Name: ploidy manipulation of zebrafish embryos with heat shock 2 treatment
Uploaded: 2016-12-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment at JoVE.com

This work was supported by NIH grants R21 HD068949-01 and RO1 GM065303.

매디슨과 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 가이드 라인 (위스콘신 대학 - - 매디슨 보증 번호 A3368-01) 모든 동물 실험은 위스콘신 대학에 따라 실시 하였다. 1. 중단 된 결합을 통해 계란 컬렉션 여성을 선택 참고 : IVF 기반 프로토콜 수동 압력 9 여성의 성숙한 계란의 압출에 의존하고 있습니다. 이전 프로토콜 난자 방출 거동을받은 암컷없이 탱크 또는 쌍 교배 직접 암컷을 사용했지만 (제브라 피쉬 라인에 따라 약 20 % 이하)이 여성의 단지 작은 분획은 수동 압력에 압출하고 유능한 계란을 얻었다. 개선 된 절차에서, 여성은 사전 분류 직접 육안으로 달걀 누워 위해, 상대의 즉각적인 중단 다음에 있습니다. 이 절차는 거의 모든 여성이 돌출하고 유능한 계란이 중단 짝짓기 단계 수율을 통해 미리 선택, 매우 효과적이다수동 압력에 따라. <ol><li> 실험 전에 오후, 표준 제브라 피쉬 상대 상자에서 원하는 제브라 피쉬 변형의 결합 쌍을 설정합니다. 상대 상자 분할을 통해 또는 알을 낳는 삽입에서 남성과 삽입 내부에 여성을 배치하여 하나, 아직 물리적으로 분리 여성과 동일한 챔버 내에서 남성을 유지합니다. </li><li> 그 상대가 시작되도록 실험의 아침, 같은 알을 낳는 삽입 내에서 남성과 여성 모두를 배치, 물리적 파티션을 제거합니다. </li><li> 시각적으로 자연 교배 동안 계란의 압출을 검출하기 위해 결합 쌍을 포함하는 탱크를 검사합니다. 계란 돌출, 별도의 남성과 여성의 첫 번째 징후에서 번식을 중단합니다. 남성에서 분리 한 후, 미리 선택된 여성 개별적 또는 동일한 탱크에 모으고 유지. (일반적으로 50-150 계란 / 여성) 원하는 배아의 수에 따라 여러 암컷을 사용합니다. </li></ol> 2. 정자 솔루션을 준비 참고 : IVF r에정자 솔루션 성숙 계란의 노출에 elies. 이 솔루션은 (HS2 처리에 동형 접합 이배체 배아가) 반수체 접합체를 생성하기 위해, 또는 (HS2 처리 될 배체 배아에있는) UV 처리 이배체 접합체를 생성하기 위해, 치료가 될 수 있습니다. 이전 정자 제조 프로토콜은 실시간 남성의 항문 영역으로부터 이리를 수집 모세관의 사용을 제안하지만, 남성의 단지 작은 분획이 이리 9 수득 이것은 비효율적 인 방법이었다. 아래에 제시 프로토콜은보다 안정적인 결과를 얻을 수 전단 해부 고환에서 정자의 준비, 대신에 의존합니다. <ol><li> (해결 1, 2, 4 및 5)의 모든 구성 요소 포함하는 앞서 행크의 프리믹스 용액으로서 시간 행크 용액을 제조 중탄산 나트륨 용액을 제외하고 (용액 6). 실험 (표 1)의 아침을 해결 6 신선한를 준비하고 예비 혼합물에 추가 할 수 있습니다. 행크스 &#39;솔루션 (최종 솔루션을 위해 아침을 준비IVF 절차) 행크의 프리믹스 990 UL 및 갓 만든 용액 (6)의 10 μL를 결합한다. </li><li> 에어컨 물에 0.016 % 용액으로 tricaine에 과다 노출로 남성을 안락사. <ol><li> 물에 0.2 % 원액으로 tricaine을 준비합니다 (1M 트리스 pH를 9.0으로 pH 7.0 버퍼)와 4 ℃에서 보관하십시오. 비커에 물 100ml 당 tricaine 주식 솔루션 8 ML을 추가하고 tricaine 솔루션에 남성을 전송 그물을 사용합니다. </li><li> (100 μL / 클러치 (10) 클러치를 비옥하게하기 위해, 1 ml의 행크의 솔루션에서 수집 된 10 명의 남성에서 예를 들어 고환) 남성 당 100 μL에 해당하는 행크의 솔루션의 볼륨에 수정 된 될 필요가 클러치 당 하나의 남성에 대한 고환의 동등한를 사용합니다. </li><li> 15 분 동안 아가미 운동의 중단에 의해 안락사를 확인합니다. 안락사 후, 숟가락 비커에서 남성을 제거합니다. 컨디셔닝 물을 간략하게 남성을 씻어과의 여러 위치에 간단히 배치하여 그들을 가볍게 건조종이 타월. </li></ol></li><li> 고환, 해부 가위 또는 면도날을 사용하여 첫 번째 목을 벨 안락사 남성을 제거하고, 반사 된 광원 scissors.Under에게 해부 현미경을 해부와 복부를 따라 길이 절단을, 해부 집게와 내부 장기를 제거하십시오. 집게와 고환의 질량을 각각 잡아 당겨 행크의 솔루션을 포함하는 microcentrifuge 관 내부에 배치합니다. 주 : 고환 배설강 근처 수렴 개의 기다란 몸체 벽 옆에 발견 반투명 외관 구조 및 각각 식별 할 수있다. 고환은 절개 후 페트리 접시 표면에와 ​​행크의 솔루션에 배치하기 전에 2 ~ 3 분을 머물 수 있습니다. </li><li> 좁은 주걱으로 고환 전단 및 / 또는 부드럽게 공기 방울 형성을 피하면서, 최대 피펫 팅과 1000 μL 팁 마이크로 피펫과 솔루션에서 아래로 5 ~ 6 배의 고환에 의해 용액에 정자를 놓습니다. 고환 파편 정착하자. </li><li> 이 최대 2 ~ 3 시간 동안 그 효력을 유지할 수 얼음의 정자 솔루션을 저장합니다. 정자 용액의 UV 처리로 진행하는 경우, 뒤에 고환의 조각을 떠나 깨끗한 microcentrifuge 관에 솔루션을 전송합니다. </li></ol> 3. UV 처리 주 : UV 처리는 배아 비활성 렌더링하기 위하여 정자 DNA를 가교하기 위해 사용된다. gynogenetic 반수체 또는 동형 접합 gynogenetic 배체 배아를 생성 할 때이 단계에만 사용됩니다. UV 처리를위한 정자 용액이 고환 (단계 2.4)의 조각에서 분리되어야, 큰 조각은 UV 처리에서 정자를 보호 할 수 있습니다. <ol><li> 얼음 침대에 앉아 우울증 유리판의 깨끗하고 마른 우물 (페트리 접시 안에 예를 들어 얼음)에 정자 솔루션을 전송합니다. 물론 유리 접시 당 정자 액 1ml까지 사용할 수 있습니다. </li><li> 자외선 램프 하에서 얼음 침대에 오목 유리판을 배치하여 UV에 정자 용액을 노출. 115 V (60 Hz에서 90 초 동안 정자 솔루션을 치료, 0.68A)는 19cm (7.5 인치) 거리에서 UV 램프. 피펫 팁의 끝으로 부드럽게 UV 치료 중 매 30 초 (깨끗한 피펫 팁 매 30 초를 사용) 솔루션을 섞는다. </li><li> 깨끗한 피펫 팁 및 마이크로 피펫을 사용하여, 새로운 마이크로 원심 튜브에 처리 정자 용액 옮긴다. (추출 2-3 시간보다 더 이상) IVF에 필요한까지 얼음에 보관하지 않는다. </li></ol> 성숙한 계란 4. 수동 압출 참고 : 쉽게 마취 및 수동 압력 계란을 얻을 것입니다 자연 교배의 중단에 의해 얻어진 여성. 이 절차를 수행하는 동안, tricaine 처리는 신중하게 여성의 복구를 방지 할 수있다 과다 노출을 방지하기 위해 제어되어야한다. <ol><li> tricaine 솔루션에 빛 노출에 의한 여성 마취 : 컨디셔닝 물에 솔루션을 tricaine하는 순으로 전송 암컷 물고기 정지 할 때까지 약 2-5 분 동안 (조건 물고기 물 8 Tricaine 0.2 % 원액의 ml를 100 ml에 첨가하여 만든) 아가미 운동. </li> &lt;리는&gt; 곧 여성이 아가미의 움직임을 정지 한,를 수집하고 간략하게 조절 된 물에 씻어 숟가락을 사용합니다. 그럼에도 불구하고, 물고기를 이동 종이 타월의 여러 위치에 간단히 반복 배치하여 가볍게 건조하고 깨끗하고 마른 10cm 직경 페트리 접시에 전송하는 숟가락을 사용. 잠재적으로 아가미 아가미 손상을 방지하기 위해, 후방 방향으로 전방에있는 스푼으로 물고기를 접근. </li><li> 중간에 물에 의해 활성화되는 모든 발표 계란을 방지하기 위해, 부드럽게 더 뒷 지느러미 영역을 건조 실험실 천이나 부드러운 티슈를 사용합니다. 손가락을 완충하는 것은 물을 살짝 (그들에게 물고기 비늘을 고집 피하기 위해) 지원 등 여성의 뒤쪽에 한 손의 손가락 하나를 배치하고 계란이 돌출 될 때까지 다른 손의 손가락으로 여성의 복부를 따라 약간의 압력을 적용합니다. </li><li> 여성의 몸에서 계란을 멀리 이동하는 좁은 주걱을 사용합니다. 복구를위한 조절 된 물 탱크로 다시 여성을 놓습니다. <br/&gt; 참고 : 여성이 그녀의 몸의 한쪽에 누워있는 동안 계란 압출되면, 그녀가 뒤집어 될 수 있으며, 그녀의 다른 측면에 반복 프로세스가 추가 계란을 얻었다. , 여성의 전체 복구를 보장 복부 만 부드러운 수동 압력을, 미만 2 분 물로 돌아 아가미 운동 정류장에서 절차를 수행합니다. </li><li> (물 노출) 활성화 및 압출 후 동시에 90 초 이내에 (정자 솔루션 첨가) 계란을 기름지게 (5 장 참조). </li></ol> 시험관 아기 (5) 참고 : 자연 십자가에서 Zebrafish의 수정은, 외부 결합 동안 달걀 물과 정자에 의해 동시 발매 및 활성화에 따라 달라집니다. 물의 존재에 정자 용액에 계란을 노출하여 체외 수정을 모방에서이 과정. 물의 양이 유효 정자의 농도를 증가시키기 위해 (1 mL)을 원래 작다. 정자에 의해 바인딩 15 ~ 20 초 10 &lt;내에서 발생/ SUP&gt;, 물 체적은 증가 될 수있다. 융모막 정자가 11, 12 바인딩에 대한 능력의 창을 제한하여 클러치의 마지막 동기화에 더 기여를 해제. 생성 된 배아 따라서 초기 절단 단계 동안 거의 동시에, 세포 분열주기를 나타낸다. <ol><li> (한 남성의 고환에 해당에 해당 - 제 2 부 참조) 정자 용액 100 μl를 추가 페트리 접시에 압출 계란의 클러치를. 조심스럽게 달걀 손상을 방지하기 위해 배양 접시의 표면에서 팁을 들어 올리지해야되고, 함께 정자와 계란을 섞어 계란 중 정자의 솔루션을 추가하는 데 사용 피펫 팁을 소용돌이 친다. </li><li> 즉시 배아 매체 (E3) 용액 1 ㎖를 추가하여 계란을 활성화 부드럽게 피펫 팁과 소용돌이로 다시 부드럽게 계란을 섞어 정자 (에어컨 물은 또한 부품 (7)을 통해 5 E3에 대한 대체 가능). 수정에 타이밍 상대를 시작하는 타이머를 시작합니다. </l난&gt; <li> 1 ml의 볼륨 1 MPF에, E3와 함께 접시 홍수. 계속하기 전에 전체 융모막 확장을 포함하여 계란 활성화를 허용하기 위해 10 ~ 12 MPF 때까지 그대로 둡니다. </li></ol> 6. 열 충격 치료 주 : 초기 배아 적용 열충격 후속 세포주기 중에 2 스핀들 형성을 구동 중심 소체 불완전한 보수 결과 중심 소체 복제를 억제한다. 고랑 형성 (13)의 부족 턴 결과 스핀들의 부재. <ol><li> chorions의 확장 (10 ~ 12 MPF) 후, 차 여과기에 페트리 접시에서 배아를 붓는다. 차 여과기에 남아있는 배아를 수집하기 위해 E3와 세척 병을 사용하여 배양 접시를 씻어. </li><li> 28.5 ° C에서 E3와 예열 목욕 비커 내부의 배아와 차 여과기를 놓습니다. 수조 온도 비커와 E3 사전 평형, 충분한 E3가 확인되도록 차의 모든 배아스트레이너는 상기 매체에 노출된다. </li><li> 22 MPF에서 짧게는 28.5 ° C의 물을 욕조에서 차 여과기를 제거 여분의 수분을 제거하고 종이 타월에 그것을 가릴 및 41.4 ° C에서 열 목욕 유사 예열 E3 비커 내부에 배치합니다. </li><li> 24 MPF에서 간단한 블로 팅 후 28.5 ° C의 물을 욕조에 다시 E3에 차 여과기를 전송합니다. 29 MPF에서, 10cm 페트리 접시에 차 여과기에서 배아를 전송하는 E3와 세척 병을 사용합니다. </li></ol> 한 번의 사이클 세포질 분열 스톨와 태아 7. 선택 <ol><li> 기간 35-45 MPF 동안 송신 광원 해부 현미경 하에서 2- 세포 단계로 대칭 분해가 진행하고있는 그 배아 따라서 수정 된 선택된다. 세포 분열을 겪고되지 않은 배아를 제거합니다. </li><li> 최초의 세포주기 동안 정상적인 세포 분열에 대해 선택한 수정 된 배아를 관찰 계속하고 초 동안번째 세포주기 (50-65 MPF). </li><li> 4 셀 ( &quot;아니오 스톨&quot;를 2 : 4 셀 배아 2 배치 표준) 다음과 같은 범주 (그림 2C)에 따라 정렬 배아; 3 세포 (탈선이 작은 세포에서 &quot;부분 스톨 &#39;1 대 세포 배열); 2 셀 (: 2 세포 배아의 것과 동일한 구성 일 배아 1에서 하나의 세포주기의 지연을 나타내고, &quot;정체&quot;). 신선한 페트리 접시에 멈춘 배아를 정렬합니다. 주 :이 단계에서, 배아 2 : 두 배열은도 할구는 세포 분열 스톨을받은 제 세포주기 중 어느 형태와 대응한다; 탈선이 작은 세포 배아 1 대 세포 배열 열충격 한 할구의 두번째 세포주기 동안에 세포주기 스톨을 야기하지만, 다른 곳없는 것에 대응한다; 배아 1의 &quot;정체&quot;1 배열은 제 2 셀 사이클 동안 모두 할구 원하는 세포 분열을 시행 여기서 그 대응마구간. 지연된 배아 다음 세포주기의 기간 (65-80 MPF) 동안 세포 분열을 계속한다. 할구의 배열은 스핀들 2,14 안정화에 의한 이전의 세포주기에서 불완전 단서로 가변 될 수 있지만, 대부분의 정상적인 배아 발달을 겪을 수있는 비교적 정상적인 포배를 형성 할 것이다. </li><li> 배아가 10cm 접시 당 80 배아의 한계로, 페트리 접시에 개발할 수 있습니다. 24 HPF, 그들은 감소 축 연장 달리 이배체 또는 동형 이배체 배아 6 (축 연장 (도 3A, 3C)의 정상 범위)의 통상의 형태 특성을 갖고 haploids 증가 바디 두께 특성 여부를 확인하기 위해 배아 관찰 (그림 3B)), 및 / 또는 황금 또는 흰둥이 및 기타 분석 등 36 MPF (그림 3, 아래 참조) 2,6,9에서 유전 안료 마커를 사용하여 diploidization을 평가. </li&gt; <li> 반수체 형태를 가지고, 또는이 용해거나 다른 조잡한 이상 결함을 전시 나타나는 배아를 제거합니다. 참고 : 원하는 경우, 매일 용해 또는 조잡한 이상 배아를 제거하기 위해 계속하고 매체를 새로 신선한 E3를 추가하는 동안 배아가 5 일 포스트 수정 될 때까지 개발을 할 수 있습니다. 참고 : 살아남은 배아는 또한 부화장 시스템에 전송하고 표준 조건 하에서 공급함으로써 5 일에 swimbladder 인플레이션 후 성장시킬 수있다. </li></ol>

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The authors do not have competing financial interests.

중요한 단계 체외 수정에 효과적 조건에서 작동하는 것이 중요합니다. 성숙한 계란 (1 단계)의 좋은 공급을 보장하기 위해, 암컷이 짝짓기에 대한 설정은 적어도 5 일 동안 짝짓기 십자가에 설정 한 안하고 임신하는 표시해야합니다. 사육 중단하는 동안, 관찰자는 자연 계란 압출의 첫 등장에 대해 적절하게 15 ~ 30 탱크를 모니터링 할 수 있습니다. 제 달걀 가장 계란은 IVF 절차에...

이 프로토콜은 gynogenetic haploids (그림 1) 또는 tetraploids의 생산에서 동형 접합 gynogenetic diploids의 생성에서와 같이 제브라 피쉬 배아의 배수성의 조작을 할 수 있습니다. 이것은 정확히 하나의 세포주기 (도 2A, 2B)에 대응하는 세포질 분열에 지연을 유도함으로써 달성된다. 세포질 분열의 중요한 한주기 지연은 열 충격으로 처리함으로써 달성된다. 같은 원래 Streisinger에 동료에 의해 설명 열 충격 (HS)의 표준 프로토콜은 최초의 세포주기 (1) 동안 한주기 세포 분열 마구간의 결과로, 기간 13 ~ 15 MPF 동안 온도 펄스를 포함했다. 이 프로토콜의 효율은 최근 열 충격 처리 슬라이딩 시간 윈도우 초기 세포주기 스캔에 의해 개선되었다. 이 검사는 여전히 최초의 세포주기 (22 ~ 24 MPF) 내에서, 열 충격에 대한 나중에 포인트를 확인하는 EMBR의 높은 비율의 결과이 경우 제 2 셀이 사이클에 영향을주는 하나의 사이클 세포 분열 실속과 YOS. 제 세포주기 동안 실험 조작은 2 셀 사이클 동안 세포 분열을 방해 DNA를 콘텐츠 복제를 일으킬 관찰은 또한 다른 어류 3,4-보고되었다. 용어 &quot;2&quot;히트 펄스 표준 HS 방법보다 이후 시점에서 발생하고, HS2에 의한 세포주기 지연이 제 2 셀의주기 동안 발생하는 반사 - 우리는 열 충격이 (HS2와 같은 변형 된 프로토콜 참조 ). 이러한 연구는 열 쇼크 후 세포질 분열 구속의 기초는 다음의 세포주기에서 스핀들 형성 및 유도를 밭고랑에 영향 히트 펄스 중에 중심 소체 복제의 억제는 것을 보여 주었다. HS2의 100 %에 가까워 세포주기 정지의 수율 결과, 표준 HS 2보다 4 배 이상으로 배수성 복제까지의 요금. 태아 치료 재치하 할구 세포 사이클링 동안 열 충격이 많은 악영향을 전시, 그 열 충격을 제안하는 것은 세포 분열이 필요한 여러 프로세스에 영향을 미칩니다. 열 쇼크가 세포 사이클 (기간 0-30 MPF)의 개시 이전에인가되는 반면에, 만약 그 중심 소체 복제와 특이 간섭 일관된 효과를 보이며 다른 중요한 세포 과정이 영향을 미치는 것으로 보이지 않는다 . 이 연구는 할구 분할의 개시 이전에 시간이 특히 중심 소체 억제를 통해 배수성을 조작하는 도구로 열 충격을 사용하는 의무가 발달 기간이 나타납니다 것으로 나타났다. 중심 소체 복제에 열 쇼크를위한 명백한 선택의 근본적인 원인은 알 수 있지만, 이러한 오 백혈구 세포와 같은 특정 유형의 열 스트레스 하에서 관찰 중심체 하부 구조의 선택적 분해와 관련 될 수있다. 배아 드의 시간 동기화velopment은 체외 수정 (IVF)에 의해 달성된다. 에 배체가 하나의 사이클 세포질 분열의 실속 HS2에 의한 이배체 배아에서 수정 결과 중 처리되지 않은 정자를 사용. 그 DNA를 불 활성화 가교, 하나의 사이클 세포질 분열 스톨이 gynogenetic diploids이 될 HSII 유도에 gynogenetic 반수체 배아 (6) 결과를 전달 UV 처리 된 정자의 사용. 때문에 결과 전체 게놈 중복의, 후자 gynogenetic diploids는 게놈에 걸쳐 하나 하나 현장에서 동형 접합이다. 간결함을 위해, 우리는 &quot;haploids&quot;및 &quot;동형 접합 diploids&quot;로 동형 접합 gynogenetic 이배체 배아로 반수체 배아를 gynogenetic을 참조하십시오. 가능한 비옥 한 경우, 동형 접합 diploids 멸균 및 치명적인없는 라인을 시작하는 데 사용할 수 있습니다. HS2에 의한 직접 동형 접합체는 쉽게 피 시험 메모리의 이형 캐리어 인 여성에서 동형 접합 diploids 때문에, 유전자 분석이나 유전 화면에 통합되어야한다높은 고정 (50 %)의 비율을 2 동형 접합체의 관리 포인트 전시 속도. 다음 프로토콜은 HS2을 수행하고 전체 동형 접합체와 배수성 중복을 유도하는 단계를 설명합니다. 배체 생산을 위해, 정자 솔루션은 치료해야한다. 동형 이배체 제조 정자는 UV 처리에 의해 불 활성화되어야한다. 논의에서 설명 된 바와 같이 또한 가시 안료 마커는 동형 diploids의 식별을 용이하게하기 위해 사용될 수있다. 최상의 결과를위한 IVF 절차가이 기간 내에 발생해야하므로 주로 자신의 빛을주기 7, 두 성인과 계란의 시작의 처음 3 시간 동안 Zebrafish의 친구는 활동 일주기 (8)에 민감합니다.

<table><tbody><tr><td>Zebrafish mating boxes</td><td>Aqua Schwarz</td><td>SpawningBox1</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;-7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>63138</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Western Chemical</td><td>Tricaine-D (MS 222)</td><td>FDA approved (ANADA 200-226)</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma</td><td>77-86-1</td><td>to prepare 1 M Tris pH 9.0</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>920-1</td><td>to prepare 1 M Tris pH 9.0</td></tr><tr><td>Fish net (fine mesh) (4-5 in)</td><td>PennPlax</td><td>(ThatFishThatPlace # 212370)</td><td>available in ThatFishThatPlace</td></tr><tr><td>Plastic spoon</td><td></td><td></td><td>available in most standard stores</td></tr><tr><td>Dissecting scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14091-09</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting forceps</td><td>Dumont</td><td>SS</td><td>available from Fine Science Tools</td></tr><tr><td>Dissecting stereoscope (with transmitted light source)</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Reflective light source (LED arms)</td><td>Fostec</td><td>KL1600 LED</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Petri plates 10 cm diameter</td><td></td><td></td><td>any maker</td></tr><tr><td>Eppendorf tubes 1.5 ml</td><td></td><td></td><td>any maker</td></tr><tr><td>Ice bucket</td><td></td><td></td><td>any maker</td></tr><tr><td>Pipetteman P-1000</td><td></td><td></td><td>any maker</td></tr><tr><td>Pipette tips 1,000 &amp;micro;l</td><td></td><td></td><td>any maker</td></tr><tr><td>Narrow spatula</td><td>Fisher</td><td>14-374</td><td></td></tr><tr><td>Depression glass plate</td><td>Corning Inc</td><td>722085 (Fisher cat. No 13-748B)</td><td>available from Fisher Scientific</td></tr><tr><td>UV lamp</td><td>UVP</td><td>Model XX-15 (cat No. UVP18006201)</td><td>available from Fisher Scientific. Although not observed by us with this model, some UV sources have been observed to experience a decrease of intensity over time (if this is the case, see Modifications and Troubleshooting)</td></tr><tr><td>UV glasses</td><td></td><td></td><td>any maker</td></tr><tr><td>Paper towels</td><td></td><td></td><td>any maker</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>06-666-11</td><td>available from Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Timer stop watch</td><td></td><td></td><td>any maker</td></tr><tr><td>Wash bottle</td><td>Thermo Scientific</td><td>24020500</td><td>available from Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Tea strainer</td><td></td><td></td><td>available in kitchen stores</td></tr><tr><td>beakers, 250 ml (2)</td><td>Corning Inc.</td><td>1000250</td><td>available from Fisher Scientific</td></tr><tr><td>water bath (2)</td><td></td><td></td><td>any maker, with accurary to 0.1 C (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Shel Lab H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O Bath Series)</td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; Solution 1</td><td>see above</td><td>see above</td><td>8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. Store at 4&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; Solution 2</td><td>see above</td><td>see above</td><td>0.358 g Anhydrous Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 0.6 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; in 100 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; Solution 4</td><td>see above</td><td>see above</td><td>0.72 g CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; in 50 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Hank&#039;s Premix</td><td>see above</td><td>see above</td><td>add, in the following order: 10.0 ml Solution 1;&amp;nbsp; 1.0 ml Solution 2;&amp;nbsp; 1.0 ml Solution 4;&amp;nbsp; 86.0 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O;&amp;nbsp; 1.0 ml Solution 5. Store at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; Solution 6</td><td>see above</td><td>see above</td><td>0.33 g NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; in 10 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. Prepare fresh the morning of the IVF procedure.</td></tr><tr><td>Hank&#039;s Solution (final solution)</td><td>see above</td><td>see above</td><td>Combine 990 &amp;mu;l of Hank&amp;rsquo;s Premix and 10 &amp;mu;l of freshly made Solution 6 (NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; solution)</td></tr></tbody></table>

ploidy manipulation of zebrafish embryos with heat shock 2 treatment

배수성의 조작은 diploids에 tetraploids에 diploids, 또는 haploids 유용한 변환, 수 있습니다. 그것은 단일 이형 어머니 동질 접합체의 직접 제작이 가능하기 때문에 제브라 다니오 레 리오의에서는 특별히 동형 gynogenetic diploids 생성 유전자 분석에 유용하다. 이 문서에서는 첫 번째 세포주기, 열 쇼크 2 (HS2) 동안 열 펄스에 따라 배수성 복제에 대한 수정 된 프로토콜을 설명합니다. 중심 소체 복제의 억제를 통해,이 방법은 제 2 셀주기 동안 정확한 세포 분열 스톨 초래한다. 영향을받지 DNA 복제에 결합 정확한 하나의 사이클 부문 스톨은 전체 게놈 중복을 초래한다. 이 방법과 관련된 프로토콜은 하나의 세포주기 분할 지연과 배수성 중복을 일으킬 계란과 정자 수집, 정자의 자외선 치료, 체외 수정 및 열 펄스를 포함한다. 이 프로토콜의 수정 된 버전을 적용 할 수있다다른 동물 종의 배수성 변화를 유도한다.

한 셀 사이클 토키네 스톨에도 불구하고, DNA 복제 배아 (도 1)의 DNA 콘텐츠의 중복 결과, 예컨대 배아 정상적으로 발생한다. Streisinger에 열 충격 프로토콜 (표준 HS)는 기간 13~15분 게시물 수정 (MPF) 동안 열 펄스를 포함하고 파생 된 방법은 여기에 설명 된 반면, 35 MPF 1, 2에서 첫 번째 배아 세포 분열 동안 주로 세포질 분열 체포를 유도, 열 쇼크 2 (HS2)가, ?...

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Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

배수성 조작 수정 된 프로토콜은 초기 배아 세포질 분열에 한 사이클 실속을 유도하는 열 쇼크를 사용한다. 이 프로토콜은 제브라에서 설명되지만, 다른 종에도 적용 할 수있다.

열 충격이 치료와 제브라 피쉬 배아의 배수성 조작

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, ...

ploidy-manipulation-of-zebrafish-embryos-with-heat-shock-2-treatment

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.0K 조회수.  University of Wisconsin.  배수성 조작 수정 된 프로토콜은 초기 배아 세포질 분열에 한 사이클 실속을 유도하는 열 쇼크를 사용한다. 이 프로토콜은 제브라에서 설명되지만, 다른 종에도 적용 할 수있다. 

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Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA mutation rates. Changes in replication timing occur during development and in cancer, but the role replication timing plays in development and disease is not known. Zebrafish were recently established as an in vivo model system to study replication timing. Here is detailed the protocols for using the zebrafish to determine DNA replication timing. After sorting cells from embryos and adult zebrafish, high-resolution genome-wide DNA replication timing patterns can be constructed by determining changes in DNA copy number through analysis of next generation sequencing data. The zebrafish model system allows for evaluation of the replication timing changes that occur in vivo throughout development, and can also be used to assess changes in individual cell types, disease models, or mutant lines. These methods will enable studies investigating the mechanisms and determinants of replication timing establishment and maintenance during development, the role replication timing plays in mutations and tumorigenesis, and the effects of perturbing replication timing on development and disease.

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Zebrafish were recently used as an in vivo model system to study DNA replication timing during development. Here is detailed the protocols for using zebrafish embryos to profile replication timing. This protocol can be easily adapted to study replication timing in mutants, individual cell types, disease models, and other species.

DNA 복제 타이밍 Zebrafish Vivo에서 모델 시스템으로 사용 하 여 프로 파일링

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

연구

유전학

Making Gynogenetic Diploid Zebrafish by Early Pressure

Heterozygosity in diploid eukaryotes often makes genetic studies cumbersome. Methods that produce viable homozygous diploid offspring directly from heterozygous females allow F1 mutagenized females to be screened directly for deleterious mutations in an accelerated forward genetic screen. Streisinger et al.1,2 described methods for making gynogenetic (homozygous) diploid zebrafish by activating zebrafish eggs with ultraviolet light-inactivated sperm and preventing either the second meiotic or the first zygotic cell division using physical treatments (heat or pressure) that deploymerize microtubules. The "early pressure" (EP) method blocks the meiosis II, which occurs shortly after fertilization. The EP method produces a high percentage of viable embryos that can develop to fertile adults of either sex. The method generates embryos that are homozygous at all loci except those that were separated from their centromere by recombination during meiosis I. Homozygous mutations are detected in EP clutches at between 50% for centromeric loci and less than 1% for telomeric loci. This method is reproduced verbatim from the Zebrafish Book3.

This is a method for generating gynogenetic diploid zebrafish embryos (embryos whose only genetic contribution comes from the mother) by blocking the second meiotic division immediately after fertilization with ultraviolet light-inactivated sperm. EP embryos are not fully homozygous due to recombination during the first meiotic division, however they are homozygous at all loci that have not been separated from their centromere by recombination.

초기 압력에 의해 Gynogenetic의 Diploid의 Zebrafish 만들기

Heterozygosity in diploid eukaryotes often makes genetic studies cumbersome. Methods that produce viable homozygous diploid offspring directly from ...

생물학

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

무지개와 타임랩스 공초점 이미징을 사용하여 살아있는 제브라피시의 뇌 발달 시각화

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...

발생학

Separation of Follicular Cells and Oocytes in Ovarian Follicles of Zebrafish

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of oocytes and surrounding follicular cells. It is vital to separate both follicular cells and oocytes for various research purposes such as for primary culture of follicular cells, analysis of gene expression, oocyte maturation and in vitro fertilization, etc. The conventional method uses forceps to separate both compartments, which is laborious, time consuming and has high damage to the oocyte. Here, we have established a simple method to separate both compartments using a pulled glass capillary. Under a stereomicroscope, oocytes and follicular cells can be easily separated by pipetting in a pulled fine glass capillary (the diameter depends on the follicle diameter). Compared with the conventional method, this new method has high efficiency in separating both oocytes and follicular cells and has low damage to the oocytes. More importantly, this method can be applied to early-stage follicles including at the pre-vitellogenesis stage. Thus, this simple method can be used to separate follicular cells and oocytes of zebrafish.

Here, we present a simple method for separating follicular cells and oocytes in zebrafish ovarian follicles, which will facilitate investigations of ovarian development in zebrafish.

얼룩말 피시의 난소 여포에서 여포 세포와 난소 세포의 분리

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of ...

Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos

Cytosine methylation is highly conserved across vertebrate species and, as a key driver of epigenetic programming and chromatin state, plays a critical role in early embryonic development. Enzymatic modifications drive active methylation and demethylation of cytosine into 5-methylcytosine (5-mC) and subsequent oxidation of 5-mC into 5-hydroxymethylcytosine, 5-formylcytosine, and 5-carboxylcytosine. Epigenetic reprogramming is a critical period during in utero development, and maternal exposure to chemicals has the potential to reprogram the epigenome within offspring. This can potentially cause adverse outcomes such as immediate phenotypic consequences, long-term effects on adult disease susceptibility, and transgenerational effects of inherited epigenetic marks. Although bisulfite-based sequencing enables investigators to interrogate cytosine methylation at base-pair resolution, sequencing-based approaches are cost-prohibitive and, as such, preclude the ability to monitor cytosine methylation across developmental stages, multiple concentrations per chemical, and replicate embryos per treatment. Due to the ease of automated in vivo imaging, genetic manipulations, rapid ex utero development time, and husbandry during embryogenesis, zebrafish embryos continue to be used as a physiologically intact model for uncovering xenobiotic-mediated pathways that contribute to adverse outcomes during early embryonic development. Therefore, using commercially available 5-mC-specific antibodies, we describe a cost-effective strategy for rapid and efficient spatiotemporal monitoring of cytosine methylation within individual, intact zebrafish embryos by leveraging whole-mount immunohistochemistry, automated high-content imaging, and efficient data processing using programming language prior to statistical analysis. To current knowledge, this method is the first to successfully detect and quantify 5-mC levels in situ within zebrafish embryos during early development. The method enables the detection of DNA methylation within the cell mass and also has the ability to detect cytosine methylation of yolk-localized maternal mRNAs during the maternal-to-zygotic transition. Overall, this method will be useful for the rapid identification of chemicals that have the potential to disrupt cytosine methylation in situ during epigenetic reprogramming.

This paper describes a protocol for the rapid and efficient spatiotemporal monitoring of normal and aberrant cytosine methylation within intact zebrafish embryos.

온전한 Zebrafish 배아 내에서 정상 및 비정상적인 시토신 메틸화에 대한 신속하고 효율적인 시공간 모니터링

Cytosine methylation is highly conserved across vertebrate species and, as a key driver of epigenetic programming and chromatin state, plays a critical ...

The Zebrafish Tol2 System: A Modular and Flexible Gateway-Based Transgenesis Approach

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) are characterized by a highly variable set of structural defects and cognitive impairments that arise due to prenatal ethanol exposure. Due to the complex pathology of FASD, animal models have proven critical to our current understanding of ethanol-induced developmental defects. Zebrafish have proven to be a powerful model to examine ethanol-induced developmental defects due to the high degree of conservation of both genetics and development between zebrafish and humans. As a model system, zebrafish possess many attributes that make them ideal for developmental studies, including large numbers of externally fertilized embryos that are genetically tractable and translucent. This allows researchers to precisely control the timing and dosage of ethanol exposure in multiple genetic contexts. One important genetic tool available in zebrafish is transgenesis. However, generating transgenic constructs and establishing transgenic lines can be complex and difficult. To address this issue, zebrafish researchers have established the transposon-based Tol2 transgenesis system. This modular system uses a multisite Gateway cloning approach for the quick assembly of complete Tol2 transposon-based transgenic constructs. Here, we describe the flexible Tol2 system toolbox and a protocol for generating transgenic constructs ready for zebrafish transgenesis and their use in ethanol studies.

This work describes a protocol for the modular Tol2 transgenesis system, a gateway-based cloning method to create and inject transgenic constructs into zebrafish embryos.

Zebrafish Tol2 시스템: 유연한 모듈식 게이트웨이 기반 트랜스제네시스 접근 방식

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) are characterized by a highly variable set of structural defects and cognitive impairments that arise due to ...

Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and cell-cell interactions in the CNS in real-time. Previously, studying these cell-specific responses after injury often required complicated setups or the transfer of cells or animals into different, non-physiological environments, confounding immediate and short-term analysis. For example, drug-mediated ablation approaches often lack the specificity that is required to study single-cell responses and immediate cell-cell interactions. Similarly, while high-power pulsed laser ablation approaches provide very good control and tissue penetration, they require specialized equipment that can complicate real-time visualization of cellular responses. The refined UV laser ablation approach described here allows researchers to stress or kill an individual cell in a dose- and time-dependent manner using a conventional confocal microscope equipped with a 405-nm laser. The method was applied to selectively ablate a single neuron within a dense network of surrounding cells in the zebrafish spinal cord. This approach revealed a dose-dependent response of the ablated neurons, causing the fragmentation of cellular bodies and anterograde degeneration along the axon within minutes to hours. This method allows researchers to study the fate of an individual dying cell and, importantly, the instant response of cells-such as microglia and astrocytes-surrounding the ablation site.

Targeted manipulations to cause directed stress or death in individual cells have been relatively difficult to accomplish. Here, a single-cell-resolution ablation approach to selectively stress and kill individual cells in cell culture and living animals is described based on a standard confocal UV laser.

기존의 UV 레이저 공 초점 현미경을 사용하여 트리거 세포 스트레스와 죽음

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and ...

신경과학

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

제브라 피쉬 배아에서 산화 스트레스의 분석

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for forward genetic analysis of developmental processes due to their external fertilization, embryonic size, rapid ontogeny, and optical clarity &#8211; a constellation of traits that enable the direct observation of events ranging from gastrulation to organogenesis with a basic stereomicroscope. Further, zebrafish embryos can survive for several days in the haploid state. The production of haploid embryos in vitro is a powerful tool for mutational analysis, as it enables the identification of recessive mutant alleles present in first generation (F1) female carriers following mutagenesis in the parental (P) generation. This approach eliminates the necessity to raise multiple generations (F2, F3, etc.) which involves breeding of mutant families, thus saving the researcher time along with reducing the needs for zebrafish colony space, labor, and the husbandry costs. Although zebrafish have been used to conduct forward screens for the past several decades, there has been a steady expansion of transgenic and genome editing tools. These tools now offer a plethora of ways to create nuanced assays for next generation screens that can be used to further dissect the gene regulatory networks that drive vertebrate ontogeny. Here, we describe how to prepare haploid zebrafish embryos. This protocol can be implemented for novel future haploid screens, such as in enhancer and suppressor screens, to address the mechanisms of development for a broad number of processes and tissues that form during early embryonic stages.

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

반수체 제브라 피쉬 배아의 생산에 의해<em&gt; 체외</em&gt; 시비

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

Efficient PAM-Less Base Editing for Zebrafish Modeling of Human Genetic Disease with zSpRY-ABE8e

CRISPR/Cas9 technology has increased the value of zebrafish for modeling human genetic diseases, studying disease pathogenesis, and drug screening, but protospacer adjacent motif (PAM) limitations are a major obstacle to creating accurate animal models of human genetic disorders caused by single-nucleotide variants (SNVs). Until now, some SpCas9 variants with broad PAM compatibility have shown efficiency in zebrafish. The application of the optimized SpRY-mediated adenine base editor (ABE), zSpRY-ABE8e, and synthetically modified gRNA in zebrafish has enabled efficient adenine-guanine base conversion without PAM restriction. Described here is a protocol for efficient adenine base editing without PAM limitation in zebrafish using zSpRY-ABE8e. By injecting a mixture of zSpRY-ABE8e mRNA and synthetically modified gRNA into zebrafish embryos, a zebrafish disease model was constructed with a precise mutation that simulated a pathogenic site of the TSR2 ribosome maturation factor (tsr2). This method provides a valuable tool for the establishment of accurate disease models for studying disease mechanisms and treatments.

This protocol describes how to perform efficient adenine base editing without PAM limitation to construct a precise zebrafish disease model using zSpRY-ABE8e.

zSpRY-ABE8e를 사용한 인간 유전 질환의 Zebrafish 모델링을 위한 효율적인 PAM 없는 염기 편집

CRISPR/Cas9 technology has increased the value of zebrafish for modeling human genetic diseases, studying disease pathogenesis, and drug screening, but ...