Harwell 및 Beamline VMXi의 결정화 시설을 사용한 결정화 및 현장 실온 데이터 수집, Diamond Light Source

요약

당사는 Harwell의 Research Complex에 있는 결정화 시설을 사용하여 단백질의 결정화를 위한 프로토콜을 제시하고 Diamond의 Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi) 빔라인에서 플레이트 내의 결정으로부터 후속 in situ X선 결정학 데이터 수집을 제시합니다. 시료 요구 사항, 결정화 프로토콜 및 데이터 수집 지침에 대해 설명합니다.

초록

Harwell의 결정화 시설을 사용한 로봇 단백질 결정화 프로토콜과 Diamond Light Source beamline VMXi의 결정화 플레이트에서 현장 실온 데이터 수집에 대해 설명합니다. 이 접근 방식을 사용하면 여러 결정에서 고품질 실온 결정 구조를 간단한 방식으로 결정할 수 있으며 결정화 시험 결과에 대한 매우 빠른 피드백을 제공할 뿐만 아니라 연속 결정학을 가능하게 합니다. 단백질 구조, 리간드 결합 및 역학을 이해하는 데 있어 실온 구조의 가치는 구조 생물학 커뮤니티에서 점점 더 인정받고 있습니다. 이 파이프라인은 여러 가지 사용 가능한 액세스 모드를 통해 전 세계 사용자가 액세스할 수 있습니다. 설정된 결정화 실험은 기계 학습 도구를 사용하여 자동으로 식별된 결정으로 원격으로 이미지화하고 볼 수 있습니다. 데이터는 플레이트에서 사용자가 선택한 결정에서 최대 60° 회전 데이터 세트가 있는 대기열 기반 시스템에서 측정됩니다. 특정 웰 또는 샘플 그룹 내의 모든 결정의 데이터는 xia2.multiplex를 사용하여 자동으로 병합되며, 출력은 웹 브라우저 인터페이스를 통해 직접 액세스할 수 있습니다.

서문

X선 결정학은 단백질 구조와 기능을 이해하기 위한 핵심 도구로, 단백질 또는 복합체의 고분해능 구조와 기질 또는 약물 후보 물질을 제공합니다. 그러나, 많은 경우에, 바람직한 특성(회절이 심하고, 침지가 가능한 결정 형태이며, 쌍둥이와 같은 결정 병리학이 없는)을 갖는 결정을 얻는 것은 상당한 병목 현상으로 남아 있다¹. 단백질 결정을 생성하기 위한 적절한 화학적 조건은 일반적으로 예측할 수 없기 때문에 수천 가지의 잠재적 화학 혼합물을 탐색하는 결정화 스크리닝이 표준이며, 종종 자동화/로봇 공학의 도움을 받아 모니터링을 위한 스크린 및 크리스탈 호텔을 모니터링하고, 종종 원격으로 결정화 드롭 이미지를 모니터링합니다.

결정이 나타나면 일반적으로 나일론 또는 Kapton 루프를 사용하여 결정화 환경에서 수확한 다음 액체 질소에 담그기 전에 동결 방지제가 포함된 액적(검색은 추가 변수임)으로 옮겨야 합니다. 결정화와 X선 데이터 수집 사이의 이러한 추가 단계에는 밀봉된 환경이 파괴될 때 결정화 방울의 탈수, 취급 시 결정에 가해지는 기계적 응력, 동결 보호제에서 결정 격자에 대한 손상(일반적으로 모자이크 확산 증가)이 포함될 수 있습니다². 또한 결정 채취는 시간과 노동 집약적이며, 특히 채취 과정에서 입자에 피부가 형성될 때 시료 간에 불균일성이 발생할 수 있습니다. VMXi 빔라인은 플레이트에 부착된 크리스탈에서 사용 가능한 데이터에 액세스할 수 있도록 하며, 그렇지 않으면 데이터 수집을 위해 폐기됩니다.

대부분의 X선 결정 구조는 위의 접근 방식을 사용하여 100K에서 측정되므로 간단한 결정 수송 및 취급이 가능하고 X선 빔의 결정 수명이 수십 배로 늘어납니다. 그러나 비극저온 조건, 즉 단백질 기능 ^2,3,4와 관련된 생리학적 조건에 훨씬 더 가까운 구조를 결정하는 데 관심이 증가하고 있습니다. 이를 통해 단백질의 동적 구조를 훨씬 더 잘 이해할 수 있고, 아미노산 형태 또는 루프가 기능적으로 관련이 없는 상태로 얼어붙는 것을 방지할 수 있으며⁵, 리간드 결합을 세포와 유기체 내 단백질의 자연 환경에 훨씬 더 가까운 조건에서 탐색할 수 있습니다⁶.

영국 Diamond Light Source 싱크로트론의 Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi) 빔라인에서 구현된 대안적인 접근법은 결정이 성장한 환경(즉, 결정화 플레이트 내) 내에서 주변 조건 하에서 방해 없이 결정에서 직접 회절 데이터를 측정하는 것입니다 ^7,8. 이를 통해 결정화 스크린 및 최적화에서 매우 빠른 피드백을 통해 사용자가 요구 사항에 맞는 최적의 결정 형태를 찾을 수 있도록 안내할 수 있습니다. 또한 고품질 실온 구조물을 자동화된 방식으로 생산할 수 있다⁹.

이 프로토콜은 사용자가 결정화 준비가 된 고순도 단백질 샘플을 가지고 있다고 가정합니다. 단백질 결정을 생산한 다음 데이터 수집을 위해 빔라인 VMXi를 사용하기 위해 Harwell의 결정화 시설에 액세스하는 사용자 경험을 설명합니다(그림 1).

Harwell의 결정화 시설

Harwell(CF)의 결정화 시설은 Diamond Light Source에 인접한 Harwell(RCaH)의 Research Complex에 있습니다. 이 시설은 결정화 스크리닝, 결정 최적화, 결정 이미징 및 특성화를 위해 로봇 공학을 사용하여 고분자 결정화를 위한 고처리량 자동화 실험실을 사용자에게 제공합니다. 고도로 자동화된 VMXi 빔라인과의 긴밀한 통합을 통해 실온 구조 결정 속도가 크게 빨라졌으며 비극저온 조건에서 새로운 단백질 구조, 단백질-리간드 및 DNA-리간드 복합체의 특성 분석과 자동화된 단편 스크리닝(그림 1)이 가능합니다.

CF 파이프라인은 용해성 및 막 단백질의 결정^{화를 위한 나} 노리터 결정화 로봇9, 상업용 결정화 스크린 및 복잡한 맞춤형 최적화 스크린을 준비하기 위한 액체 처리 로봇, 결정화 플레이트의 이미징을 위한 4개의 이미징 장비(4°C에서 1개, 20°C에서 3개)를 포함하는 계측 제품군입니다( 재료 표 참조).). 이미저 1개는 지질 입방상(LCP) 유리판을 이미징할 수 있고 이미저 1개에는 다중 형광 광학 장치(둘 다 20°C)가 장착되어 있습니다.

이 시설은 현재 MPL(Membrane Protein Laboratory; https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/MPL.html), XChem 단편 스크리닝 설비( ¹⁰), MX 빔라인, XFEL-허브, 및 로잘린드 프랭클린 연구소(RFI)도 포함된다. 이 잘 정립되고 최적화된 파이프라인은 광범위한 구조 생물학 프로젝트에서 결정화 실험을 수행할 수 있게 해주었습니다. 이 백서에서는 VMXi에서 데이터 수집을 위한 크리스털의 파이프라인에 대해 설명하지만, 크리스털을 수확하여 극저온 냉각하거나 XChem 파이프라인으로 보낼 수도 있습니다.

사용자 액세스는 Diamond MX 제안 시스템(https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Synchrotron-Access.html)을 통해 할당되며 산업 사용자는 Diamond Industry Liaison 그룹을 통해 지원됩니다. 모든 사용자는 손으로 운반할 수 있는 샘플 또는 플레이트를 가지고 현장에 올 수 있습니다. 우리의 경험에 따르면 방울이 분배된 위치에서 멀어지거나 결정화 저장소에 의해 방울이 손상될 수 있으므로 택배로 플레이트를 보내는 것은 권장하지 않습니다. 또는 협의에 따라 사용자가 단백질 샘플을 CF로 보낼 수 있으며, CF에서 직원이 대신 결정화 실험을 설정할 수 있습니다. 실험은 사용자가 Rock Maker Web(CF의 경우) 또는 ISPyB(VMXi의 경우)에 로그온하여 원격으로 모니터링할 수 있습니다. CF에 대한 접근은 Diamond에서 수집된 X선 회절 결과를 기반으로 반복적인 방식으로 수행될 수 있습니다.

다이아몬드 광원의 빔라인 VMXi

Beamline VMXi(이하 "빔라인"이라고 함)는 적절한 결정화 플레이트 내의 결정에서 데이터를 측정하는 데 중점을 둔 실온의 고도로 자동화된 X선 결정학 전용으로 최근에 개발된 고유한 기기입니다. 빔라인은 ~2 ×^{10 13} photons/s(16 KeV에서)7의 높은 플럭스와 함께 마이크로 초점(10 x 10 μm), 분홍색 빔(<5 × ^10-2ΔE/E의 대역 통과)^을 제공합니다. 이 고플럭스 빔은 고속 검출기와 결합되어 매우 높은 시료 처리량과 10μm 이상의 시료에서 데이터 수집을 가능하게 합니다.

결정화 플레이트는 샘플 저장 시스템에 저장되고 ISPyB¹¹ 인터페이스 SynchWeb¹²를 사용하여 플레이트를 등록하는 동안 사용자가 제공한 일정에 따라 이미징되어 빔라인으로 들어갑니다. 일반적으로 사용자는 이미징을 위해 피보나치 시점 시퀀스를 선택하는 것이 좋습니다(0, 12, 24, 36, 60... 시스템에 들어가는 플레이트로부터 7,320시간). 플레이트가 이미지화되면 사용자에게 이메일로 알림이 전송됩니다. 가시광선과 UV 광선 이미징 모두 사용자가 필요에 따라 사용할 수 있습니다. 샘플 저장 시스템에서 촬영한 이미지는 기계 학습 알고리즘에 의해 분석됩니다. 이렇게 하면 크리스탈과 유사한 개체의 관심 영역을 자동으로 찾아 정의하고 사용자가 데이터 수집을 위해 큐에 추가할 수 있도록 관심 영역을 등록합니다. 또한 사용자는 가시광선 이미지를 수동으로 클릭하여 관심 지점을 등록하거나 래스터 스캔으로 분석할 영역을 클릭하고 드래그할 수 있습니다. 이러한 포인트는 사용자가 자동으로 찾은 포인트와 함께 대기열에 추가할 수 있습니다.

모든 샘플에 데이터 수집을 위한 적절한 파라미터가 있으면 플레이트가 대기열에 들어갑니다. 플레이트가 대기열의 맨 위에 도달하면 자동으로 빔라인에 분배됩니다. 결정화 플레이트는 로봇 팔에 의해 크리스탈 호텔에서 빔라인으로 자동으로 로드되며, 이미지 매칭 후 사용자 정의 지침에 따라 선택한 각 크리스탈에서 최대 60° 회전의 결정학적 데이터 세트를 측정합니다. 플레이트 내의 모든 방울은 빔라인에서 이러한 실험에 사용할 수 있습니다. 데이터는 여러 결정에서 병합되어 자동화된 방식으로 동형, 최적으로 병합된 데이터 세트를 생성합니다 ^7,9. 대기 중인 모든 데이터 세트가 수집되면 다른 Diamond MX 빔라인과 마찬가지로 ISPyB¹¹에서 데이터 세트를 보기 위해 따라야 할 링크가 포함된 이메일이 사용자에게 전송됩니다. 또한 사용자는 빔라인 웹 페이지(https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/VMXi.html)로 이동합니다.

프로토콜

1. Harwell의 결정화 시설을 사용하여 현장 플레이트 내에서 결정 생산

참고: CF에 대한 액세스는 다양한 경로에서 지원되며 프로젝트 및 사용자 유형(교육 또는 산업)의 응용 프로그램에 따라 다릅니다. XChem 및 MPL 프로젝트에는 사용자 관리 시스템(UAS)을 통한 자체 제안서 신청 시스템이 있으며 표준 액세스 경로(iNEXT Discovery 및 EUbOPEN 포함) 또는 BAG 액세스를 통해 제출할 수 있습니다. 아래 프로토콜은 VMXi 사용자에게만 해당됩니다.

1. 제안서 제출 및 방문 준비
   1. 프로젝트에 대한 정보를 BAG 제안서 신청서에 제공하거나 활성 BAG 제안서에 추가합니다. 일반적으로 서류 작업을 조직하는 BAG 코디네이터가 있습니다. 또는 빔라인에 접근하기 위한 신속한 접근 제안서를 제출하십시오.
   2. 택배 또는 직접 현장에 도착하기 전에 제안서에 대해 샘플이 등록되고 안전성이 검증되었는지 확인하십시오.
   3. 사용자가 등록되어 있는지 확인합니다(FedID 및 비밀번호 사용).
   4. BAG 코디네이터가 UAS의 어소시에이트로 사용자를 MX 제안에 추가했는지 확인합니다.
   5. 빔라인 결정화 샘플 세부 정보 양식을 작성하여 VMXi@diamond.ac.uk 로 보냅니다.
   6. 빔라인 직원과 실험 요구 사항 및 빔라인 가용성에 대해 소통합니다.
   7. 단백질 샘플이 배송되는 경우 사전 협의를 통해서만 샘플을 보내주십시오. 자세한 내용은 섹션 1.2를 참조하십시오.
   8. 사용자가 CF에 결정화 플레이트를 설치하기 위해 현장에 오는 경우 시설 직원에게 시설 기기를 사용할 수 있는 시간대의 가용성을 확인하고 섹션 1.2.1을 따르십시오.
   9. 사용자가 플레이트를 현장으로 가져오는 경우 샘플이 올바른 플레이트 유형으로 분주되었는지 확인하고 결정화 방울을 올바른 위치와 올바른 양에 배치합니다. 섹션 1.2.2를 따르십시오. 빔라인은 특정 in situ 결정화 플레이트(Greiner CrystalQuickX 및 MiTeGen In Situ-1)만 수용합니다. 방울이 200nL보다 크지 않은지 확인하십시오.
2. CF에서 수행된 결정화 실험
   참고: 이 시설은 증기 확산과 같은 다양한 고처리량 고분자 결정화 방법뿐만 아니라 오일 및 LCP에서 배치 결정화를 제공합니다. 70-100 μL의 순수 단백질로 시작하여 100 nL의 단백질 용액과 100 nL의 결정화 저장 용액의 비율을 사용하여 3개의 스크린으로 용해성 단백질에 대한 증기 확산 실험을 수행하고 20°C에서 플레이트를 배양하는 것이 좋습니다. 시설 내에는 여러 개의 상업용 스크린이 설치되어 있습니다. 습도 및 온도 제어는 4 °C 및 20 °C에서 가장 많이 사용됩니다. CF를 방문하는 사용자는 표준화된 교육을 받고 결정화 기기 작동을 지원하며 여기에 설명된 설정을 사용하게 됩니다.
   1. CF에서 설정하기 위한 배송 샘플
      참고: 현장에 도착하기 전에 단백질 샘플은 UAS 시스템 내의 제안서에 대해 검증되어야 합니다. 단백질 샘플이 현장에 도착하면 직원은 사용자와의 이전 커뮤니케이션에서 지시한 대로 결정화 실험을 설정합니다. 확인서는 실험용 결정화 플레이트에 대한 바코드 정보와 함께 이메일을 통해 전송됩니다. 사용자는 결정화 플레이트를 관련 제안서에 용기로 추가하라는 요청을 받게 됩니다. 이 작업이 완료되면 플레이트를 결정화 시설 또는 빔라인의 자동 이미저에 저장할 수 있습니다. ISPyB는 빔라인에서 상호 작용하는 데 사용되는 인터페이스입니다.
      1. 25μL 부분 표본의 배수로 결정화를 위한 농도의 단백질 샘플 용액을 제공합니다. 단백질 샘플이 포함된 샘플 튜브에 명확하게 라벨을 붙입니다.
      2. 필요한 경우 단백질 완충 용액, 리간드 용액 또는 저장소 용액을 제공합니다.
      3. 시설 직원에게 어떤 스크린과 낙하율을 사용해야 하는지 알립니다.
   2. 결정화 플레이트 설정
      참고: Greiner CrystalQuickX 및 MiTeGen In Situ-1 플레이트의 결정화 방울은 특정 위치에 있어야 합니다. 다른 곳에 설치된 접시는 여기에 설명된 다음 Mosquito¹³ 설정을 사용해야 합니다.
      1. MiTeGen In Situ-1에 대한 플레이트 정의를 조정하려면 Mosquito SPT 소프트웨어를 열고 설정 | 96웰 | MiTeGen In Situ-1(96 x 2방울)(그림 2A). 편집 버튼을 클릭하고 하위 웰 2 위치: X 오프셋을 - 1.2로, Y 오프셋을 1.8로, 하위 웰 3 위치: X 오프셋을 1.3으로, Y 오프셋을 1.8로 수정합니다(그림 2B,C).
      2. Greiner CrystalQuickX에 대한 플레이트 정의를 조정하려면 Mosquito SPT 소프트웨어를 열고 설정 | 96 웰 | Greiner CrystalQuickX(그림 2D). 편집 버튼을 클릭하고 하위 웰 1 위치: X 오프셋 을 -1.95 로, Y 오프셋 을 1.45 로, 하위 웰 2 위치: X 오프셋 을 1.95 로, Y 오프셋 을 1.45로 수정합니다(그림 2E,F).

2. 다이아몬드 광원에서 빔라인 사용

알림: 사용자의 빔라인과의 모든 상호 작용은 ISPyB¹¹ 인터페이스를 사용하여 원격으로 수행됩니다. 빔라인에 물리적으로 존재할 필요가 없으며 데이터는 특정 시간에 예약되는 대신 대기열 기반 시스템을 사용하여 수집됩니다. 사용자는 Diamond Light Source 액세스와 관련된 제안서를 갖게 됩니다. 빔라인에서, 각 결정화 플레이트는 고유한 방문이 할당되고 100K에서 샘플을 포함하는 퍽과 유사한 ISPyB⁽¹¹ ) 내의 '용기'로 정의됩니다. 최적화 화면은 SynchWeb 인터페이스를 사용하여 생성할 수 없으므로 정보는 일반적으로 주석 섹션에 추가됩니다(2.1.4단계 참조). 플레이트를 등록하는 개인은 플레이트 소유자가 이미징 및 플레이트 완료 알림에 관한 이메일을 받게 되므로 이메일 주소를 확인해야 합니다.

1. 플레이트 등록
   1. 적절한 Diamond FedID로 ISPyB에 로그인하고 제안을 선택합니다. 스크롤하거나 검색창에 제안서 번호를 입력하여 관심 있는 제안서를 검색합니다. 제안서 번호(그림 3A) 아래의 드롭다운 메뉴에서 배송을 선택하면 해당 제안서의 배송이 포함된 배송 창이 열립니다. 오른쪽 상단의 +발송물 추가(그림 3B)를 클릭하여 새 발송물 추가 창을 열고, 발송물 이름을 지정하고, 자동/이미저를 클릭한 다음, 왼쪽 하단의 발송물 추가 버튼을 클릭합니다(그림 3C).
   2. 배송 창(그림 3D)에서 +컨테이너 추가를 클릭하면 컨테이너 추가 페이지 보기(그림 3E)가 표시됩니다. 컨테이너 유형(Container type ) 드롭다운 메뉴에서 관련 플레이트 유형 중 하나를 선택합니다. 선택한 컨테이너 유형을 반영하도록 페이지가 변경됩니다. 실험 플레이트와 관련된 빔라인 직원의 이메일 지침에 따라 바코드(Barcode ) 및 컨테이너 이름(Container name )을 입력합니다. 대소문자를 구분합니다.
   3. 요청된 이미저 드롭다운 메뉴에서 VMXi 20 °C 이미저를 선택하고, 이미징 일정 드롭다운 메뉴에서 피보나치 이미징 일정을 선택하고, 결정화 화면 드롭다운 메뉴에서 결정화 화면을 선택하고, 소유자 드롭다운 메뉴에서 사용자 이름을 선택하고 보기 버튼을 클릭한 다음 이메일 상자에 올바른 연락처 이메일 주소를 입력합니다(그림 3F).
   4. 설명(Comments) 상자에 플레이트에 대한 추가 세부 정보를 입력합니다. 단백질 드롭다운 메뉴에서 관련 샘플을 선택하고 실험 제안서에 UAS에 등록되고 Diamond가 승인한 약어를 사용합니다. 샘플 이름 상자에 동일한 이름을 입력합니다. 나머지 상자는 비워 둡니다.
   5. +플레이트 아이콘을 클릭하여 전체 플레이트에 샘플을 복제하고 전체 용기를 녹색 사각형으로 채웁니다. 페이지 하단의 +컨테이너 추가를 클릭하여 플레이트를 등록합니다. 빔라인의 직원에게 플레이트를 적절한 이미저로 옮겨 보관 및 이미징하도록 요청합니다. 컨테이너가 이미저에 저장되면 방문이 생성되고 사용자는 플레이트 및 해당 이미지에 대한 링크가 포함된 이메일을 받게 됩니다.
2. 이미징 결과 보기
   1. 관심 있는 제안(2.1.1단계)으로 이동하고, 제안 번호 아래의 드롭다운 메뉴에서 컨테이너를 선택하고, 제안에 사용할 수 있는 컨테이너 목록을 확인합니다. 다른 샘플 홀더 유형이 있는 경우 필터 플레이트를 선택합니다. 검색 범위를 더 좁히려면 내 컨테이너 상자를 선택하여 현재 로그인한 사용자 ID와 연결된 가장 관련성이 높은 컨테이너만 표시합니다. 커서를 개별 줄 위로 이동하고 마우스 왼쪽 버튼을 클릭하여 적절한 컨테이너를 클릭합니다.
   2. 용기를 선택하면 플레이트의 개요를 보여주는 새로운 보기가 표시됩니다(그림 4A). 디스플레이의 왼쪽에 있는 플레이트 표현의 드롭을 클릭하면 해당 드롭의 가장 최근 이미지가 표시됩니다. 화살표 키를 사용하여 드롭 사이를 탐색하거나 마우스/커서를 사용하여 개별 드롭을 선택합니다.
   3. 드롭의 과거 이미지를 보려면 H 버튼을 클릭하고 현재 우물 드롭 이미지 위에 이미지 팝업 갤러리가 나타날 때까지 기다립니다. 개별 이미지 위에 커서를 놓으면 기본 드롭 이미지가 업데이트됩니다.
   4. 0 - 9 버튼을 눌러 각 드롭의 상태를 나타내기 위해 이미지에 점수를 매깁니다. 개별 카테고리를 보려면 드롭 이미지의 왼쪽 상단에 있는 드롭다운 메뉴 점수 를 엽니다. 각 드롭 이미지에서 파란색 십자가를 찾으는데, 이는 이미지 내에서 "결정"을 찾도록 훈련된 알고리즘(CHiMP)의 결과입니다.
   5. 드롭 이미지의 오른쪽 상단에 있는 Measure 라는 세 번째 아이콘 버튼을 클릭하여 측정 도구에 액세스합니다. 이 도구를 사용하려면 선을 클릭하고 드래그하면 눈금자가 확장되어 μm 단위로 거리를 제공합니다.
   6. 추가 이미징 세션을 요청하려면 페이지 하단의 작업 제목 옆에 있는 드롭다운 상자에서 표시 또는 UV를 클릭합니다. 그런 다음 Request Plate Imaging 버튼을 클릭합니다.
3. 크리스탈 셀렉션/CHiMP
   1. 데이터 수집을 위한 포인트를 수동으로 추가하려면 +마크 포인트 버튼을 누릅니다. 원하는 관심 영역 위에 커서를 놓고 선택합니다. 적십자가 나타날 때까지 기다립니다.
      참고: 드롭당 최대 100개의 개체를 만들 수 있습니다.
   2. 모든 포인트가 표시되면 +마침 버튼을 클릭합니다. 물체를 측정하기 전에 +마침 버튼을 클릭하는 것도 잊지 마십시오. 그리드 스캔을 통해 데이터 수집을 위한 영역을 추가하려면 +영역 표시 버튼을 클릭합니다. 왼쪽 상단 지점을 클릭하고 아래쪽과 오른쪽으로 드래그하여 빔라인에서 래스터 스캔할 영역을 만듭니다. 포인트와 마찬가지로 원하는 모든 영역이 생성되면 +마침 버튼을 클릭합니다.
      참고: 여러 개의 작은 영역보다 하나의 큰 영역을 만드는 것이 좋습니다.
   3. 낙하 이미지에 이미 있는 파란색 십자가를 관찰할 수 있는데, 이는 결정질 물체(CHiMP)를 자동으로 찾도록 설계된 알고리즘의 결과입니다. 결정화 방울에 대한 CHiMP 평가를 시각화하려면 자동 점수 표시 확인란을 클릭한 다음 클래스에 대한 드롭다운 메뉴를 변경합니다. 일반적으로 여기서 가장 유용한 설정은 크리스털 옵션입니다(그림 4B).
      참고: 이것은 새로운 기능이며 모든 크리스탈을 찾을 수 있다는 보장은 없으며 크리스탈이 아닌 다른 물체를 찾을 수도 있습니다.
   4. 모든 포인트와 지역이 각 드롭에 표시되었으면 페이지 하단의 데이터 수집 준비 버튼을 클릭합니다.
4. 데이터 수집을 위한 샘플 준비
   1. 이전 단계에서 선택했거나 자동으로 찾은 점 또는 영역이 포함된 샘플 목록을 관찰합니다(그림 4C). + 버튼을 눌러 개별 포인트 또는 영역을 추가하거나 현재 페이지를 대기열에 추가 버튼을 클릭하여 표시된 모든 샘플을 추가합니다.
   2. 필터는 포인트(Point), 리전(Region), 자동 포인트(Auto points) 또는 수동 포인트(Manual points)만 표시하는 데 사용할 수 있습니다. 촬영되지 않은(즉, X선에 노출된) 샘플만 표시하려면 필터 버튼 위에 있는 데이터 없음 및 완료되지 않음 옵션을 클릭합니다.
   3. 각 라인을 클릭하여 개별 샘플을 선택하고 화면 오른쪽의 이미지를 업데이트하여 올바른 드롭과 개별 포인트를 표시합니다. 목록에 샘플이 많은 경우 드롭다운 메뉴를 선택하여 페이지당 표시되는 샘플 수를 늘리고 기본적으로 10개를 선택하고 표시되는 최대 샘플 수로 최대 100 개를 늘립니다.
   4. 모든 포인트와 지역이 대기열에 추가되면 모든 실험 데이터 수집 매개변수가 각 실험과 연결되어 있는지 확인합니다.
      1. 포인트(Point), 리전(Region), 수동(Manual) 및 자동(Auto)에 필터를 사용합니다. 포인트(Point) 필터를 클릭하고 필터 버튼 아래에 있는 모두 선택(Select all) 확인란을 클릭하여 현재 대기 중인 샘플(Queued Samples) 목록에 표시되는 모든 샘플에 파라미터를 동시에 적용합니다.
      2. 드롭 사진 아래 화면 오른쪽에 있는 드롭다운 메뉴에서 실험 매개변수를 선택합니다(그림 4D). 지역의 경우 그리드 스캔 DMM 10미크론 단계, 100% 전송 옵션을 선택합니다. 다른 모든 포인트 실험의 경우 드롭다운 메뉴에서 다른 옵션을 적절하게 선택합니다.
      3. 진동 데이터 수집의 경우 Omega Scan DMM 60도 5% 투과 옵션을 클릭하여 개별 샘플에서 최대 데이터 양을 수집합니다. 매우 작은 결정 또는 방사선에 민감한 샘플에 대해 작은 회전을 적용하고 특정 결정 형태에 대한 이전 경험에 따라 투과율을 변경합니다. 모든 샘플에 실험 파라미터가 올바르게 적용되면 페이지 하단의 Queue Container 버튼을 클릭합니다.
   5. 플레이트가 대기열의 맨 위에 도달하면 빔라인에 제시되고 데이터 세트가 수집된 다음 빔라인 내의 샘플 저장소로 다시 돌아갑니다. 플레이트에서 데이터 수집이 완료되면 관련 데이터에 액세스하기 위해 따라갈 수 있는 링크가 포함된 이메일을 찾습니다.
5. 샘플 그룹 만들기
   참고: 샘플 그룹은 여러 방울 또는 플레이트에 걸쳐 유사한 샘플을 그룹화하기 위해 만들 수 있습니다. 이 샘플 그룹 내의 모든 데이터 세트는 DIALS에서 처리된 후 xia2.multiplex¹⁴ 파이프라인을 사용하여 처리됩니다. 이는 매우 작은 데이터 웨지를 많이 수집할 때 유용할 수 있으며 리간드 결합 실험을 위한 신호 대 잡음비를 증가시키는 데에도 유용할 수 있습니다.
   1. 제안서 번호 아래의 드롭다운 메뉴에서 Sample Group Management(샘플 그룹 관리)를 선택합니다. 다른 사용자가 이미 만든 그룹 목록을 찾습니다. 새 그룹을 생성하려면 +샘플 그룹 만들기 버튼을 클릭합니다. 샘플 그룹 생성 페이지의 드롭다운 메뉴에서 발송물을 클릭하여 샘플 뷰어를 확인합니다(그림 5A). 채워진 목록에서 관련 샘플이 들어 있는 컨테이너를 클릭합니다.
   2. 용기를 클릭하면 플레이트 개요를 보여주는 그래픽을 찾습니다.
   3. 개별 드롭을 클릭하여 개별적으로 드롭을 클릭하거나(그림 5B) 관련 행 문자 또는 열 번호를 클릭하여 행 또는 열에서 드롭을 클릭합니다. 개별 그룹과 연관된 모든 웰을 선택했으면 샘플 그룹 이름(Sample Group Name ) 상자에 그룹 이름을 입력하고 샘플 그룹 저장(Save Sample Group ) 버튼을 클릭합니다. 이 페이지에서 View Sample Groups(샘플 그룹 보기 ) 버튼을 클릭하면 제안서와 관련하여 이미 생성된 샘플 그룹 목록으로 돌아갑니다(그림 5C).
6. 샘플 그룹 편집
   1. Sample Group Management 페이지의 그룹 목록에서 Sample Group을 클릭합니다.
   2. 그룹 정보 아래에 나타나는 컨테이너 옆에 있는 +샘플 그룹 편집 버튼을 클릭합니다(그림 5C).
   3. 플레이트 개요에 강조 표시된 샘플 그룹과 이미 연관된 방울을 관찰합니다.
   4. 이전과 같이 drops, wells 또는 columns를 클릭하여 샘플 그룹에 drop을 더 추가합니다.
      참고: 샘플 그룹에서 방울을 제거할 수 없습니다.
   5. 드롭이 추가되면 Sample Group Name 을 편집한 다음 저장하거나 Save Sample Group 버튼을 클릭하여 저장하면 됩니다.
7. 시료 그룹의 출력 시각화 및 분석
   1. 샘플 그룹 목록에서 개별 그룹을 클릭하면 그룹과 연관된 용기의 플레이트 개요가 표시됩니다. 그룹에 포함된 방울이 이 디스플레이에서 강조 표시됩니다(그림 5D).
   2. 이 그룹에서 데이터가 수집된 경우 시간순으로 마지막 세 개의 멀티플렉스 작업이 포함된 목록을 찾습니다.
   3. 멀티플렉스 실행에 대한 줄을 클릭하여 아래 처리 결과를 업데이트합니다.
   4. 그룹과 연결된 데이터 세트의 수를 표시하는 빠른 링크 단추를 관찰합니다. 이 단추를 클릭하면 개별 데이터 집합 컬렉션이 표시되는 새 데이터 컬렉션 페이지가 열립니다.

3. 자동 데이터 처리에 대한 액세스

참고: 데이터가 수집되면 여러 자동 데이터 처리 파이프라인을 통해 전달됩니다. Diamond의 MX 빔라인에 사용되는 4개의 표준 파이프라인도 빔라인에서 수집된 데이터를 기반으로 실행됩니다. 'fast_dp', 'xia2 다이얼', 'xia2 3dii' 및 '^autoPROC'15입니다. 'fast_dp'는 품질을 신속하게 평가하기 위해 빠른 데이터 축소를 제공합니다. 다른 세 개의 파이프라인은 더 많은 계산 시간이 필요하며 비교를 위해 다양한 데이터 축소 소프트웨어 패키지를 실행합니다. 따라서 출력은 일반적으로 'fast_dp' 출력보다 더 높은 품질입니다. 빔라인에서 수집된 데이터 세트는 자동 다결정 병합 소프트웨어 'xia2.multiplex'14를 통해 실행되며, 이 소프트웨어는 정의된 그룹 내의 모든 데이터 세트를 병합합니다. 그리드 스캔은 현재 자동으로 처리되지 않지만 'xia2.ssx' 파이프라인을 사용하여 데이터를 수동으로 처리할 수 있습니다. 자동 처리 파이프라인의 결과는 다음 프로토콜을 사용하여 ISPyB¹¹에서 찾을 수 있습니다.

1. 데이터셋 찾기
   1. 위에서 설명한 대로 ISPyB에 로그인하고 Proposals(제안)를 선택합니다.
   2. 스크롤하거나 검색창에 제안서 번호를 입력하여 관심 있는 제안 서를 검색합니다.
   3. 화면에 나타나는 목록에서 원하는 방문 을 클릭하여 해당 방문에 대한 데이터 수집 창에 액세스합니다.
   4. 원하는 필터를 적용합니다.
      참고: 널리 사용되는 필터는 '자동 통합' 필터로, 하나 이상의 처리 파이프라인을 통해 성공적으로 실행된 데이터 세트만 표시합니다. 그리드 스캔은 현재 ISPyB를 통해 자동으로 처리되지 않으므로 제외됩니다.
   5. 페이지를 아래로 스크롤하여 관심 있는 데이터 세트를 찾습니다.
      참고: 각 데이터 세트에는 샘플 ID, 사용된 실험 파라미터, 회절 이미지 뷰어, 결정 이미지 뷰어 및 데이터 품질을 빠르게 관찰할 수 있는 이미지별 분석 플롯이 표시됩니다.
2. 자동 처리 결과에 액세스하려면
   1. 특정 실험의 데이터 요약 아래에 있는 자동 처리 탭을 클릭하여 자동 데이터 축소 결과를 검사합니다(그림 6A).
   2. 서로 다른 파이프라인에 해당하는 다른 탭을 클릭하면 각 출력에 대한 자세한 요약을 볼 수 있습니다.
      참고: 샘플 그룹이 정의된 경우 멀티플렉스 작업에 해당하는 두 개의 탭이 있습니다. 하나는 해당 시점까지 그룹의 모든 데이터 세트 병합에 해당하고, 다른 하나는 해당 드롭 내에서만 데이터 세트 병합에 해당합니다.
   3. Logs & Files 버튼을 클릭하여 처리가 성공한 경우 결과 .mtz 파일 및 관련 로그 파일을 다운로드합니다. Auto Processing(자동 처리) 섹션 아래에 있는 Downstream Processing(다운스트림 처리) 탭을 클릭하여 DIMPLE의 출력을 확인합니다.
      참고: DIMPLE은 샘플 제출 중에 PDB 파일이 제공된 경우에만 실행됩니다.
   4. Logs & Files 버튼을 클릭하여 DIMPLE에서 결과 출력을 다운로드합니다.
3. 그룹 멀티플렉스 결과에 액세스하려면 제안 번호가 적힌 화면 상단의 드롭다운 메뉴를 열고 Sample Group Management(샘플 그룹 관리)를 클릭합니다. 올바른 컨테이너 내에서 원하는 그룹에 해당하는 행을 클릭합니다. 아래로 스크롤하여 플레이트 다이어그램으로 시각적으로 표시된 그룹에 해당하는 멀티플렉스 출력 목록을 찾습니다.
   1. 주어진 목록에서 원하는 멀티플렉스 출력을 클릭합니다. xxx Data Sets(xxx 데이터 세트 ) 단추를 클릭합니다. 여기서 xxx 는 병합된 데이터 집합의 수입니다(그림 6B).
      참고: 그러면 데이터 수집 화면이 열리지만 선택한 멀티플렉스 작업의 데이터 세트만 표시됩니다.
   2. 맨 위 실험의 자동 처리 탭을 클릭합니다.
   3. 병합된 데이터 세트의 올바른 수에 해당하는 Multiplex Processing 탭을 클릭합니다.
   4. Logs & Files(로그 및 파일) 버튼을 클릭하여 .mtz 및 해당 로그 파일을 다운로드합니다(3.2.3단계에서와 같이).
4. 그리드 검사 결과에 액세스하려면
   1. 원하는 방문에 대한 데이터 수집 화면으로 이동합니다. 그리드 스캔 데이터 결과는 수집된 회전 데이터와 함께 표시됩니다.
      참고: 자동 처리 결과는 없습니다.
   2. 크리스탈 드롭의 이미지에는 회절의 존재를 나타내는 히트 맵이 겹쳐진 그리드가 있습니다. 사각형 을 클릭하면 그리드에서 해당 위치에 대한 회절 이미지를 볼 수 있습니다. 크리스탈 웰 이미지 상단에 있는 드롭다운 메뉴를 클릭하여 히트 맵이 나타내는 내용을 변경합니다. 기본값은 회절의 총 강도 이지만 총 스폿, 예상 해상도 또는 얼음이 없는 프레임으로 변경할 수 있습니다.

4. 데이터 재처리

참고: 선택한 데이터 세트는 사용자가 정의한 대로 변경된 설정으로 자동으로 실행되는 동일한 처리 파이프라인을 사용하여 ISPyB¹¹ 인터페이스를 통해 다시 처리할 수 있습니다. 해상도 컷오프를 적용할 수 있습니다. 크리스탈의 대칭/셀을 알고 있는 경우 처리 파이프라인이 올바른 설정에서 실행되도록 정의할 수도 있습니다. 특정 데이터 세트에서 선택한 이미지 범위는 사용 가능한 다결정 파이프라인을 사용하여 병합할 수도 있습니다. 이는 체계적인 방사선 손상으로 인해 회절 이미지의 후반부의 품질이 저하되는 경우 유리할 수 있습니다. 또한 사용자가 위에서 설명한 프로토콜을 사용하여 데이터 세트를 다운로드하고 원하는 재처리 소프트웨어를 로컬에서 실행할 수 있는 옵션이며, 이에 대한 자습서는 다른 곳에서 무료로 사용할 수 있습니다(https://dials.github.io/documentation/tutorials/index.html# ).

1. 여러 개별 데이터 세트를 다시 처리하려면
   1. ISPyB에 로그인하고 관심 있는 데이터 세트로 이동합니다(3.1단계).
   2. 데이터 세트를 클릭하고 데이터 세트 제목 표시줄(그림 6)에서 톱니바퀴 아이콘을 클릭하여 재처리 창을 엽니다.
   3. 원하는 설정을 구성하고 재처리에 포함할 프레임을 선택합니다.
      참고: 이미지 범위는 레이블이 지정된 상자에 범위를 입력하거나 이미지별 분석 플롯에서 원하는 영역을 클릭하고 드래그하여 정의할 수 있습니다(그림 7A).
   4. 선택 사항: 개별 재처리를 위해 다른 데이터 세트를 추가하려면 톱니바퀴 아이콘을 클릭하면 첫 번째 데이터 세트 아래의 재처리 창에 나타납니다. 체크 개별적으로 처리 상자.
   5. 통합 버튼을 클릭합니다.
2. 다결정 데이터를 재처리하려면
   1. 모든 데이터 세트에서 재처리 창을 엽니다.
   2. Multi-Crystal 버튼을 클릭하여 새 화면을 엽니다.
   3. 아래로 스크롤하여 방문 중 실험에서 일련의 이미지별 분석 플롯을 찾으십시오.
   4. 드롭다운 메뉴에서 처리 파이프라인 을 선택합니다.
   5. 선택 사항: 해상도 한계 또는 알려진 단위 셀 매개변수를 정의합니다.
   6. 클릭하고 드래그하여 다결정 재처리에 포함할 이미지 범위를 정의합니다(그림 7).
      참고: 이 작업은 여러 다른 결정의 데이터 세트가 병합되도록 여러 다른 플롯에 대해 수행해야 합니다.
   7. Integrate(통합) 단추를 클릭합니다(그림 7B).
3. 재처리된 데이터에 액세스하려면
   1. 특정 방문에 대한 데이터 수집 페이지로 이동합니다(3.1.1-3.1.3단계).
   2. 화면 상단의 재처리 버튼을 클릭합니다.
   3. 아래로 스크롤하여 원하는 작업을 찾습니다.
   4. 오른쪽 열의 파일 경로를 클릭하여 재처리된 데이터에 대한 데이터 수집 화면을 엽니다.
   5. 자동 처리 탭을 열고 앞에서 설명한 대로 데이터를 다운로드합니다(3.2단계).
      참고: 재처리된 모든 작업은 파이프라인 이름 옆에 있는 원형 화살표 기호로 식별할 수 있습니다.

토론

CF에 단백질 샘플이 도착하는 것부터 추가 응용을 위해 사용자가 최종 데이터를 다운로드하는 것까지의 전체 절차를 설명했습니다. 중요한 단계는 상용 희소 매트릭스 스크린 또는 확립된 조건에 기반한 최적화 스크린을 사용하여 고품질 단백질 샘플과 적절한 결정 스크린을 생산하는 것입니다. 이 공정은 CF에서 수행되거나 사용자가 가정 실험실에서 결정화 절차를 수행하고 빔라인에 적합한 결정화 플레이트를 가져올 수 있습니다. 적절한 데이터 수집 매개변수의 식별은 특정 샘플, 특히 방사선 손상이 우려되는 경우에 중요할 수 있습니다. 대부분의 경우, 자동화된 데이터 처리만으로도 과학적 질문에 답할 수 있지만, 예를 들어 공간 그룹이 모호하거나 방사선 손상 영향을 최소화하기 위해 수집된 데이터의 초기 부분만 사용되는 경우와 같이 빔라인 도구를 사용하여 재처리할 수 있는 기능을 보유합니다.

초기 결정화 시험에서 적합한 결정이 생성되지 않으면 단백질 농도, 순도 또는 결정화 스크린의 변화를 탐색할 수 있으며 결정 파종의 사용도 가능합니다. 결정이 빔라인에서 유용한 분해능으로 회절되지 않는 경우, 감쇠되지 않은 빔과 함께 그리드 스캔을 사용하여 결정의 고유한 회절 한계 및 단위 셀을 평가하여 최적화 노력을 안내할 수 있습니다. 플레이트 내에서 데이터를 수집하기에는 너무 작은 결정(예: <10μm)은 대신 연속 결정학 또는 나노 초점 실험(예: 다이아몬드 빔라인 VMXm)에 적합할 수 있습니다. VMXi 데이터를 사용하여 구조를 해결하는 것은 일반적으로 분자 교체를 통해 간단하며, 특히 효과적인 검색 모델을 제공하기 위해 Alphafold¹⁶ 이 등장한 이후 더욱 그렇습니다. 이것이 성공적이지 않은 경우, 플레이트에서 결정을 수확하고 극저온 냉각하여 기존의 단일 파장 이상 회절, 다중 파장 이상 회절 또는 장파장 위상 실험을 가능하게 할 수 있습니다.

이 방법의 장점은 결정이 성장한 환경에서 결정을 방해할 필요 없이 결정화 플레이트에서 직접 신속한 고품질 데이터 세트와 피드백을 얻을 수 있다는 것입니다. 구조 생물학에서 소위 '실온 르네상스'는 생리학적 관련성과 단백질 역학을 더 많이 탐구할 수 있도록 비극저온 조건에서 얻은 구조를 중요시합니다². 일반적으로 최적화된 극저온 냉각 결정보다 약간 낮은 분해능이 달성되지만 적절한 극저온 조건이 설정되고 결정이 결정화 드롭의 기계적 취급 및 개방에 강건한 경우에만 달성됩니다³. 이 파이프라인이 매우 적합한 향후 응용 분야는 약물 발견에서 실온에서 단백질-리간드 복합체 또는 단편 캠페인의 대규모 스크리닝입니다. 리간드 또는 단편은 실온 데이터 수집 전에 피펫 또는 음향 방울 배출에 의해 공결정화되거나 추가될 수 있습니다. 또 다른 응용은 매우 효율적인 방식으로 수백 또는 수천 개의 결정체로부터 데이터를 신속하게 측정한 다음, DIALS¹⁷ 멀티플렉스(¹⁴ ) 소프트웨어를 사용하여 상이한 생물학적 실체를 나타낼 수 있는 동형 클러스터를 추출하거나, 상이한 방식으로 처리되거나 상이한 리간드 또는 신호에 노출된 결정의 집단 간에 통계적으로 유의한 차이를 확립하는 것이다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formulator	Formulatrix	on request	Liquid handling robot
Formulatrix imager	Formulatrix	on request	Crystallisation plate imager
Greiner CrystalQuick X	Greiner	Z617644	Crystallisation plate
Gryphon	Art Robbins Instruments	620-1000-10	Crystalisation robot
MiTeGen Insitu-1	Mitegen	InSitu-01CL-40	Crystallisation plate
Mosquito LCP	(SPT Labtech)	on request	Crystallisation robot
Rock Imager & Maker	Formualtrix	on request	Software for Imager [1] https://formulatrix.com/protein-crystallization-systems/rock-maker-crystallization-software/
Scorpion	Art Robbins Instruments	640-1000-10	Liquid handling robot https://www.artrobbins.com/scorpion