백혈구-내피 세포 상호작용은 패혈증과 같은 염증성 질환에서 중요한 역할을 한다. 염증 조절 장애는 종종 혈관 내피 장벽 기능의 변화와 과도한 백혈구 밀매를 일으켜 장기 손상을 초래할 수 있습니다. 우리가 bMFA라고 부르는 생체 모방 미세 유체 분석은 생체 내 미세 혈관 네트워크의 지형 및 흐름 조건을 재현하고 호중구의 롤링, 확고한 접착, 확산 및 조직 구획으로의 이동에 대한 실시간 평가를 가능하게합니다.
생체모방 미세유체 분석의 강점은 일차 인간 세포 및 임상적으로 관련된 환자 샘플을 사용하여 임상 번역을 증가시키고 잠재적인 치료제를 신속하게 스크리닝하는 능력이다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 대학원 연구 조교 인 Qingliang Yang 씨가 될 것입니다. 하나의 입구 포트를 제외한 미세한 포셉을 사용하여 포트 내에 약 한 인치 길이의 튜브를 삽입하기 시작하십시오.
턱 클램프를 사용하여 두 개의 출구 포트와 조직 구획을 함께 클램프하십시오. 피브로넥틴 원액을 PBS로 밀리리터당 100마이크로그램으로 희석한다. 희석된 피브로넥틴 용액으로 24게이지 무딘 바늘에 연결된 한 밀리리터 주사기를 로드하고 주사기를 4인치 길이의 튜브에 연결합니다.
튜브를 열린 입구 포트에 삽입한 다음, 인간 피브로넥틴이 다른 입구 포트에서 방출될 때까지 플런저를 밀어 클램프합니다. 모든 채널, 조직 구획 및 튜빙이 인간 피브로넥틴 용액으로 채워질 때까지 나머지 포트에 대한 과정을 반복한다. 바늘을 제거하되 네 인치 길이의 튜브를 삽입하고 고정하지 않은 상태로 유지하십시오.
탈기를 수행하려면 클램핑되지 않은 튜브를 15분 동안 평방 인치당 5파운드의 압력으로 압축 질소 탱크에 연결된 공압 프라이머에 연결합니다. 현미경으로 채널 또는 조직 구획 내에 기포가 갇혀 있지 않은지 확인하고 기포가 있으면 장치를 다시 연결하십시오. 공압 프라이머로부터 장치를 제거하고 한 시간 동안 섭씨 37도에서 인큐베이션한다.
미리 가온된 인간 폐 미세혈관 내피 세포 배양 배지를 사용하여 모든 채널 및 조직 구획을 플러시합니다. 텍스트 원고에 기재된 바와 같이 내피 세포를 수확한 후, 프로그램가능한 시린지 펌프를 G.In 하여 150회에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화하고, 1밀리리터 주사기를 장착하고, 튜빙을 무딘 바늘에 부착한다. 약 20 마이크로리터의 세포 현탁액을 주사기 배럴에 넣지 않고 튜빙에 끌어당깁니다.
장치의 출구 포트에서 클램프를 분리합니다. 채널에 기포가 생기지 않고 튜브를 입구 포트에 연결하십시오. 분당 네 ~ 여덟 마이크로 리터의 유량으로 펌프를 멈추고 현미경으로 관찰하십시오.
채널이 셀로 채워질 때 펌프를 중지하십시오. 출구를 고정하고 입구 튜브를 자릅니다. 장치를 5 % 이산화탄소와 섭씨 37도에서 네 시간 동안 인큐베이터에 두십시오.
네 시간의 배양 후, 다른 주사기를 준비하고 신선한 세포 배양 배지로 채운다. 주사기를 주사기 펌프에 장착하고 입구 포트에 연결하십시오. 콘센트 포트에서 클램프를 분리합니다.
신선한 배지를 분당 네 개 내지 여덟 마이크로리터로 약 다섯 분 동안 장치를 통과시켜 부유하거나 부착되지 않은 세포를 제거한다. 신선한 세포 배양 배지로 채워서 주사기를 준비하십시오. 주사기를 주사기 펌프에 장착하고 출구 포트를 열어 두면서 하나의 입구 포트에 연결하십시오.
장치를 섭씨 37도 및 5 % 이산화탄소의 인큐베이터에 두십시오. 텍스트 원고에 기재된 바와 같이 유동하에 내피 세포를 배양하기 위한 주사기 펌프를 프로그래밍한다. 현미경을 사용하여, 유동 하에서 48시간 배양한 후 bMFA를 확인하였다.
공초점 현미경 검사는 혈관 채널의 모든 표면이 내피 세포에 의해 덮여 bMFA에서 완전한 3D 루멘을 형성한다는 것을 나타냈다. 세 개의 상이한 bMFA 장치를 제조한 후, PKC 델타 억제제와 각각 결합된 세포 배양 배지 또는 TNF-알파 또는 TNF-알파로 세 밀리리터 주사기를 로딩하고, 여기서 TNF-알파 및 염증성 사이토카인은 내피 세포 및 호중구를 자극하는데 사용된다. PKC 델타 억제제는 신규한 항염증 억제제이다.
로드된 세 개의 주사기를 세 개의 bMFA 장치에 연결합니다. 완충제 TNF-알파 또는 TNF-알파를 억제제와 함께 사용하여, 분당 0.1 마이크로리터로 네 시간 동안 인간 폐 미세혈관 내피 세포를 치료한다. 텍스트 원고에 기재된 바와 같이 인간 호중구를 단리한 후, 호중구를 999 마이크로리터의 HEPES 완충액에 재현탁시키고, 10-밀리몰 CFDA SE 염료 원액 1 마이크로리터를 현탁액에 첨가하여, CFDA SE의 10-마이크로몰 작업 용액을 수득하고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션한다.
세포를 HEPES 완충액으로 두 번 세척하고 315배 G에서 5분 동안 용액을 원심분리하여 세포를 계수한 후, 세포 배양 배지에서 밀리리터당 2백만 호중구로 재현탁시키거나 PKC 델타 억제제와 함께 첨가된 TNF-알파 또는 TNF-알파에서 재현탁시키고 실온에서 15분 동안 인큐베이션한다. 주사기를 세포 배양 배지에서 제조된 화학유인제, fMLP의 마이크로몰로 채운다. bMFA의 입구 하나와 출구 포트 하나를 엽니다.
조직 구획에서 포트 튜빙을 분리하고 fMLP 튜빙을 삽입하십시오. 약 20 마이크로리터의 fMLP를 모든 bMFA에 대해 조직 구획에 주입하고, 세포 배양 배지로 처리한 것을 남겨 둡니다. 튜브를 자르고 고정하십시오.
주사기를 약 200 마이크로리터의 호중구 현탁액으로 채우고 주사기를 주사기 펌프에 장착하십시오. 장치를 거꾸로 된 현미경 스테이지에 놓은 후 유량을 분당 한 마이크로 리터로 설정하고 펌프를 시작하십시오. 튜브에서 호중구 현탁액의 작은 방울이 나올 때까지 기다렸다가 튜브를 입구 포트에 삽입하십시오.
형광 표지된 호중구는 혈관 채널로 유동하고 내피 세포 및 생리학적으로 관련된 유동 조건과 상호작용한다. 실험을 시작한 후 10분 후에 이미지 분석 소프트웨어를 열고 대물 렌즈를 10x로 전환한 다음 스테이지 조이스틱을 사용하여 장치를 현미경 아래 가운데에 맞춥니다. 접착 맵을 가져오려면 획득으로 이동하여 큰 이미지 스캔을 클릭합니다.
새 창이 나타납니다. 10x 대물 렌즈를 선택하고 필드 옵션(예: 5 x 3)을 설정합니다. 스캔을 클릭하고 파일을 클릭한 다음 접착 맵을 저장합니다.
마이그레이션 분석을 위한 마이그레이션 맵을 가져오려면 스테이지 조이스틱을 사용하여 장치를 현미경 아래에 가운데에 맞춥니다. 보기, 획득 제어, ND 획득을 클릭합니다. 새 창이 나타납니다.
파일을 저장할 경로를 설정하고 파일 이름을 입력합니다. 큰 이미지 기능을 확인하고 스캔 영역을 설정합니다(예: 5x3). 시간 기능을 확인하고 간격을 5분으로, 지속 시간을 60분으로 설정합니다.
조직 구획의 시간 경과 이미지를 촬영하고 다음 시간 동안 다섯 분마다 하나의 이미지를 촬영하십시오. CFD 시뮬레이션은 흐름 패턴이 교란되는 분기 영역을 제외한 혈관 채널의 층류 패턴을 보여줍니다. 생체모방 마이크로유체 분석을 수행한 후, 위상차 이미지는 혈관 채널의 표면이 내피 세포로 덮여 있고, 배양 48시간 후에 전단 흐름의 방향으로 정렬되었음을 밝혀냈다.
형광 이미징은 공초점 현미경을 사용하여 수행되었으며, 이는 내피 세포가 bMFA A 호중구 부착 지도에서 완전한 입체 내강을 형성한다는 것을 나타내며, 이는 bMFA에서 내피 세포에 대한 호중구의 유의한 부착이 있음을 밝혀냈다. bMFA에서의 호중구 이동 지도는 TNF-알파 활성화시, 조직 구획 내부에서 호중구의 상당한 이동이 발생한다는 것을 밝혀냈지만, TNF-알파 활성화 없이는 그러한 이동이 관찰되지 않았다. 호중구의 공간적 분포와 전단 속도를 연관시키는 부착지도는 호중구 부착이 전단율이 낮고 분기 영역 근처의 혈관에서 우선적으로 발생했음을 입증했습니다.
또한, TNF-알파 처리는 부착을 유의하게 증가시키고, 이는 PKC 델타 억제제와 함께 억제되었다. 시간 경과 이미지 분석은 내피 세포의 TNF 활성화가 fMLP에 반응하여 호중구 이동을 증가시키는 반면, PKC 델타 억제제를 사용한 처리는 TNF-알파 처리된 세포에 비해 이동을 감소시켰다는 것을 나타내었다. 따라서, bMFA는 염증성 질환을 치료하기 위한 신규한 치료제의 효능을 시험하는데 사용될 수 있다.
bMFA는 또한 투과성 및 내피 전기 저항, TEER 및 염증 중 부착 분자 발현과 같은 변수를 측정하여 내피 무결성을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 생체 모방 미세 유체 분석은 다른 기관의 미세 환경을 모방 할 수 있으며 단일 세포 유형 또는 종에 국한되지 않으며 장기 기능에 중요한 세포 / 세포 통신을 모델링하고 다른 질병을 모델링 할 수도 있습니다.
