다. 세포 펠릿과 상청액을 DNA 추출 후 실시간 PCR 정량화하여 각 분획에 바이러스 게놈이 있는지 확인하여 바이러스 입자의 감염성을 평가합니다.

결과

이 절차의 목표는 알려진 바이러스 역가를 가진 현탁액에서 EBV 입자를 분리하여 나중에 EBV 감염을 모델링하는 데 사용할 수 있도록 하는 것입니다. 따라서 절차에서 가장 높은 EBV 수율을 얻기 위해 다양한 시약의 최적 농도를 사용하는 것이 가장 중요합니다.

가장 많은 수의 EBV 입자를 생성하는 PMA 및 DMSO의 농도를 결정하기 위해 최적화 시험이 수행되었습니다(

토론

EBV 입자의 생산은이 바이러스의 생물학 및 관련 질병을 이해하는 데 필요합니다. 여기에서는 P3HR-1 세포주에서 이러한 입자의 생산에 대해 설명했습니다. 이 세포주는 유일한 EBV 생산자 계통이 아닙니다. 실제로 EBV 입자는 B95-8 세포^21,22 및 Raji 세포 주^18,19에서도 분리되었습니다. EBV 용균 주기는 n-부티레이트?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL thin-walled PCR tubes	Thermo Scientific	AB0620	Should be autoclaved before use
0.2-10 µL Microvolume Filter Tips	Corning	4807	Should be autoclaved before use
0.5-10 µL Pipette	BrandTech	704770
10 mL Disposable Serological Pipette	Corning	4488
1000 µL Filtered Pipette Tips	QSP	TF-112-1000-Q
100-1000 µL Pipette	Eppendorf	3123000063
100x20 mm Cuture Plates	Sarstedt	83.1802
10-100 µL Pipette	BrandTech	704774
15 mL Conical Tubes	Corning	430791
200 µL Filtered Pipette Tips	QSP	TF-108-200-Q
20-200 µL Pipette	Eppendorf	3123000055
50 mL Conical Tubes	Corning	430828
CFX96 Real-Time C-1000 Thermal Cycler	Bio-Rad	184-1000
DMSO	Amresco	0231
DNase/RNase Free Water	Zymo Research	W1001-1
EBER Primers	Macrogen	N/A	Custom Made Primers
EBV DNA Control (Standards)	Vircell	MBC065
Ethanol (Laboratory Reagent Grade)	Fischer Chemical	E/0600DF/17
Fetal Bovine Serum	Sigma	F9665
Fresco 21 MicroCentrifuge	Thermo Scientific	10651805
Glycogen Solution	Qiagen	158930
Hemocytometer	BOECO	BOE 01
Inverted Light Microscope	Zeiss	Axiovert 25
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5121
Microcentrifuge Tube	Costar (Corning)	3621	Should be autoclaved before use
P3HR-1 Cell Line	ATCC	HTB-62
Penicillin-Streptomycin Solution	Biowest	L0022
Phenol	VWR	20599.297
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma-Aldrich	P8139
Pipette Filler	Thermo Scientific	9501
Precision Wipes	Kimtech	7552
RPMI-1640 Culture Medium	Sigma	R7388
SL 16R Centrifuge	Thermo Scientific	75004030
Sodium Acetate	Riedel-de Haën (Honeywell)	25022
Spectrophotomer	DeNovix	DS-11
Tris-HCl	Sigma	T-3253
Trypan Blue Solution	Sigma	T8154
Water Jacketed CO2 Incubator	Thermo Scientific	4121