이 프로토콜은 분자 력과 세포 압연 거동 사이의 연결을 확립하는 데 도움이 되며, 공간적으로 매핑하고 분자 수준에서 압연 접착력을 정량화할 수 있습니다. 이 기술은 우리가 생리 관련 분자 접착력을 직접 측정할 수 있도록 실제 세포 압연 도중 개별 접착 이벤트를 연구할 수 있습니다. 각 단계에서 적절한 농도 및 배양 시간을 이용한 표면 제제는 고품질 표면 기능화를 달성하는 데 매우 중요합니다.
생체 경련과 적절한 조건의 품질도 중요합니다. 시각적 데모는 연구원이 이 프로토콜을 복제하는 데 매우 중요합니다. 특히, 유량 챔버 어셈블리 및 후처리 이미지와 같은 단계는 시각적 데모에서 큰 이점을 얻을 것이다.
먼저 면도날로 양면 테이프의 양쪽에 소량의 에폭시를 얇게 퍼뜨리는 것으로 시작합니다. 레이저를 사용하여 에폭시 코팅 테이프를 잘라 4개의 채널을 만듭니다. 4홀 슬라이드와 PEG 커버슬립 사이에 에폭시 테이프를 끼여 유동 칩을 만듭니다.
파이펫 팁을 사용하여 채널 의 길이에 따라 부드러운 압력을 가하여 좋은 씰을 만든 다음 에폭시를 최소 1 시간 동안 치료하십시오. 칩을 정렬하여 각 채널의 개구부가 어댑터의 중심에 배치되도록 합니다. 그런 다음 두 개의 투명한 아크릴 스페이서를 칩 위에 놓습니다.
블록 의 중간에 단단한 압력을 적용하고 각 스페이서의 끝에 나사. 입구를 브래킷 의 반대편에 있는 나사 구멍에 나사로 넣고 투명 아크릴 블록을 통해 밀봉 상태를 모니터링합니다. 누출을 확인하기 위해 챔버에 세척 버퍼 200 마이크로 리터를 플로우합니다.
거품이 채널에 형성되면, 적극적으로 거품을 제거하기 위해 세척 버퍼의 추가 200 마이크로 리터를 밀어. 비특이적 결합을 방지하고 습도 챔버에서 10 분 동안 배양하기 위해 흐름 챔버에 BSA의 40 마이크로 리터를 추가합니다. 인큐베이션 후, Tween 20에서 40 마이크로리터를 유량 챔버에 추가하고 10분 동안 다시 배양하여 비특이적 결합을 더욱 줄입니다.
그런 다음 모든 통과제를 제거하기 위해 200 마이크로 리터의 세척 버퍼로 채널을 세척합니다. 챔버 표면 기능화를 위해, 스테레타비딘의 40 마이크로 리터를 유량 챔버에 추가하고 20 분 동안 배양 한 다음 200 마이크로 리터의 세척 버퍼로 챔버를 세척하십시오. 이제 40 마이크로리터의 혼성 단백질 G-TGT를 유량 챔버에 추가하고 20분 동안 배양합니다.
세척 버퍼로 세척한 후, 40 마이크로리터의 단백질 G-TGT 상단 가닥을 추가하고 20분 동안 배양하여 표면에 비혼TGT 바닥 가닥을 완성한 다음 세척 버퍼로 세척합니다. 마지막으로, P-selectin-Fc 의 40 마이크로리터를 유량 챔버에 넣고 세척 버퍼로 세척하기 전에 60 분 동안 배양하십시오. 롤링 버퍼로 5 밀리리터 유리 주사기를 채우고 주사기의 측면을 탭하여 벗겨내고 끝을 향해 떠있는 거품을 밀어 내립니다.
멸균 바늘을 폴리에틸렌 튜브 200mm 조각에 삽입한 후 바늘을 유리 주사기에 연결합니다. 주사기를 주사기 펌프에 고정하고 플런저 측이 상승하여 기포가 채널에 유입되는 것을 방지하기 위해 주사기 펌프를 기울입니다. 튜브의 끝을 유량 챔버 입구에 삽입합니다.
폴리에틸렌 튜브의 또 다른 200밀리미터 조각의 한쪽 끝을 콘센트에 넣고 다른 쪽 끝을 폐기물 비커에 담급다. 세포 현탁액 샘플과 원심분리기의 1~2밀리리터를 복용하여 세포를 펠릿합니다. 배지를 제거하고 롤링 버퍼의 500 마이크로리터에서 셀을 부드럽게 다시 분리합니다.
조심스럽게 유입구와 출구및 파이펫 40 마이크로리터의 튜브를 유량 챔버로 분리한다. 이전에 설명된 대로 튜브를 다시 연결하여 거품이 흐름 채널에 도입되지 않도록 합니다. 원하는 유량에서 주사기 펌프를 시작하여 셀 롤링 실험을 시작합니다.
10X 목표를 가진 암조 현미경을 사용하여 세포 압연을 관찰하십시오. 실험이 완료되면 표면이 셀이 없는 때까지 시간당 100 밀리리터의 롤링 버퍼를 주입하여 채널에서 셀을 제거합니다. DNA-PAINT에 의한 로컬 트랙을 이미징하려면 DNA-PAINT 버퍼로 제조된 DNA-PAINT 이미저 가닥 40마이크로리터를 채널에 추가합니다.
텍스트 원고에 언급 된 조건을 사용하여 총 내부 반사 형광 현미경 검사를 수행합니다. 슈퍼 해상도 이미지를 현지화하고 렌더링합니다. 영구 라벨링을 통해 긴 트랙을 이미징하려면 영구 이미저 가닥을 추가하고 T50M5 버퍼에서 120초 동안 배양합니다.
그런 다음 200 마이크로리터의 세척 버퍼를 주입하여 채널을 세척합니다. 배경 카메라 소음을 얻기 위해 흥분 레이저끄기로 이미지를 기록합니다. TIRF 현미경 검사법에 의해 그리드 패턴의 넓은 영역을 이미지합니다.
현미경을 프로그래밍하여 400x 50 개의 이미지를 스캔하고 ImageJ 프로그램을 사용하여 최대 10, 000 이미지를 포함하는 개별 TIP 파일로 원시 데이터를 분할합니다. 조명 프로파일을 사용하여 모든 이미지를 평평하게 하고 MIST 플러그인을 사용하여 이미지를 스티치합니다. 단백질 G ssDNA 바이오 컨쥬게이션 특성화의 결과는 거의 하나의 단백질 G대 ssDNA 단백질을 나타내었으며, 여기서 단백질 G 말레니미드 ssDNA 및 이미다졸 용출 완충스펙트럼은 생체 경련 제품 스펙트럼에 맞추기 위한 직교 기초로부터이다.
네이티브 PAGE는 성공적인 결합과 좋은 수율을 나타내는 단황 단백질 G 밴드와 일치하는 밝은 녹색 밴드를 보여주는 바이오 컨쥬게이션을 확인하는 데 사용되었다. 단일 모드 섬유에서 도입된 TIRF 조명 프로파일은 일반적으로 시야 중간에 더 밝고 가장자리 주위의 조광체입니다. 고르지 않은 조명을 보정하고 정량 적 분석을 위해 이미지를 평평하게하기 위해 조명 프로파일은 수천 개의 개별 프레임을 평균화하여 결정되었습니다.
평평한 이미지는 원시 프로파일과 조명 프로파일 모두에서 카메라 노이즈를 빼고 조명 프로파일에 의해 정상화하여 생성되었습니다. 원시 스티치는 수정되지 않은 이미지에 대응하는 명확한 주기적인 패턴을 보였으며 평평한 이미지에서 바느질된 동일한 시야가 평평한 배경을 생성했습니다. 램프 업 유동 프로파일은 전단 응력의 범위를 결정하여 세포 압연 및 항복 형광 트랙을 결정하는 데 사용되었으며, 이 중 일반적인 단세포 접착 발자국이 볼 수 있었습니다.
대비가 부족한 형광트랙의 최적이고 최적의 결과, 과도한 트랙 밀도, 최적의 트랙 밀도 및 대비, 및 회절 제한 및 DNA-PAINT 이미징이 표시됩니다. 60분 이상의 인큐베이션 시간은 표면 기능화를 보장하고 적절한 챔버 구조는 기능성 표면을 손상시키는 기포의 통행을 방지합니다. 이 절차는 압연 접착에 관여하는 분자력의 정량적 분석에 적용 가능하며 연구원이 다른 세포 유형의 압연 거동을 이해할 수 있게 합니다.
이 기술은 연구원이 단 하나 분자 및 mechanobiology 연구의 추가 발전으로 이끌어 내는 빠른 접착 사건에 관하여 새로운 질문을 탐구하는 것을 허용합니다.
