이 작품은 NIH R01 HG002995 지원했다 &quot;Zebrafish 게놈 틸링 : 역방향 유전학 어프로치&quot;CBM으로합니다.

부품 A : 정자의 냉동 솔루션 1. 진스 버그 생선 링거스 (매 3 일마다 새로 만들어, 긴스버그, 1963) 참고 : 추가할 주문 석출을 방지하는 것이 중요합니다 450 년 ML 살균 ddH2O는 디졸브 : <ul><li> NaCl 3.25 g </li><li> KCl 0.125 g </li><li> CaCl2 • 2 H2O 0.175 g 다음 추가 : </li><li> NaHCO3 0.10 g </li></ul> 4 무균 ddH2O하고 저장 ° C. 500 ML에 마지막으로 볼륨을 가지고 2. 냉동 매체 (신선한 매일 확인) <ol style="list-style-type:lower-roman"><li> 메탄올없이 <ul><li> 긴스버그 피시는 10 ML 링거스 (온도는 실온). </li><li> 가루 우유 밀크 1.5 GM </li></ul></li><li> 메탄올과 함께 참고 : 추가할 주문 석출을 방지하는 것이 중요합니다 <ul><li> 긴스버그 피시 9 ML (온도는 실온). 링거스 </li><li> 메탄올 1 ML </li><li> 가루 우유 밀크 1.5 g </li></ul> 동결 미디어를 조립 후, 20 분 잘 섞는다. 궤도 흔드는 또는 로커에서. 사용하기 전에, 1 ML eppendorf 튜브로 나누어지는, 표면 거품을 피하고. </li></ol> 파트 B : 정자 동결에 필요한 자료 정자 동결에 필요한 자료 <ol><li> 10 μl 일회용 pipettes (Fisherbrand 고양이 # 22-358697) </li><li> MESAB / Tricaine를 포함하는 물고기 물 250ml 비커 </li><li> 시계 안경 (Pyrex 고양이 # 9985-75) </li><li> P20 pipetman (또는 이에 상응하는 금액) 및 팁 </li><li> 스폰지 물고기 홀더 (압박하면서 남성을 개최) </li><li> 위의 무대 조명과 현미경을 해부 </li><li> 플랫 포셉 (예 : Millipore 타입) </li><li> 2.0ml 극저온 튜브 (코닝 고양이 # 430488) </li><li> 10X10 cryoboxes (Nalgene 고양이 # 03-337 - 7AA) </li><li> 스티로폼 용기는 잘게 조각 건조 ice1의 ~ 15cm로 가득 </li><li> 15 ML 원뿔 튜브 (팔콘 # 352099) </li><li> 액체 질소를 포함하는 듀어 플라스크 </li><li> 긴 집게 (예 : CMS 피셔 의료 고양이 # 10 - 316B) </li><li> Cryogloves </li><li> 남성에 대한 복구 탱크 </li><li> 한 eppendorf 튜브은 메탄올없이 냉동 미디어로 가득 </li><li> 한 eppendorf 튜브는 메탄올과 함께 냉동 미디어로 가득 </li><li> Cryofreezer (예 : 테일러 - 워튼 K - 시리즈) </li></ol> 한 잘게 조각 드라이 아이스를 만들기위한 간단한 방법은 수건에 싸서 망치로 그것을 격파하는 것입니다. 보다 효율적인 방법은 드라이 아이스 연삭기, 예를 들어 클로슨 모델 RE - 2를 사용하는 것입니다. 파트 C : 정자의 동결 방법 <ol><li> 모세관 튜브를 표시 : 전에 처음으로 (바닥에서 즉, 16.7 mm를, 그림 1.1을 참조하십시오.) 3.33 μl 수준의 연구소 펜으로 10μl 모세관 튜브를 표시합니다. </li><li> MESAB / tricaine은 ( &quot;Zebrafish 도서&quot;에 요리법) 생선 물에 희석 포함하는 비커에 플레이스 남성 (S) : 남자를 마취 </li><li> DRY 물고기 : 일단 anesthetized는 플라스틱 숟가락을 사용하여 마취의 물고기가 밖으로 들고 부드럽게 복부 측면을 건조하기 위해 특별한주의를 기울이고, 종이 타월에 마른 생선을 얼룩. 그것이 철저하게 배설강 주위에 건조하는 것이 중요하므로 물이 정자를 활성화합니다. 스펀지 홀더에 위치 물고기, 복부 측면 접속 (그림 1.2). 항문 지느러미 주변 지역은 여전히​​ kimwipe로 부드럽게 건조하고 습한 경우. 정자를 조기 천천히하는데주의를 기울여야! </li><li> 이곳은 모세 튜브와 함께 제공되는 고무 마우스 피펫 어댑터에 모세관을 표시했습니다. 어댑터 한 끝에 마우스 피스와, 다른 한편으로는 모세관 홀더를 가진 고무 호스입니다. 또는 모세관은 적절한 직경의 tygon 관의 짧은 조각을 통해 50μl 해밀턴 주사기에 연결될 수 있습니다. </li><li> 플레이스의 범위에 따라 남성과 조심스럽게 모세관 튜브의 끝 부분을 사용하여 분리 골반 지느러미를 확산하여 urogenital 개방을 폭로. </li><li> 정자를 수집합니다 부드럽게 부드러운 포셉 (예 : Millipore)와 물고기의 측면을 쓰다듬어하여 정자를 추방하거나 부드럽게 당신의 검지 손가락과 엄지손가락 사이의 물고기의 양면을 쥐어하여. 그것이 부드러운 흡입 (그림 1.2)를 사용하여 퇴학와 같이 모세관에 정자를 수집합니다. 정자와 함께 퇴학 수 있습니다 대변하지 마십시오. </li><li> μl 3.3에 정자 볼륨을 정상화 : 정자 도달의 볼륨 또는이 모세관 (예 : 16.7 mm 이상)에 펜으로 표시를 초과하는 경우 8 단계로 진행합니다. 정자 볼륨 대상 볼륨에 도달하지 않는 경우, 메탄올 (그림 1.3)없이 고정 매체를 사용하여 펜 표시 볼륨을 정상화. 허용됩니다 정자의 최소 금액은 정자의 품질에 따라 다릅니다. 좋은 정자 흰색 불투명합니다. 불쌍한 정자는 물 보입니다. 1 μl 좋은 정자 (또는 3분의 1 대상) 2 μl 가난한 정자 (또는 3분의 2 대상) : 일반적으로, 우리는 최소로 받아들입니다. 볼륨은 지금 3.3 μl로 정상화됩니다. </li><li> 정자에 CRYOPROTECTANT ADD : M과 함께 냉동 매체를 빨아오렌지 마르크 (.; 그림 1.4 약 총 볼륨이 현재 20 μl)로 에탄올. 거품을 소개하지 않도록 특별한주의를 기울이고, 시계 유리 청소 영역에 정자와 cryoprotectant 혼합물을 추방. 부드럽게 그리고 아래로 pipetting ~ 4 번 (거품을 도입하지 않도록)로 섞는다. </li><li> 이 CRYOVIALS의 각 INTO 10μl 정자 장소 : 정자의 피펫 10 μl : 관련 정보 (그림 1.5)으로 표시되었습니다 두개의 cryovials 하단에 cryoprotectant 솔루션입니다. 신속하게 캡 튜브를 이동하고 실내 온도 15 ML 팔콘 튜브 - 원 cryovial / 튜브 하단에 그들을 놓으십시오. 캡 팰컨 관과 조각 드라이 아이스로 cryovial 함유 팰컨 튜브의 쌍을 삽입합니다. </li><li> 20 분 정자 꼼짝마. DRY ICE ON : 드라이 아이스 괜찮 분말 형태가 아닌 알약에 있어야합니다. 튜브는 깊은 정도만이 자신의 모자가 (그림 1.6) 표시되는 드라이 아이스에 삽입해야합니다. 드라이 아이스에 튜브를 추적하기 위하여, 팰컨 튜브의 각 쌍의에게 1-20 사이의 숫자를 (뚜껑에 작성)을주고 그들이 드라이 아이스에 들어가 시간을 기록합니다. </li><li> 액체 질소 INTO 플레이스 CRYOVIALS이 :. 정자 20 분 드라이 아이스에 동결되고 나면, 액체 질소 함유 듀어 플라스크를 그들을 전송할 수 있습니다. 정자는 액체 질소 냉동고에 장소 시간까지 여기에 저장됩니다. 샘플가 가열되지 않도록 액체 질소의 목욕에있는 냉장고 상자에 배치, 장소 냉장고 상자. 듀어 플라스크에서 튜브를 복구하고 cryogloves로 처리하는 긴 금속 집게를 사용하십시오. 냉동고 박스 스티로폼 용기에 액체 질소에 보관 포장되어있는 경우 또는 cryovials는 냉동실 상자에 드라이 아이스에서 직접 전송하실 수 있습니다. </li><li> 극저온 액체 질소 냉동고에 저장 cryovials이 장기. 정자의 생존을 유지하기 위해서는 튜브는 액화 질소에 포장되어 저장하는 것이 중요합니다. 우리의 경험에서, 기상 위상에 저장된 튜브는 시간이 지남에 따라 경쟁력을 잃게됩니다. 속도는 중요하다! cryoprotectant를 추가하고 (즉, 단계 6-10) 드라이 아이스에서 정자 튜브를 삽입 사이의 시간이 더 이상 30 초되어야합니다. </li></ol> 파트 D : Cryopreserved 정자를 사용하여 체외 수정의 방법 우리는이 두 사람과 가장 잘 작동 것을 발견했습니다. 다른 사람이 정자는 녹아서 동안 한 사람이 여성에서 달걀을 했군. <ol><li> 33 ° C.에 물 목욕을 설정 </li><li> 액체 질소 함유 해동 준비까지 듀어 플라스크를 액체 질소 냉동고 및 전송에서 cryovial 제거합니다. </li><li> 35mm 플라스틱 페트리 접시로 여성의 난자를 짜내. 가능하면, 계란 3 클러치를 얻는 하나의 그릇에 결합하려고합니다. 당신이 첫 번째 클러치 1 분 안에 3 좋은 클러치를 얻을 수 없다면 (한 좋은 클러치가 충분합니다) 4 단계로 진행합니다. 좋은 클러치의 정의 :&gt; 150 균일하게 잘보고 달걀 (예 : 노란, 열화 지표없이 하얀 잔해와 함께). 정자가 해동되는 동안 대상 음식 보관하십시오. </li><li> 액체 질소의 병을 제거하고 뚜껑을 제거합니다. 33 80-10 초에 대한 ° C 물 목욕으로 신속하게 담가 병에 ~ 1 / 2 방법입니다. </li><li> 신속하고 위아래로 pipetting하여 유리병과 혼합 70 μl 방 온도 행크스를 추가합니다. 즉시 계란에 추가하고 피펫 팁과 함께 부드럽게 섞는다. </li><li> 지체없이, 750 μl 물고기 물을 추가하여 정자와 난자를 활성화해야합니다. 섞어 소용돌이. 실온에서 5 분 알을 품다. </li><li> 5 분 후, 28에서 생선 물 품어 요리와 요리를 기입 ° C. 2-3 시간 후, 개수 및 100mm 요리 (50/dish)에 비옥한 배아를 전송합니다. 수정 주파수가 결정 수 있도록 불임 계란을 계산합니다. </li><li> 애벌레 잘 부탁해! 처음 5 일 동안 매일 물을 변화와 죽은 태아를 제거합니다. 일 5 보육에 수영 bladders가있는 애벌레를 넣어. </li></ol> 부품 E : 대표 결과 우리는 년 2001 년에서 2003 년 사이 틸링에 대한 8600 냉동 정자 샘플 라이브러리를 만들기 위해이 crypreservation 방법론을 사용. 우리는이 샘플 106를 해동하고 불임을 결정했습니다. 다산은 냉동 정자와 함께 수정된되었습니다 계란의 총 수로 나눈에서 체외의 수정에서 생산 가능한 배아의 비율입니다. 신선한 (cryporeserved 비) 정자 일반적으로&gt; 95 %의 불임있다; cryopreserved 정자가 훨씬 낮은 불임을 가지고 : 29 % (N = 106 병)의 평균. 다산의 유리병 - 투 - 유리 변화는 1 % 미만 62 %로 높이에 이르는 대형이다. 이 변화는 그림에서 표준 편차를 나타내는 큰 오차 막대로 표시됩니다. 2. 그러나 우리가 한 번만 정자 샘플을 모두 0 % 불임을 경험하고 해당 틸링 변이를 복구하는 실패 날짜 해동 106 정자 샘플 인치 몇 년간의 과정을 통해 우리 도서관에서 정자 튜브를 해동하여 (2001년에서 2008년까지) 우리는이 방법으로 냉동 정자 샘플의 평균 불임 남아 것으로 나타났습니다안정 시간이 지남에 (그림 2). 2001 년 해동 냉동 정자 샘플의 평균 다산은 23.5 % (11 정자 샘플에 따라 이전) 2008 25 % (21 정자 샘플을 기반으로)되었습니다. 다른 조사의 숫자는 이제 실험실에서 정자 동결 프로토콜을 사용하고 있습니다. 일부는 우리가 관찰한 것을과 비슷한 불임 속도와 샘플 - 투 - 샘플 변화와 좋은 성공을보고있다. 기타 보도에 따르면이 프로토콜들은 손에 작동하도록하는 데 실패했습니다. 우리는 문제의 가능성이 소스가 생각 : <ol><li> ; 때 드라이 아이스로 냉각의 다른 속도로 이어지는, 우리가 프로토콜의 제안이 정확한 cryovials 또는 원뿔 튜브를 사용하지 않으면 </li><li> , 하위 최적의 냉각 속도로 이어지는, 분말 드라이 아이스를 사용하지 않으면 </li><li> 가난한 다산과 남성의 물고기를 사용 : 당신은 한 남성으로부터 정자 최소한 1 μl를해야합니다. 그것이 100 % 다산 접근하는 것은 매우 신선한 정자를 필요하기 때문에 당신은 또한 신선한 정자와 체외의 수정에를 수행하여 남성 불임을 테스트할 수 있지만이 오해하실 수 있습니다. </li><li> 에서 체외의 수정에 하위 표준 품질 계란을 사용합니다. 아무것도하지만 완벽한 클러치를 사용하면 항상 0 % 다산 가까운, 심지어 실제로 좋은 다산 (중복 유리병의 불​​임에 따라)가 정자 샘플에서 발생합니다. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1395/1395fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 정자 동결 방법론의 도식. <img src="/files/ftp_upload/1395/1395fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. Cryopreserved 정자 불임 시간이지나면서 안정 남아있다. 비율 다산의 냉동 정자와 함께 수정된되었습니다 계란의 총 수로 나눈에서 체외의 수정에서 생산 가능한 배아의 번호입니다. &quot;N&quot;은 다산 해당 연도에 테스트되었습니다 cryopreserved 정자 튜브의 개수를 나타냅니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 각 정자 약병은 다른 남자의 것이므로, 병에 - 투 - 유리 변화가 관찰됩니다.

<ol>
	<li>Ginsburg, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm-egg+association+and+its+relationship+to+activation+of+the+egg+in+salmonid+fishes.">Sperm-egg association and its relationship to activation of the egg in salmonid fishes.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 11, 13-33 (1963).</li><li>Harvey, B., Kelley, R. N., Ashwood-Smith, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+zebra+fish+spermatozoa+using+methanol.">Cryopreservation of zebra fish spermatozoa using methanol.</a> Can. J. Zoology. 60, 1867-1870 (1982).</li></ol>

다른 조사의 숫자는 이제 실험실에서 정자 동결 프로토콜을 사용하고 있습니다. 일부 유사한 불임 우리가 관찰이 동일한 샘플 - 투 - 샘플 변화를보고있다. 기타 보도에 따르면이 프로토콜들은 손에 작동하도록하는 데 실패했습니다. 우리는 문제의 가능성이 소스가 생각 : <ol><li> ; 때 드라이 아이스로 냉각의 다른 속도로 이어지는, 우리가 프로토콜의 제안이 정확한 cryovials 또는 원뿔 튜브를 사용하지 않으면 </li><li> , 하위 최적의 냉각 속도로 이어지는, 분말 드라이 아이스를 사용하지 않으면 </li><li> 가난한 다산과 남성의 물고기를 사용 : 당신은 한 남성으로부터 정자 최소한 1 μl를해야합니다. 그것이 100 % 다산 접근하는 것은 매우 신선한 정자를 필요하기 때문에 당신은 또한 신선한 정자와 체외의 수정에를 수행하여 남성 불임을 테스트할 수 있지만이 오해하실 수 있습니다. 더 크고 견고하게 색깔 남성은 일반적으로 더 높은 품질의 정자를 제공합니다. </li><li> 에서 체외의 수정에 하위 표준 품질 계란을 사용합니다. 아무것도하지만 완벽한 클러치를 사용하면 항상 0 % 다산 가까운, 심지어 실제로 좋은 다산 (중복 유리병의 불​​임에 따라)가 정자 샘플에서 발생합니다. </li></ol>

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>10 &mu;l disposable pipettes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>22-358697</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Watch glasses</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pyrex</td>
<td>9985-75</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2 ml cryogenic vials</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>430488</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 x 10 cryoboxes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nalgene</td>
<td>03-337-7AA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15 ml conical tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>352099</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tongs</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Health Care</td>
<td>10-316B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cryofreezer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Taylor-Warton</td>
<td>K-series</td>
<td>For example</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

a high-throughput method for zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization

이것은 하비 방법 (하비 외., 1982)의 적응이다 zebrafish의 정자 cryopreservation위한 방법입니다. 우리는 모두 절차를 간소화하고 향상 샘플 균일성 원래 프로토콜 두 가지 변경 사항을 도입했습니다. 첫째, 우리는 cryoprotectant를 포함하지 않는 동결 미디어를 사용하는 모든 정자 볼륨을 정상화. 둘째, cryopreserved 정자 대신 모세관 튜브의 cryovials에 저장됩니다. (δ ° C / 시간)를 동결 융해 정자의 가격은 아마도이 프로 시저에서 제어하는​​ 두 가지 가장 중요한 변수이다. 이러한 이유로, 지정된들을 위해 다른 튜브를 대체하지 않습니다. 그것이 팀 작업하면 ~ 2 시간에 팀 당 100 남성의 정자를 동결 수 있습니다. 정자는이 프로토콜을 사용하면 25 % 다산의 평균을 가지고 (수정된 달걀의 총 수로 나눈 체외의 수정에에서 발생 가능한 배아의 숫자로 측정)이 %로 다산은 많은 년간 안정 cryopreserved.

Watch this Scientific Journal Video about A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization at JoVE.com

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

이것은 zebrafish에 대한 높은 처리량 정자 cryopreservation 프로토콜입니다. 정자는이 프로토콜을 사용하면 이후의 체외 수정에 25 % 다산의 평균을 가지고 있으며, 수년 동안 안정 cryopreserved.

높은 처리량 Zebrafish의 정자 Cryopreservation에 대한 방법과 체외에서 수정

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

a-high-throughput-method-for-zebrafish-sperm-cryopreservation-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

30.8K 조회수.  University of California, Davis. 이것은 zebrafish에 대한 높은 처리량 정자 cryopreservation 프로토콜입니다. 정자는이 프로토콜을 사용하면 이후의 체외 수정에 25 % 다산의 평균을 가지고 있으며, 수년 동안 안정 cryopreserved.

비디오: A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

세계 S. cerevisiae의에서 organelle 형태를 연구하기 위해 높은 처리량 방법

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

연구

생물학

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

인간 사전 mRNA에 매핑 Ribonucleoproteins에 대한 신속한 하이 스루풋 방법 (RNPs)

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping project is to collect a tissue sample from each individual plant. The traditional approach to this task is to sample plants one-at-a-time. If one wishes to genotype hundreds or thousands of individuals, however, using this strategy results in a significant bottleneck in the genotyping pipeline. The Ice-Cap method that we describe here provides a high-throughput solution to this challenge by allowing one scientist to collect tissue from several thousand seedlings in a single day 1,2. This level of throughput is made possible by the fact that tissue is harvested from plants 96-at-a-time, rather than one-at-a-time.
The Ice-Cap method provides an integrated platform for performing seedling growth, tissue harvest, and DNA extraction. The basis for Ice-Cap is the growth of seedlings in a stacked pair of 96-well plates. The wells of the upper plate contain plugs of agar growth media on which individual seedlings germinate. The roots grow down through the agar media, exit the upper plate through a hole, and pass into a lower plate containing water. To harvest tissue for DNA extraction, the water in the lower plate containing root tissue is rapidly frozen while the seedlings in the upper plate remain at room temperature. The upper plate is then peeled away from the lower plate, yielding one plate with 96 root tissue samples frozen in ice and one plate with 96 viable seedlings. The technique is named "Ice-Cap" because it uses ice to capture the root tissue. The 96-well plate containing the seedlings can then wrapped in foil and transferred to low temperature. This process suspends further growth of the seedlings, but does not affect their viability. Once genotype analysis has been completed, seedlings with the desired genotype can be transferred from the 96-well plate to soil for further propagation. We have demonstrated the utility of the Ice-Cap method using Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings. We expect that the method should also be applicable to other species of plants with seeds small enough to fit into the wells of 96-well plates.

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

The Ice-Cap method allows one to grow plants in 96-well plates and non-destructively harvest root tissue from each seedling. DNA extracted from this root tissue can be used for genotyping reactions. We have found that Ice-Cap works well for Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings.

얼음 총액 : 성장을위한 방법 Arabidopsis높은 처리량 Genotyping을위한 96 - 웰 플레이트에와 토마토 식물

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

Lipidic Bicelle 방법을 사용하여 막 단백질의 높은 처리량 결정

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies. Many of these valuable animals exist only as live animals, with no backup plan in case of emergency. Cryopreservation of embryos can provide this backup, but is costly, can be a lengthy procedure, and generally requires a large number of animals for success. Since the discovery that mouse sperm can be successfully cryopreserved with a basic cryoprotective agent (CPA) consisting of 18&#37; raffinose and 3&#37; skim milk, sperm cryopreservation has become an acceptable and cost-effective procedure for archiving, distributing and recovery of these valuable strains.
 Here we demonstrate a newly developed I&bull;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Sperm from five commonly-used strains of inbred mice were frozen using this kit and then recovered. Higher protection ratios of sperm motility (&gt; 60&#37;) and rapid progressive motility (&gt; 45&#37;) compared to the control (basic CPA) were seen for sperm frozen with this kit in 5 inbred mouse strains. Two cell stage embryo development after IVF with the recovered sperm was improved consistently in all 5 mouse strains examined. Over a 1.5 year period, 49 GM mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&bull;Cryo kit and later recovered by IVF.

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&amp;middot;Cryo Kit

Here we demonstrate the newly developed I&#x2022;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Two-cell stage embryo development with frozen-thawed sperm was improved consistently in 5 mouse strains with the use of this kit. Over a 1.5 year period, 49 genetically modified mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&#x2022;Cryo kit and later successfully recovered by IVF.

전 · Cryo 키트를 사용하여 마우스 정자 Cryopreservation 및 복구

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

The measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function assessment. Currently, investigators determine GFR by measuring the level of the endogenous biomarker creatinine or exogenously applied radioactive labeled inulin (3H or 14C). Creatinine has the substantial drawback that proximal tubular secretion accounts for ~50% of total renal creatinine excretion and therefore creatinine is not a reliable GFR marker. Depending on the experiment performed, inulin clearance can be determined by an intravenous single bolus injection or continuous infusion (intravenous or osmotic minipump). Both approaches require the collection of plasma or plasma and urine, respectively. Other drawbacks of radioactive labeled inulin include usage of isotopes, time consuming surgical preparation of the animals, and the requirement of a terminal experiment. Here we describe a method which uses a single bolus injection of fluorescein isothiocyanate-(FITC) labeled inulin and the measurement of its fluorescence in 1-2 &mu;l of diluted plasma. By applying a two-compartment model, with 8 blood collections per mouse, it is possible to measure GFR in up to 24 mice per day using a special work-flow protocol. This method only requires brief isoflurane anesthesia with all the blood samples being collected in a non-restrained and awake mouse. Another advantage is that it is possible to follow mice over a period of several months and treatments (i.e. doing paired experiments with dietary changes or drug applications). We hope that this technique of measuring GFR is useful to other investigators studying mouse kidney function and will replace less accurate methods of estimating kidney function, such as plasma creatinine and blood urea nitrogen.

Measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard for kidney function assessment. Here we describe a high-throughput method which allows the determination of GFR in conscious mice by using a single bolus injection, determination of fluorescein isothiocyanate (FITC)-inulin in plasma and calculation of GFR by a two-phase exponential decay model.

의식 쥐의 사구체 여과율의 측정을위한 높은 처리량 방법

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for forward genetic analysis of developmental processes due to their external fertilization, embryonic size, rapid ontogeny, and optical clarity &#8211; a constellation of traits that enable the direct observation of events ranging from gastrulation to organogenesis with a basic stereomicroscope. Further, zebrafish embryos can survive for several days in the haploid state. The production of haploid embryos in vitro is a powerful tool for mutational analysis, as it enables the identification of recessive mutant alleles present in first generation (F1) female carriers following mutagenesis in the parental (P) generation. This approach eliminates the necessity to raise multiple generations (F2, F3, etc.) which involves breeding of mutant families, thus saving the researcher time along with reducing the needs for zebrafish colony space, labor, and the husbandry costs. Although zebrafish have been used to conduct forward screens for the past several decades, there has been a steady expansion of transgenic and genome editing tools. These tools now offer a plethora of ways to create nuanced assays for next generation screens that can be used to further dissect the gene regulatory networks that drive vertebrate ontogeny. Here, we describe how to prepare haploid zebrafish embryos. This protocol can be implemented for novel future haploid screens, such as in enhancer and suppressor screens, to address the mechanisms of development for a broad number of processes and tissues that form during early embryonic stages.

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

반수체 제브라 피쉬 배아의 생산에 의해<em&gt; 체외</em&gt; 시비

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology due to their considerable degree of genetic conservation with humans. Chemical genetics entails testing the effect that small molecules have on a biological process and is becoming a popular translational research method to identify therapeutic compounds. Zebrafish are specifically appealing to use for chemical genetics because of their ability to produce large clutches of transparent embryos, which are externally fertilized. Furthermore, zebrafish embryos can be easily drug treated by the simple addition of a compound to the embryo media. Using whole-mount in situ hybridization (WISH), mRNA expression can be clearly visualized within zebrafish embryos. Together, using chemical genetics and WISH, the zebrafish becomes a potent whole organism context in which to determine the cellular and physiological effects of small molecules. Innovative advances have been made in technologies that utilize machine-based screening procedures, however for many labs such options are not accessible or remain cost-prohibitive. The protocol described here explains how to execute a manual high-throughput chemical genetic screen that requires basic resources and can be accomplished by a single individual or small team in an efficient period of time. Thus, this protocol provides a feasible strategy that can be implemented by research groups to perform chemical genetics in zebrafish, which can be useful for gaining fundamental insights into developmental processes, disease mechanisms, and to identify novel compounds and signaling pathways that have medically relevant applications.

The zebrafish is an excellent experimental organism to study vertebrate developmental processes and model human disease. Here, we describe a protocol on how to perform a manual high-throughput chemical screen in zebrafish embryos with a whole-mount in situ hybridization (WISH) read-out.

Zebrafish의 배아를 사용하여 높은 처리량 접근 수동 작은 분자 화면

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

높은 처리량 응용 프로그램에 대한 성인 Zebrafish의 마음의 복구

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

후 전사적으로 규제 유전자의 화학 변조기에 대한 높은 처리량 검사

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...