이 연구는 국가 연구, 개발 및 혁신 사무실의 헝가리 (그랜트는 ÁH를 116912), 비용 사무실에 의해 지원 되었다 (음식과 농업 비용 액션 FA1205: AQUAGAMETE), Stipendium Hungaricum 장학금 프로그램 (ZM 부여)와 새 헝가리 국가 우수 Predoctoral 친교 (EK 부여).

여기에 설명 된 모든 메서드는 헝가리 동물 복지 법률에 의해 승인 되었습니다.
1. 시 약 준비
<ol><li>재고 솔루션<ol>
<li>그것은 완전히 해소 될 때까지 잘 dH2오 믹스의 1 mL에 트 레 할 로스가 수화물의 0.378 g를 추가 하 여 1 M 트 레 할 로스를 준비 합니다.</li>
		<li>그것은 완전히 해소 될 때까지 잘 dH2오 믹스의 1 mL에 자당의 0.342 g를 추가 하 여 1 M 자당을 준비 합니다.</li>
		<li>그것은 완전히 해소 될 때까지 잘 HEPES의 0.238 g dH2오 믹스의 1 mL에 추가 하 여 1 M HEPES를 준비 합니다.</li>
		<li>PBS의 5 mL을 100 mg을 추가 하 여 20 mg/mL 콜라 (290 U/mg)를 준비 합니다. 그것은 디졸브 때까지 철저 하 게 혼합. 0.2 µ m 필터를 통해 살 균 필터입니다. 0.2 mL PCR에 aliquot 50 µ L 튜브와-20 ° c.에 동결</li>
		<li>15 mg/mL의 트립 신 준비 (~ 10000 U/mg) 5 ml PBS의 75 밀리 그램을 추가 하 여. 그것은 디졸브 때까지 철저 하 게 혼합. 0.2 µ m 필터를 통해 살 균 필터입니다. 0.2 mL PCR에 aliquot 50 µ L 튜브와-20 ° c.에 동결</li>
		<li>1 mg/mL DNase 준비 나 (~ 3000 U/mg) PBS의 5 mL에 5 mg을 추가 하 여. 그것은 디졸브 때까지 철저 하 게 혼합. 0.2 µ m 필터를 통해 살 균 필터입니다. 0.2 mL PCR에 aliquot 50 µ L 튜브와-20 ° c.에 동결</li>
		<li>PBS의 10 mL을 trypan 파랑의 40 mg을 추가 하 여 0.4 %trypan 블루를 준비 합니다. 0.2 µ m 필터를 통해 살 균 필터입니다. 1.5 mL 튜브에 aliquot 1 mL입니다.</li>
		<li>200 mg/L MS 준비-222 (Tricaine 메탄 된) 그것은 완전히 해소 될 때까지 잘 dH2오 믹스의 1 L에 MS-222의 200 밀리 그램을 추가 하 여. 또한, MS-222 솔루션 7.0의 중립 pH에 탄산을 버퍼링 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vitrification 위한 솔루션<ol>
<li>재래식 솔루션 (ES) 준비: 메탄올 (MeOH; 1.5 M)의 121.5 µ L를 혼합 하 여 ES의 2 개 mL를 준비 프로필 렌 글리콜 (PG; 1.5 M)의 220 µ L FBS (10%), 트 레 할 로스 재고 솔루션 (0.1 m M), HEPES 재고 솔루션 (25mm) 50 µ L 2로 L-15의 1208.5 µ L의 200 µ L의 200 µ L mL 튜브입니다.</li>
		<li>Vitrification 솔루션 (VS)를 준비: PG (M 3), 디 메 틸 sulfoxide의 426 µ L의 439 µ L를 혼합 하 여 대의 2 개 mL를 준비 (나2그래서; 3 M), 200 µ L FBS (10%), 트 레 할 로스 재고 솔루션 (0.1 m M), HEPES의 50 µ L의 200 µ L의 재고 솔루션 (25 밀리미터) 및에 L-15의 685 µ L를 2 mL 튜브입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>온난화에 대 한 솔루션<ol>
<li>지구 온난화 솔루션 1 (WS1) 준비: FBS (10%), 자당 재고 솔루션 (3 M)의 450 µ L의 150 µ L를 혼합 하 여 2 mL 튜브에 WS1의 1.5 mL를 준비 및 L-15의 900 µ L.</li>
		<li>지구 온난화 솔루션 2 (WS2) 준비: FBS (10%), 자당 재고 솔루션 (1 M)의 150 µ L의 150 µ L를 혼합 하 여 2 mL 튜브에서 1.5 mL WS2의 준비 및 L-15의 1200 µ L.</li>
		<li>지구 온난화 솔루션 3 (WS3) 준비: WS2 2 mL 튜브에서 1.5 mL 혼합 150 µ L FBS (10%)에 의해 준비 및 L-15의 1350 µ L.</li>
	</ol>
</li>
	<li>소화 솔루션 준비: 각 샘플 콜라 재고 솔루션 (2 mg/mL)의 50 µ L, trypsin 재고 솔루션 (1.5 mg/mL)의 50 µ L를 혼합 하 여 소화 솔루션의 500 µ L를 준비, 대 한 DNase의 10 µ L I (20 µ g/mL) 및 2 ml에서 L-15의 390 µ L 튜브.</li>
	<li>해 부 도구 얻기:가 위, microscissors, 핀셋, 곡선된 핀셋, 그리고 침술 바늘.</li>
</ol>2. 고환 컬렉션
<ol><li>200 mg/L와 MS를 포함 하는 접시에 그것을 배치 하 여 물고기를 안락사-222 (pH = 7). 해 부와 함께 계속 하기 전에 아가미 이동 중지 하 고 저 산소 증에 의해 죽음을 보장 하기 위해 그 순간부터 그 이상 10 분 통과 있는지 확인 합니다.</li>
	<li>종이 타월에 아 티 하 여 물고기를 말리 고 해 매트에 등 쪽의 측면에 배치.<ol>
<li>첫째로 쉽게 해 부에 대 한 골반과 가슴 지 느 러 미를 잘라.</li>
		<li>수평으로 가슴 지 느 러 미 사이의 물고기의 뱃속에는 피부를 싹 둑 하 고 항문 지 느 러 미까지 피부와 뱃속을 따라 기본 근육을 잘라.</li>
		<li>물고기의 몸에 구멍을 열고 바늘으로 해 부 매트에 왼쪽 및 오른쪽 몸 벽을 고정 합니다. 참고: Testes 수영 방광 (그림 1)의 양쪽에 위장 기관 위에 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>오염을 방지 하기 위해, 할 하지 꺼내 위장 기관, 하지만 부드럽게 한쪽에 밀어와 반대 측에서는 고환 제거. Testes 체 벽에 연결 된 그래서 신중 하 게 그들을 제거 하 고 microscissors에 의해 연결 복을 잘라.</li>
	<li>또한, 오염 방지 하기 위하여 첫째로 소독 testes 2 s, 그리고 다음 장소에 대 한 70% 에탄올에 넣어 얼음에 96 잘 접시에 L-15에 그들. 참고: 필요한 경우 지방 조직에서 크고 깨끗 한 testes 혈액 혈관을 정확 하 게는 stereomicroscope에서</li>
</ol>3. 고환 조직 울트라-빠른 냉각
<ol><li>마크 바늘 샘플에 따라 적절 한 레이블 입력 하 고 평형 (ES)와 vitrification 솔루션 (VS) 준비.</li>
	<li>살 균 침술 바늘에 잘 더 큰 접시 또는 접시와 핀 2 ~ 3 testes (이상의 바늘의 크기에 따라) testes를 전송.<ol>
<li>첫째 곡선된 핀셋 위에 고환 위치. 고환 가운데 바늘의 포인트를 놓고 조심 스럽게는 핀셋으로는 고환 위쪽으로 당겨.</li>
		<li>고환, puncturing 후 부드럽게 당겨 위쪽으로 바늘의 위쪽. Testes 서로에서 분리 되어 그리고 그들은 하지 떨어지고는 또는 아래로 슬라이딩 다는 것을 확인 하십시오.</li>
		<li>장소 2 mL 튜브에 고정 된 고환과 바늘 가득 L-15 vitrification까지 (25 ˚C;에서 저장 시간 초과 하지 않아야 합니다 1 시간). 주: 바늘에 고환을 고정 빨리 밖으로 건조에서 testes을 방지 하기 위해 수행 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>재래식 솔루션으로 고환과 바늘을 전송 하 고 25˚C에서 5 분 동안 품 어.</li>
	<li>Vitrification 솔루션으로 바늘을 전송 하 고 30 품 어 25˚C에서 s.</li>
	<li>Vitrification 솔루션에서 바늘을 제거, 신속 하 고 부드럽게 살 균 종이 타월에 의해 조직에서 나머지 솔루션을 흡수. 주의 사용 하 여 종이 타월에 집착 하거나 떨어지 testes를 피하기 위해.</li>
	<li>신속 하 게 스티로폼 상자에 배치 하는 액체 질소에 바늘을 놓습니다. 참고: 조직의 액체 질소 증기에 노출에 신속 하 게이 단계를 수행 액체 질소의 낮은 볼륨을 사용 하 여 샘플의 교차 오염을 방지 하기 위해.</li>
	<li>5-10 분에 대 한 닫힌된 스티로폼 상자에 액체 질소에 바늘을 두십시오.</li>
	<li>쿨 열된 4.5 mL cryotube와 같은 상자에서 그것의 모자.</li>
	<li>5-10 분 후 액체 질소의 표면 아래에 별도 cryotube에 각 바늘을 전송 하 고는 cryotube를 닫습니다. 주의: 항상 때 보호복 (절연된 장갑) 등을 사용 노출 심한 동상으로 이어질 수 있습니다 액체 질소와 협력.</li>
	<li>Cryotube 금속 지팡이에 놓고 최대한 빨리 cryobank 용기에 배치. 샘플 용기 저장에서 저장 dewar 추가 사용까지.</li>
</ol>4. 지구 온난화 절차
<ol><li>별도로 각 바늘을 따뜻한. 25 ° c.에 모든 지구 온난화 솔루션 이어야 한다</li>
	<li>금속 지팡이에서 cryotube를 분리 하 고 스티로폼 상자에 저장 된 액체 질소로 급락.</li>
	<li>액체 질소 증기 (집게를 사용 하 여)에 cryotube을 열고 액체 질소에 바늘을 해제 합니다.</li>
	<li>첫 번째 지구 온난화 솔루션으로 매우 빠르게 바늘을 전송 하 고 (25 ° C)에서 1 분 동안 품 어. 신속 하 게 전송 하는 동안 공기에 그것의 온난화 방지 하기 위해 바늘을 전송 해야 합니다.</li>
	<li>두 번째 지구 온난화 솔루션으로 바늘을 전송 하 고 (25 ° C)에서 3 분 동안 품 어.</li>
	<li>3 지구 온난화 솔루션으로 바늘을 전송 하 고 (25 ° C)에서 5 분 동안 품 어.</li>
	<li>곡선된 핀셋으로 그들을 아래쪽으로 밀어 바늘에서 testes를 놓습니다. 별도 우물 (96 잘 접시)에 개별적으로 각 따뜻하게 고환 L-15 10% 보충의 250 µ L로 가득 장소 FBS. 우물 샘플에 따르면 개는 다는 것을 확인 하십시오. 모든 샘플은 따뜻하게 될 때까지 얼음에 잘 접시까지 추가 작업을 계속.</li>
</ol>5. 조직 소화
<ol><li>각 샘플에 별도 2 mL 튜브 분리 솔루션의 500 µ L를 준비 합니다. 이 샘플의 코드에 따라 튜브 라벨. 실 온에서 5 분 동안 준비 된 분리 솔루션을 품 어.</li>
	<li>따뜻하게 조직 소화 솔루션에 추가 하 고 작은 위 적어도 30 움직임에 의해 그것을 작은 조각으로 잘라.</li>
	<li>25 ˚C에서 90 분 떨고 접시에 잘라 조직 품 어.</li>
	<li>FBS의 L-15 및 100 µ L의 400 µ L을 추가 하 여 소화 프로세스를 중지 (10% FBS v/v). 짧게 솔루션을 동요 하 고 실 온에서 1 분 동안 품 어.</li>
	<li>1.5 mL 튜브에 50 µ m 필터를 통해 얻은 솔루션을 필터링 합니다. 튜브를 따라 레이블을 지정 합니다.</li>
	<li>25 ˚C에서 10 분 동안 200 × g에서 필터링된 솔루션 원심</li>
	<li>조심 스럽게 제거는 상쾌한 고 L15 10% 보충의 20 µ L에서 펠 릿 resuspend FBS. 펠 릿은 완전히 용 해 될 때까지 수동으로 튜브를 흔들. 추가 사용까지 얼음에 또는 4 ˚C에서 셀 정지를 유지.</li>
</ol>6. 생존 능력 평가 셀 계산
<ol><li>세포 현 탁 액 및 레이블이 표시 된 0.2 mL PCR 튜브에 0.4 %trypan 블루 솔루션의 5 µ L의 혼합 5 µ L. 다른 볼륨을 사용 하는 경우 1:1 남아의 희석 비율.</li>
	<li>실 온 (25 ° C)에서 1 ~ 3 분이 서 스 펜이 션을 품 어.</li>
	<li>현미경 hemocytometer에 각 샘플의 생존 능력을 확인 합니다.</li>
	<li>라이브 셀 (trypan 블루 흠 없는) 15 필드 수를 계산 합니다. 세포 현 탁 액의 20 µ m에 있는 셀의 총 수를 계산 합니다. 현 탁 액은 지금 모든 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 준비. 참고: 큰 신체 크기와 다른 종족에 대 한 절차를 최적화 하는 때 동등한 무게의 고환 조각을 사용 합니다. 모든 실험적인 그룹에 대 한 한 개인에서 testes를 사용 하 여 결과에 개별 가변성을 피하기 위하여. Zebrafish, 경우 우리 이용 했다는 사실에 왼쪽 및 오른쪽 고환 생식 세포13 의 동일한 (또는 매우 유사한) 번호를 포함 해야 합니다 (대표 결과 참조). 왼쪽된 고환은 오른쪽 고환 vitrified/예 열 동안 제어로 유지 되었다. 생존 비율 계산 했다 신선한 고환에서 격리 하는 셀의 수에 비해 vitrified 따뜻하게 고환에서 격리 하는 셀의 수.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mazur, P., Leibo, S. P., Seidel, G. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+the+germplasm+of+animals+used+in+biological+and+medical+research:+Importance,+impact,+status,+and+future+directions.">Cryopreservation of the germplasm of animals used in biological and medical research: Importance, impact, status, and future directions.</a> Biol. Reprod. 78 (1), 2-12 (2008).</li><li>Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+and+In+Vitro+Fertilization+at+the+Zebrafish+International+Resource+Center.">Cryopreservation and In Vitro Fertilization at the Zebrafish International Resource Center.</a> Methods Mol. Biol. 546, 45-65 (2009).</li><li>Yang, H., Carmichael, C., Varga, Z. M., Tiersch, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+simplified+and+standardized+protocol+with+potential+for+high-throughput+for+sperm+cryopreservation+in+zebrafish+Danio+rerio.">Development of a simplified and standardized protocol with potential for high-throughput for sperm cryopreservation in zebrafish Danio rerio.</a> Theriogenology. 68 (2), 128-136 (2007).</li><li>Morris, J. P., Berghmans, S., Zahrieh, D., Neuberg, D. S., Kanki, J. P., Look, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+sperm+cryopreservation+with+N,N-dimethylacetamide.">Zebrafish sperm cryopreservation with N,N-dimethylacetamide.</a> Biotechniques. 35 (5), 956-968 (2003).</li><li>Yoshizaki, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogonial+transplantation+in+fish:+A+novel+method+for+the+preservation+of+genetic+resources.">Spermatogonial transplantation in fish: A novel method for the preservation of genetic resources.</a> Comp. Biochem. Physiol. Part D: Genomics Proteomics. 6 (1), 55-61 (2011).</li><li>Gao, D., Critser, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cryoinjury+in+living+cells.">Mechanisms of cryoinjury in living cells.</a> ILAR J. 41 (4), 187-196 (2000).</li><li>Asturiano, J. F., Cabrita, E., Horv&#225;th, &. #. 1. 9. 3. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress,+challenges+and+perspectives+on+fish+gamete+cryopreservation:+A+mini-review.">Progress, challenges and perspectives on fish gamete cryopreservation: A mini-review.</a> Gen. Comp. Endocrinol. 245, 69-76 (2017).</li><li>K&#225;sa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+sperm+vitrification+protocols+for+freshwater+fish+(Eurasian+perch,+Perca+fluviatilis)+and+marine+fish+(European+eel,+Anguilla+anguilla).">Development of sperm vitrification protocols for freshwater fish (Eurasian perch, Perca fluviatilis) and marine fish (European eel, Anguilla anguilla).</a> Gen. Comp. Endocrinol. 245, 102-107 (2017).</li><li>Cuevas-Uribe, R., Leibo, S. P., Daly, J., Tiersch, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+channel+catfish+with+sperm+cryopreserved+by+rapid+non-equilibrium+cooling.">Production of channel catfish with sperm cryopreserved by rapid non-equilibrium cooling.</a> Cryobiology. 63 (3), 186-197 (2011).</li><li>Wang, Y., Xiao, Z., Li, L., Fan, W., Li, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+needle+immersed+vitrification:+A+practical+and+convenient+method+with+potential+advantages+in+mouse+and+human+ovarian+tissue+cryopreservation.">Novel needle immersed vitrification: A practical and convenient method with potential advantages in mouse and human ovarian tissue cryopreservation.</a> Hum. Reprod. 23 (10), 2256-2265 (2008).</li><li>Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Live+Offspring+from+Testicular+Tissue+Cryopreserved+by+Vitrification+Procedures+in+Japanese+Quail+(Coturnix+japonica).">Production of Live Offspring from Testicular Tissue Cryopreserved by Vitrification Procedures in Japanese Quail (Coturnix japonica).</a> Biol. Reprod. 88 (5), 124 (2013).</li><li>Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+needle-in-straw+vitrification+can+effectively+preserve+the+follicle+morphology,+viability,+and+vascularization+of+ovarian+tissue+in+Japanese+quail+(Coturnix+japonica).">Novel needle-in-straw vitrification can effectively preserve the follicle morphology, viability, and vascularization of ovarian tissue in Japanese quail (Coturnix japonica).</a> Anim. Reprod. Sci. 134 (3-4), 197-202 (2012).</li><li>Lee, S., Yoshizaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+cryopreservation+of+spermatogonia+in+critically+endangered+Manchurian+trout+(Brachymystax+lenok).">Successful cryopreservation of spermatogonia in critically endangered Manchurian trout (Brachymystax lenok).</a> Cryobiology. 72 (2), 165-168 (2016).</li><li>Marques, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viability+of+zebrafish+(Danio+rerio)+ovarian+follicles+after+vitrification+in+a+metal+container.">Viability of zebrafish (Danio rerio) ovarian follicles after vitrification in a metal container.</a> Cryobiology. 71 (3), 367-373 (2015).</li><li>Luji&#263;, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+successful+vitrification+of+salmonid+ovarian+tissue.">First successful vitrification of salmonid ovarian tissue.</a> Cryobiology. 76, 154-157 (2017).</li><li>Bono-Mestre, C., Cardona-Costa, J., Garc&#237;a-Xim&#233;nez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+on+cell+viability+of+three+zebrafish+testicular+cell+or+tissue+cryopreservation+methods.">Effects on cell viability of three zebrafish testicular cell or tissue cryopreservation methods.</a> CryoLetters. 30 (2), 148-152 (2009).</li><li>Marinovi&#263;, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryosurvival+of+isolated+testicular+cells+and+testicular+tissue+of+tench+Tinca+tinca+and+goldfish+Carassius+auratus+following+slow-rate+freezing.">Cryosurvival of isolated testicular cells and testicular tissue of tench Tinca tinca and goldfish Carassius auratus following slow-rate freezing.</a> Gen. Comp. Endocrinol. 245, 77-83 (2017).</li><li>P&#353;eni&#269;ka, M., Saito, T., Rodina, M., Dzyuba, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+early+stage+Siberian+sturgeon+Acipenser+baerii+germ+cells,+comparison+of+whole+tissue+and+dissociated+cells.">Cryopreservation of early stage Siberian sturgeon Acipenser baerii germ cells, comparison of whole tissue and dissociated cells.</a> Cryobiology. 72, 119-122 (2016).</li><li>Lee, S., Iwasaki, Y., Shikina, S., Yoshizaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+eggs+and+sperm+from+cryopreserved+whole+testes.">Generation of functional eggs and sperm from cryopreserved whole testes.</a> Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 110 (5), 1640-1645 (2013).</li></ol>

저자는 공개 없다.

이 연구의 주요 목적은 바늘에 맞게 몰입 울트라-빠른 냉각 절차 조류 및 포유류 종10,11,12 물고기 고환 (zebrafish 모델의 cryopreservation를 개발 했다 유기 체)입니다. Zebrafish 유전 자원의 cryopreservation에 관한 이전 연구의 대부분 zebrafish 정자2,,34의 cryopreservation에...

생명 공학 및 과학 소설 동향은 쥐, 초파리, zebrafish의 모형 유기 체 생물 의학에 및 다른 과학1로 사용 하는 다른 종의 새로운 돌연변이 라인의 수천의 창조에 이르렀다. 또한, 새로운 기술을 개발 하 고 사용할 수 있게 되는, 돌연변이 라인의 숫자는 꾸준히2증가. 식민지를 번 식 유지의 일반적인 관행을 넘어 유전 자원의 안전한 저장에 대 한 필요성을이 끈다. 시간이 무기한 기간에 대 한 유전 자원의 안전한 저장을 수 있는 방법으로 cryopreservation 장점이 많은 생식 시즌의 확장 circumvents broodstock, 지속적인 유지 관리를 위해 필요 하 고 그것은 더 많은 비용-와 같은 고 효율적인 노동2.
정자 cryopreservation는 지난 몇 년 동안2,3,4 중 개발에 대 한 프로토콜 zebrafish 남성 유전 물질의 성공적인 저장소에 대 한 기회를 제공 합니다. 그러나, 계란이 나 생선에는 태아의 cryopreservation 불가능 아직 그들의 복잡 한 구조와 노 른 자 물자의 다량. 최근, 원시 생식 세포 (PGCs) 또는 spermatogonial 줄기 세포 (SSCs) 이식의 연습 이식5후 정자와 난 기능으로 개발 하 여이 방 벽을 우회를 제공 합니다. 따라서, SSCs의 cryopreservation 희귀 하 고 귀중 한 유전자 자원의 보존에 새로운 프론티어를 제공합니다.
Cryopreservation 많은 장점을 제공, 비록 느린 속도 동결 과정 세포 손상2로 이어질 수 있는 몇 가지 조건을 생성 합니다. 이러한 세포와 extracellular 얼음 대형, 탈수, cryoprotectant 독성 등이 포함 됩니다. 세포내 얼음 손상 세포, extracellular 얼음 셀의 기계적 분쇄 동안 느린 속도 동결 세포에서 물 보급 탈수6으로 이어질 수 있습니다 하는 동안 발생할 수 있습니다. 최근, 얼음 대형의 부정적인 효과 방지 하는 기술로 vitrification 물고기 gametes7,,89의 cryopreservation에 적용 되었습니다. 통해 내부 및 외부 미디어 얼음7,10에 crystalizing 없이 비정 질/유리 상태로 설정 하는 매우 빠른 냉각 기법을 제공 합니다. 고환 및 난소 조직의 성공적인 vitrification 조류 및 포유류 종10,,1112, 따라서 물고기, 뿐만에서 자사의 응용 프로그램에 대 한 가능성을 열어 입증 되었습니다.
이 연구에서 우리 전체 zebrafish testes의 cryopreservation 바늘 몰입 vitrification (NIV) 절차를 제시. 오염 및 다른 세포, 특히 정 충의 낮은 존재와 상대적으로 높은 양의 초기 생식 세포 생성 cryopreservation 과정 없이 zebrafish 초기 세균 세포 절연에 대 한 신뢰할 수 있는 방법을 설명 합니다. 우리의 지식 최선을이 물고기 gonadal 조직과 zebrafish 생식 세포의 초 급속 한 냉각에 대 한 상세한 시각화 된 프로토콜을 설명 하는 첫 번째 연구 이다. 또한, 방법의 반복성 5 다른 zebrafish 긴장에서 설명 된다: AB 야생 타입, 캐스퍼 (로-/-; nacre-/-), 레오 파 드 (레오t1/t1), 바사 [Tg (vas::eGFP)]와 Wilms 종양 [Tg (wt1b::eGFP 1)] 유전자 변형 라인.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="948">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:232px;">Leibovitz media (L-15)</td>
			<td style="width:220px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:200px;">L1518</td>
			<td style="width:296px;">Supplemented with L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:232px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:220px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:200px;">F9665</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Tricaine methanesulfonate (MS-222)</td>
			<td style="width:220px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:232px;">HEPES</td>
			<td style="width:220px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:200px;">H3375</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:232px;">Sucrose</td>
			<td style="width:220px;">Acros Organics</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Trehalose</td>
			<td style="width:220px;">Acros Organics</td>
			<td>99-20-7</td>
			<td style="width:296px;">Dihydrate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Methanol</td>
			<td style="width:220px;">Reanal</td>
			<td style="width:200px;">20740-0-08-65</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Propylene glycol</td>
			<td style="width:220px;">Reanal</td>
			<td style="width:200px;">08860-1-08-65</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:220px;">Reanal</td>
			<td style="width:200px;">00190-1-01-65</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Collagenase</td>
			<td style="width:220px;">Gibco</td>
			<td style="width:200px;">9001-12-1</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Trypsin</td>
			<td style="width:220px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:200px;">T8003</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:232px;">DNase I</td>
			<td style="width:220px;">Panreac AppliChem</td>
			<td style="width:200px;">A3778</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:220px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:200px;">T6146</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Phospate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:220px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td>Tablets for preparation of 200 ml PBS solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cryopreservation of zebrafish spermatogonia by whole testes needle immersed ultra-rapid cooling

생명 공학 및 과학의 현재 동향 breeding 식민지 유지의 일반적인 관행을 넘어 유전 자원의 안전한 저장을 위한 새로운 방법에 대 한 필요성에 따라서 선도 모델 생물에서 새로운 라인의 수천의 창조 될. 이 연구의 주요 목적은 바늘에 맞게 vitrification (NIV) 절차 전체 zebrafish testes cryopreserve에 몰입 했다. 전체 testes에 의해 초기 단계 세균 세포의 cryopreservation 이니라 제공 합니다 zebrafish의 스토리지에 대 한 가능성 유전 자원, 특히 이후 이식 후 그들은 둘 다 남성과 여성 gametes로 성숙 수 있습니다. 침술 바늘, 두 cryoprotective 미디어 (평형 솔루션 1.5 M 메탄올 및 1.5 M 프로필 렌 글리콜; 및 vitrification 솔루션 3 M 디 메 틸 sulfoxide 및 3 M 프로필 렌 글리콜을 포함)에 equilibrated에 testes excised 했다 그리고 액체 질소에 뛰어들었다. 샘플 3 결과 지구 온난화 솔루션의 시리즈에는 예 열 했다. 이 기술의 주요 장점은 다운스트림 조작; 촉진 따뜻하게 testes의 소화 후 (1) 정 충의 부족은 (2) 매우 빠른 따라서 냉각 및 cryoprotectants; 그들의 독성을 줄일 필요 농도 감소를 극대화 하는 액체 질소에 조직의 최적의 노출 사용 냉각 (3) 동기 여러 testes의, 노출에 cryoprotectants 액체 질소; 그리고 (4) 반복성의 5 개의 다른 zebrafish 긴장에서 50% 이상의 생존 여 시연.

평균적으로, 초기 단계 세균 세포는 하나의 신선한 zebrafish 고환에서 격리 수 물고기의 크기에 따라 40, 000와 200000 셀 사이의 다양 합니다. 모든 5 종자에 신선한 zebrafish testes 소화 때 초기 생식 세포만 셀 셀 정지 (그림 2)에 아니었다. 초기 단계 세균 세포 옆에 수많은 정 충도 발견 됐다. 다른 한편으로, cryopreserved testes의 소화 후 훨씬 적은 정 충 했다. ...

Watch this Scientific Journal Video about Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling at JoVE.com

Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling

Zebrafish Spermatogonia 전체 Testes 바늘의 cryopreservation 몰입 울트라-빠른 냉각

이 연구의 주요 목적은 바늘에 맞게 vitrification (NIV) 절차 전체 zebrafish testes cryopreserve에 몰입 했다. 또한, 5 개의 다른 zebrafish 긴장에서 방법의 반복성 시험 되었다.

Current trends in science and biotechnology lead to creation of thousands of new lines in model organisms thereby leading to the necessity for new methods ...

cryopreservation-zebrafish-spermatogonia-whole-testes-needle-immersed

Research

JoVE Journal

Biology

8.2K 조회수.  Szent István University. 이 연구의 주요 목적은 바늘에 맞게 vitrification (NIV) 절차 전체 zebrafish testes cryopreserve에 몰입 했다. 또한, 5 개의 다른 zebrafish 긴장에서 방법의 반복성 시험 되었다.

비디오: Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

성인 Zebrafish의 전체 신장 마로우의 이식

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

연구

생물학

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebrafish 전체 마운트 고해상도 더블 형광등 현장에서 하이브 리다이 제이션

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

이식에 의해 키메라 Zebrafish의 배아를 생성

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

높은 처리량 Zebrafish의 정자 Cryopreservation에 대한 방법과 체외에서 수정

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

Making Gynogenetic Diploid Zebrafish by Early Pressure

Heterozygosity in diploid eukaryotes often makes genetic studies cumbersome. Methods that produce viable homozygous diploid offspring directly from heterozygous females allow F1 mutagenized females to be screened directly for deleterious mutations in an accelerated forward genetic screen. Streisinger et al.1,2 described methods for making gynogenetic (homozygous) diploid zebrafish by activating zebrafish eggs with ultraviolet light-inactivated sperm and preventing either the second meiotic or the first zygotic cell division using physical treatments (heat or pressure) that deploymerize microtubules. The "early pressure" (EP) method blocks the meiosis II, which occurs shortly after fertilization. The EP method produces a high percentage of viable embryos that can develop to fertile adults of either sex. The method generates embryos that are homozygous at all loci except those that were separated from their centromere by recombination during meiosis I. Homozygous mutations are detected in EP clutches at between 50% for centromeric loci and less than 1% for telomeric loci. This method is reproduced verbatim from the Zebrafish Book3.

This is a method for generating gynogenetic diploid zebrafish embryos (embryos whose only genetic contribution comes from the mother) by blocking the second meiotic division immediately after fertilization with ultraviolet light-inactivated sperm. EP embryos are not fully homozygous due to recombination during the first meiotic division, however they are homozygous at all loci that have not been separated from their centromere by recombination.

초기 압력에 의해 Gynogenetic의 Diploid의 Zebrafish 만들기

Heterozygosity in diploid eukaryotes often makes genetic studies cumbersome. Methods that produce viable homozygous diploid offspring directly from ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

의 분리 Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic modifications and the number is consistently increasing year by year. Its technical development started with slow freezing methods in the 1970s1, then followed by vitrification methods developed in the late 1980s2. Generally, the latter technique is advantageous in its quickness, simplicity, and high survivability of recovered embryos. However, the cryoprotectants contained are highly toxic and may affect subsequent embryo development. Therefore, the technique was not applicable to certain strains of mice, even when the solutions are cooled to 4&deg;C to mitigate the toxic effect during embryo handling. At the RIKEN BioResource Center, more than 5000 mouse strains with different genetic backgrounds and phenotypes are maintained3, and therefore we have optimized a vitrification technique with which we can cryopreserve embryos from many different strains of mice, with the benefits of high embryo survival after vitrifying and thawing (or liquefying, more precisely) at the ambient temperature4.
Here, we present a vitrification method for mouse embryos that has been successfully used at our center. The cryopreservation solution contains ethylene glycol instead of DMSO to minimize the toxicity to embryos5. It also contains Ficoll and sucrose for prevention of devitrification and osmotic adjustment, respectively. Embryos can be handled at room temperature and transferred into liquid nitrogen within 5 min. Because the original method was optimized for plastic straws as containers, we have slightly modified the protocol for cryotubes, which are more easily accessible in laboratories and more resistant to physical damages. We also describe the procedure of thawing vitrified embryos in detail because it is a critical step for efficient recovery of live mice. These methodologies would be helpful to researchers and technicians who need preservation of mouse strains for later use in a safe and cost-effective manner.

An ethylene glycol-based vitrification method for mouse embryos is described. It is advantageous to other methods in its simplicity and low embryonic toxicity, and therefore can be broadly applicable to many strains of mice, including inbred and gene-modified mice.

에틸렌 글리콜 기반 Vitrification에 의한 마우스 태아의 Cryopreservation

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

Macromolecular의 결정학에 의해 구조 결정에 대한 Lipidic Mesophases에서 재배 막 단백질의 수확 및 Cryo 냉각 크리스털

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Imaging Centrosomes in Fly Testes

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell differentiation. Centrosomes are essential to determine the cell division axis during mitosis and to nucleate cilia during interphase. The identity of the proteins that mediate these dynamic changes remains only partially known, and the function of many of the proteins that have been implicated in these processes is still rudimentary. Recent work has shown that Drosophila spermatogenesis provides a powerful system to identify new proteins critical for centrosome function and formation as well as to gain insight into the particular function of known players in centrosome-related processes. Drosophila is an established genetic model organism where mutants in centrosomal genes can be readily obtained and easily analyzed. Furthermore, recent advances in the sensitivity and resolution of light microscopy and the development of robust genetically tagged centrosomal markers have transformed the ability to use Drosophila testes as a simple and accessible model system to study centrosomes. This paper describes the use of genetically-tagged centrosomal markers to perform genetic screens for new centrosomal mutants and to gain insight into the specific function of newly identified genes.

Imaging of centrosomal proteins during Drosophila spermatogenesis is a powerful method to identify new proteins critical for centrosome biology as well as to elucidate the particular function of known players in this process.

비행 고환에있는 영상 중심체

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...