Name: cryopreservation of zebrafish spermatogonia by whole testes needle immersed ultra-rapid cooling
Uploaded: 2018-03-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling at JoVE.com

이 연구는 국가 연구, 개발 및 혁신 사무실의 헝가리 (그랜트는 ÁH를 116912), 비용 사무실에 의해 지원 되었다 (음식과 농업 비용 액션 FA1205: AQUAGAMETE), Stipendium Hungaricum 장학금 프로그램 (ZM 부여)와 새 헝가리 국가 우수 Predoctoral 친교 (EK 부여).

여기에 설명 된 모든 메서드는 헝가리 동물 복지 법률에 의해 승인 되었습니다.
1. 시 약 준비
<ol><li>재고 솔루션<ol>
<li>그것은 완전히 해소 될 때까지 잘 dH2오 믹스의 1 mL에 트 레 할 로스가 수화물의 0.378 g를 추가 하 여 1 M 트 레 할 로스를 준비 합니다.</li>
		<li>그것은 완전히 해소 될 때까지 잘 dH2오 믹스의 1 mL에 자당의 0.342 g를 추가 하 여 1 M 자당을 준비 합니다.</li>
		<li>그것은 완전히 해소 될 때까지 잘 HEPES의 0.238 g dH2오 믹스의 1 mL에 추가 하 여 1 M HEPES를 준비 합니다.</li>
		<li>PBS의 5 mL을 100 mg을 추가 하 여 20 mg/mL 콜라 (290 U/mg)를 준비 합니다. 그것은 디졸브 때까지 철저 하 게 혼합. 0.2 µ m 필터를 통해 살 균 필터입니다. 0.2 mL PCR에 aliquot 50 µ L 튜브와-20 ° c.에 동결</li>
		<li>15 mg/mL의 트립 신 준비 (~ 10000 U/mg) 5 ml PBS의 75 밀리 그램을 추가 하 여. 그것은 디졸브 때까지 철저 하 게 혼합. 0.2 µ m 필터를 통해 살 균 필터입니다. 0.2 mL PCR에 aliquot 50 µ L 튜브와-20 ° c.에 동결</li>
		<li>1 mg/mL DNase 준비 나 (~ 3000 U/mg) PBS의 5 mL에 5 mg을 추가 하 여. 그것은 디졸브 때까지 철저 하 게 혼합. 0.2 µ m 필터를 통해 살 균 필터입니다. 0.2 mL PCR에 aliquot 50 µ L 튜브와-20 ° c.에 동결</li>
		<li>PBS의 10 mL을 trypan 파랑의 40 mg을 추가 하 여 0.4 %trypan 블루를 준비 합니다. 0.2 µ m 필터를 통해 살 균 필터입니다. 1.5 mL 튜브에 aliquot 1 mL입니다.</li>
		<li>200 mg/L MS 준비-222 (Tricaine 메탄 된) 그것은 완전히 해소 될 때까지 잘 dH2오 믹스의 1 L에 MS-222의 200 밀리 그램을 추가 하 여. 또한, MS-222 솔루션 7.0의 중립 pH에 탄산을 버퍼링 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vitrification 위한 솔루션<ol>
<li>재래식 솔루션 (ES) 준비: 메탄올 (MeOH; 1.5 M)의 121.5 µ L를 혼합 하 여 ES의 2 개 mL를 준비 프로필 렌 글리콜 (PG; 1.5 M)의 220 µ L FBS (10%), 트 레 할 로스 재고 솔루션 (0.1 m M), HEPES 재고 솔루션 (25mm) 50 µ L 2로 L-15의 1208.5 µ L의 200 µ L의 200 µ L mL 튜브입니다.</li>
		<li>Vitrification 솔루션 (VS)를 준비: PG (M 3), 디 메 틸 sulfoxide의 426 µ L의 439 µ L를 혼합 하 여 대의 2 개 mL를 준비 (나2그래서; 3 M), 200 µ L FBS (10%), 트 레 할 로스 재고 솔루션 (0.1 m M), HEPES의 50 µ L의 200 µ L의 재고 솔루션 (25 밀리미터) 및에 L-15의 685 µ L를 2 mL 튜브입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>온난화에 대 한 솔루션<ol>
<li>지구 온난화 솔루션 1 (WS1) 준비: FBS (10%), 자당 재고 솔루션 (3 M)의 450 µ L의 150 µ L를 혼합 하 여 2 mL 튜브에 WS1의 1.5 mL를 준비 및 L-15의 900 µ L.</li>
		<li>지구 온난화 솔루션 2 (WS2) 준비: FBS (10%), 자당 재고 솔루션 (1 M)의 150 µ L의 150 µ L를 혼합 하 여 2 mL 튜브에서 1.5 mL WS2의 준비 및 L-15의 1200 µ L.</li>
		<li>지구 온난화 솔루션 3 (WS3) 준비: WS2 2 mL 튜브에서 1.5 mL 혼합 150 µ L FBS (10%)에 의해 준비 및 L-15의 1350 µ L.</li>
	</ol>
</li>
	<li>소화 솔루션 준비: 각 샘플 콜라 재고 솔루션 (2 mg/mL)의 50 µ L, trypsin 재고 솔루션 (1.5 mg/mL)의 50 µ L를 혼합 하 여 소화 솔루션의 500 µ L를 준비, 대 한 DNase의 10 µ L I (20 µ g/mL) 및 2 ml에서 L-15의 390 µ L 튜브.</li>
	<li>해 부 도구 얻기:가 위, microscissors, 핀셋, 곡선된 핀셋, 그리고 침술 바늘.</li>
</ol>2. 고환 컬렉션
<ol><li>200 mg/L와 MS를 포함 하는 접시에 그것을 배치 하 여 물고기를 안락사-222 (pH = 7). 해 부와 함께 계속 하기 전에 아가미 이동 중지 하 고 저 산소 증에 의해 죽음을 보장 하기 위해 그 순간부터 그 이상 10 분 통과 있는지 확인 합니다.</li>
	<li>종이 타월에 아 티 하 여 물고기를 말리 고 해 매트에 등 쪽의 측면에 배치.<ol>
<li>첫째로 쉽게 해 부에 대 한 골반과 가슴 지 느 러 미를 잘라.</li>
		<li>수평으로 가슴 지 느 러 미 사이의 물고기의 뱃속에는 피부를 싹 둑 하 고 항문 지 느 러 미까지 피부와 뱃속을 따라 기본 근육을 잘라.</li>
		<li>물고기의 몸에 구멍을 열고 바늘으로 해 부 매트에 왼쪽 및 오른쪽 몸 벽을 고정 합니다. 참고: Testes 수영 방광 (그림 1)의 양쪽에 위장 기관 위에 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>오염을 방지 하기 위해, 할 하지 꺼내 위장 기관, 하지만 부드럽게 한쪽에 밀어와 반대 측에서는 고환 제거. Testes 체 벽에 연결 된 그래서 신중 하 게 그들을 제거 하 고 microscissors에 의해 연결 복을 잘라.</li>
	<li>또한, 오염 방지 하기 위하여 첫째로 소독 testes 2 s, 그리고 다음 장소에 대 한 70% 에탄올에 넣어 얼음에 96 잘 접시에 L-15에 그들. 참고: 필요한 경우 지방 조직에서 크고 깨끗 한 testes 혈액 혈관을 정확 하 게는 stereomicroscope에서</li>
</ol>3. 고환 조직 울트라-빠른 냉각
<ol><li>마크 바늘 샘플에 따라 적절 한 레이블 입력 하 고 평형 (ES)와 vitrification 솔루션 (VS) 준비.</li>
	<li>살 균 침술 바늘에 잘 더 큰 접시 또는 접시와 핀 2 ~ 3 testes (이상의 바늘의 크기에 따라) testes를 전송.<ol>
<li>첫째 곡선된 핀셋 위에 고환 위치. 고환 가운데 바늘의 포인트를 놓고 조심 스럽게는 핀셋으로는 고환 위쪽으로 당겨.</li>
		<li>고환, puncturing 후 부드럽게 당겨 위쪽으로 바늘의 위쪽. Testes 서로에서 분리 되어 그리고 그들은 하지 떨어지고는 또는 아래로 슬라이딩 다는 것을 확인 하십시오.</li>
		<li>장소 2 mL 튜브에 고정 된 고환과 바늘 가득 L-15 vitrification까지 (25 ˚C;에서 저장 시간 초과 하지 않아야 합니다 1 시간). 주: 바늘에 고환을 고정 빨리 밖으로 건조에서 testes을 방지 하기 위해 수행 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>재래식 솔루션으로 고환과 바늘을 전송 하 고 25˚C에서 5 분 동안 품 어.</li>
	<li>Vitrification 솔루션으로 바늘을 전송 하 고 30 품 어 25˚C에서 s.</li>
	<li>Vitrification 솔루션에서 바늘을 제거, 신속 하 고 부드럽게 살 균 종이 타월에 의해 조직에서 나머지 솔루션을 흡수. 주의 사용 하 여 종이 타월에 집착 하거나 떨어지 testes를 피하기 위해.</li>
	<li>신속 하 게 스티로폼 상자에 배치 하는 액체 질소에 바늘을 놓습니다. 참고: 조직의 액체 질소 증기에 노출에 신속 하 게이 단계를 수행 액체 질소의 낮은 볼륨을 사용 하 여 샘플의 교차 오염을 방지 하기 위해.</li>
	<li>5-10 분에 대 한 닫힌된 스티로폼 상자에 액체 질소에 바늘을 두십시오.</li>
	<li>쿨 열된 4.5 mL cryotube와 같은 상자에서 그것의 모자.</li>
	<li>5-10 분 후 액체 질소의 표면 아래에 별도 cryotube에 각 바늘을 전송 하 고는 cryotube를 닫습니다. 주의: 항상 때 보호복 (절연된 장갑) 등을 사용 노출 심한 동상으로 이어질 수 있습니다 액체 질소와 협력.</li>
	<li>Cryotube 금속 지팡이에 놓고 최대한 빨리 cryobank 용기에 배치. 샘플 용기 저장에서 저장 dewar 추가 사용까지.</li>
</ol>4. 지구 온난화 절차
<ol><li>별도로 각 바늘을 따뜻한. 25 ° c.에 모든 지구 온난화 솔루션 이어야 한다</li>
	<li>금속 지팡이에서 cryotube를 분리 하 고 스티로폼 상자에 저장 된 액체 질소로 급락.</li>
	<li>액체 질소 증기 (집게를 사용 하 여)에 cryotube을 열고 액체 질소에 바늘을 해제 합니다.</li>
	<li>첫 번째 지구 온난화 솔루션으로 매우 빠르게 바늘을 전송 하 고 (25 ° C)에서 1 분 동안 품 어. 신속 하 게 전송 하는 동안 공기에 그것의 온난화 방지 하기 위해 바늘을 전송 해야 합니다.</li>
	<li>두 번째 지구 온난화 솔루션으로 바늘을 전송 하 고 (25 ° C)에서 3 분 동안 품 어.</li>
	<li>3 지구 온난화 솔루션으로 바늘을 전송 하 고 (25 ° C)에서 5 분 동안 품 어.</li>
	<li>곡선된 핀셋으로 그들을 아래쪽으로 밀어 바늘에서 testes를 놓습니다. 별도 우물 (96 잘 접시)에 개별적으로 각 따뜻하게 고환 L-15 10% 보충의 250 µ L로 가득 장소 FBS. 우물 샘플에 따르면 개는 다는 것을 확인 하십시오. 모든 샘플은 따뜻하게 될 때까지 얼음에 잘 접시까지 추가 작업을 계속.</li>
</ol>5. 조직 소화
<ol><li>각 샘플에 별도 2 mL 튜브 분리 솔루션의 500 µ L를 준비 합니다. 이 샘플의 코드에 따라 튜브 라벨. 실 온에서 5 분 동안 준비 된 분리 솔루션을 품 어.</li>
	<li>따뜻하게 조직 소화 솔루션에 추가 하 고 작은 위 적어도 30 움직임에 의해 그것을 작은 조각으로 잘라.</li>
	<li>25 ˚C에서 90 분 떨고 접시에 잘라 조직 품 어.</li>
	<li>FBS의 L-15 및 100 µ L의 400 µ L을 추가 하 여 소화 프로세스를 중지 (10% FBS v/v). 짧게 솔루션을 동요 하 고 실 온에서 1 분 동안 품 어.</li>
	<li>1.5 mL 튜브에 50 µ m 필터를 통해 얻은 솔루션을 필터링 합니다. 튜브를 따라 레이블을 지정 합니다.</li>
	<li>25 ˚C에서 10 분 동안 200 × g에서 필터링된 솔루션 원심</li>
	<li>조심 스럽게 제거는 상쾌한 고 L15 10% 보충의 20 µ L에서 펠 릿 resuspend FBS. 펠 릿은 완전히 용 해 될 때까지 수동으로 튜브를 흔들. 추가 사용까지 얼음에 또는 4 ˚C에서 셀 정지를 유지.</li>
</ol>6. 생존 능력 평가 셀 계산
<ol><li>세포 현 탁 액 및 레이블이 표시 된 0.2 mL PCR 튜브에 0.4 %trypan 블루 솔루션의 5 µ L의 혼합 5 µ L. 다른 볼륨을 사용 하는 경우 1:1 남아의 희석 비율.</li>
	<li>실 온 (25 ° C)에서 1 ~ 3 분이 서 스 펜이 션을 품 어.</li>
	<li>현미경 hemocytometer에 각 샘플의 생존 능력을 확인 합니다.</li>
	<li>라이브 셀 (trypan 블루 흠 없는) 15 필드 수를 계산 합니다. 세포 현 탁 액의 20 µ m에 있는 셀의 총 수를 계산 합니다. 현 탁 액은 지금 모든 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 준비. 참고: 큰 신체 크기와 다른 종족에 대 한 절차를 최적화 하는 때 동등한 무게의 고환 조각을 사용 합니다. 모든 실험적인 그룹에 대 한 한 개인에서 testes를 사용 하 여 결과에 개별 가변성을 피하기 위하여. Zebrafish, 경우 우리 이용 했다는 사실에 왼쪽 및 오른쪽 고환 생식 세포13 의 동일한 (또는 매우 유사한) 번호를 포함 해야 합니다 (대표 결과 참조). 왼쪽된 고환은 오른쪽 고환 vitrified/예 열 동안 제어로 유지 되었다. 생존 비율 계산 했다 신선한 고환에서 격리 하는 셀의 수에 비해 vitrified 따뜻하게 고환에서 격리 하는 셀의 수.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mazur, P., Leibo, S. P., Seidel, G. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+the+germplasm+of+animals+used+in+biological+and+medical+research:+Importance,+impact,+status,+and+future+directions.">Cryopreservation of the germplasm of animals used in biological and medical research: Importance, impact, status, and future directions.</a> Biol. Reprod. 78 (1), 2-12 (2008).</li><li>Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+and+In+Vitro+Fertilization+at+the+Zebrafish+International+Resource+Center.">Cryopreservation and In Vitro Fertilization at the Zebrafish International Resource Center.</a> Methods Mol. Biol. 546, 45-65 (2009).</li><li>Yang, H., Carmichael, C., Varga, Z. M., Tiersch, T. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viability+of+zebrafish+(Danio+rerio)+ovarian+follicles+after+vitrification+in+a+metal+container.">Viability of zebrafish (Danio rerio) ovarian follicles after vitrification in a metal container.</a> Cryobiology. 71 (3), 367-373 (2015).</li><li>Luji&#263;, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+successful+vitrification+of+salmonid+ovarian+tissue.">First successful vitrification of salmonid ovarian tissue.</a> Cryobiology. 76, 154-157 (2017).</li><li>Bono-Mestre, C., Cardona-Costa, J., Garc&#237;a-Xim&#233;nez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+on+cell+viability+of+three+zebrafish+testicular+cell+or+tissue+cryopreservation+methods.">Effects on cell viability of three zebrafish testicular cell or tissue cryopreservation methods.</a> CryoLetters. 30 (2), 148-152 (2009).</li><li>Marinovi&#263;, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryosurvival+of+isolated+testicular+cells+and+testicular+tissue+of+tench+Tinca+tinca+and+goldfish+Carassius+auratus+following+slow-rate+freezing.">Cryosurvival of isolated testicular cells and testicular tissue of tench Tinca tinca and goldfish Carassius auratus following slow-rate freezing.</a> Gen. 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저자는 공개 없다.

이 연구의 주요 목적은 바늘에 맞게 몰입 울트라-빠른 냉각 절차 조류 및 포유류 종10,11,12 물고기 고환 (zebrafish 모델의 cryopreservation를 개발 했다 유기 체)입니다. Zebrafish 유전 자원의 cryopreservation에 관한 이전 연구의 대부분 zebrafish 정자2,,34의 cryopreservation에...

생명 공학 및 과학 소설 동향은 쥐, 초파리, zebrafish의 모형 유기 체 생물 의학에 및 다른 과학1로 사용 하는 다른 종의 새로운 돌연변이 라인의 수천의 창조에 이르렀다. 또한, 새로운 기술을 개발 하 고 사용할 수 있게 되는, 돌연변이 라인의 숫자는 꾸준히2증가. 식민지를 번 식 유지의 일반적인 관행을 넘어 유전 자원의 안전한 저장에 대 한 필요성을이 끈다. 시간이 무기한 기간에 대 한 유전 자원의 안전한 저장을 수 있는 방법으로 cryopreservation 장점이 많은 생식 시즌의 확장 circumvents broodstock, 지속적인 유지 관리를 위해 필요 하 고 그것은 더 많은 비용-와 같은 고 효율적인 노동2.
정자 cryopreservation는 지난 몇 년 동안2,3,4 중 개발에 대 한 프로토콜 zebrafish 남성 유전 물질의 성공적인 저장소에 대 한 기회를 제공 합니다. 그러나, 계란이 나 생선에는 태아의 cryopreservation 불가능 아직 그들의 복잡 한 구조와 노 른 자 물자의 다량. 최근, 원시 생식 세포 (PGCs) 또는 spermatogonial 줄기 세포 (SSCs) 이식의 연습 이식5후 정자와 난 기능으로 개발 하 여이 방 벽을 우회를 제공 합니다. 따라서, SSCs의 cryopreservation 희귀 하 고 귀중 한 유전자 자원의 보존에 새로운 프론티어를 제공합니다.
Cryopreservation 많은 장점을 제공, 비록 느린 속도 동결 과정 세포 손상2로 이어질 수 있는 몇 가지 조건을 생성 합니다. 이러한 세포와 extracellular 얼음 대형, 탈수, cryoprotectant 독성 등이 포함 됩니다. 세포내 얼음 손상 세포, extracellular 얼음 셀의 기계적 분쇄 동안 느린 속도 동결 세포에서 물 보급 탈수6으로 이어질 수 있습니다 하는 동안 발생할 수 있습니다. 최근, 얼음 대형의 부정적인 효과 방지 하는 기술로 vitrification 물고기 gametes7,,89의 cryopreservation에 적용 되었습니다. 통해 내부 및 외부 미디어 얼음7,10에 crystalizing 없이 비정 질/유리 상태로 설정 하는 매우 빠른 냉각 기법을 제공 합니다. 고환 및 난소 조직의 성공적인 vitrification 조류 및 포유류 종10,,1112, 따라서 물고기, 뿐만에서 자사의 응용 프로그램에 대 한 가능성을 열어 입증 되었습니다.
이 연구에서 우리 전체 zebrafish testes의 cryopreservation 바늘 몰입 vitrification (NIV) 절차를 제시. 오염 및 다른 세포, 특히 정 충의 낮은 존재와 상대적으로 높은 양의 초기 생식 세포 생성 cryopreservation 과정 없이 zebrafish 초기 세균 세포 절연에 대 한 신뢰할 수 있는 방법을 설명 합니다. 우리의 지식 최선을이 물고기 gonadal 조직과 zebrafish 생식 세포의 초 급속 한 냉각에 대 한 상세한 시각화 된 프로토콜을 설명 하는 첫 번째 연구 이다. 또한, 방법의 반복성 5 다른 zebrafish 긴장에서 설명 된다: AB 야생 타입, 캐스퍼 (로-/-; nacre-/-), 레오 파 드 (레오t1/t1), 바사 [Tg (vas::eGFP)]와 Wilms 종양 [Tg (wt1b::eGFP 1)] 유전자 변형 라인.

<table><tbody><tr><td>Leibovitz media (L-15)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1518</td><td>Supplemented with L-glutamine</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine methanesulfonate (MS-222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Acros Organics</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>Trehalose</td><td>Acros Organics</td><td>99-20-7</td><td>Dihydrate</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Reanal</td><td>20740-0-08-65</td><td></td></tr><tr><td>Propylene glycol</td><td>Reanal</td><td>08860-1-08-65</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Reanal</td><td>00190-1-01-65</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Gibco</td><td>9001-12-1</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8003</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Panreac AppliChem</td><td>A3778</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6146</td><td></td></tr><tr><td>Phospate buffered saline (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>Tablets for preparation of 200 ml PBS solution</td></tr></tbody></table>

cryopreservation of zebrafish spermatogonia by whole testes needle immersed ultra-rapid cooling

생명 공학 및 과학의 현재 동향 breeding 식민지 유지의 일반적인 관행을 넘어 유전 자원의 안전한 저장을 위한 새로운 방법에 대 한 필요성에 따라서 선도 모델 생물에서 새로운 라인의 수천의 창조 될. 이 연구의 주요 목적은 바늘에 맞게 vitrification (NIV) 절차 전체 zebrafish testes cryopreserve에 몰입 했다. 전체 testes에 의해 초기 단계 세균 세포의 cryopreservation 이니라 제공 합니다 zebrafish의 스토리지에 대 한 가능성 유전 자원, 특히 이후 이식 후 그들은 둘 다 남성과 여성 gametes로 성숙 수 있습니다. 침술 바늘, 두 cryoprotective 미디어 (평형 솔루션 1.5 M 메탄올 및 1.5 M 프로필 렌 글리콜; 및 vitrification 솔루션 3 M 디 메 틸 sulfoxide 및 3 M 프로필 렌 글리콜을 포함)에 equilibrated에 testes excised 했다 그리고 액체 질소에 뛰어들었다. 샘플 3 결과 지구 온난화 솔루션의 시리즈에는 예 열 했다. 이 기술의 주요 장점은 다운스트림 조작; 촉진 따뜻하게 testes의 소화 후 (1) 정 충의 부족은 (2) 매우 빠른 따라서 냉각 및 cryoprotectants; 그들의 독성을 줄일 필요 농도 감소를 극대화 하는 액체 질소에 조직의 최적의 노출 사용 냉각 (3) 동기 여러 testes의, 노출에 cryoprotectants 액체 질소; 그리고 (4) 반복성의 5 개의 다른 zebrafish 긴장에서 50% 이상의 생존 여 시연.

평균적으로, 초기 단계 세균 세포는 하나의 신선한 zebrafish 고환에서 격리 수 물고기의 크기에 따라 40, 000와 200000 셀 사이의 다양 합니다. 모든 5 종자에 신선한 zebrafish testes 소화 때 초기 생식 세포만 셀 셀 정지 (그림 2)에 아니었다. 초기 단계 세균 세포 옆에 수많은 정 충도 발견 됐다. 다른 한편으로, cryopreserved testes의 소화 후 훨씬 적은 정 충 했다. ...

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Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling

Zebrafish Spermatogonia 전체 Testes 바늘의 cryopreservation 몰입 울트라-빠른 냉각

이 연구의 주요 목적은 바늘에 맞게 vitrification (NIV) 절차 전체 zebrafish testes cryopreserve에 몰입 했다. 또한, 5 개의 다른 zebrafish 긴장에서 방법의 반복성 시험 되었다.

Current trends in science and biotechnology lead to creation of thousands of new lines in model organisms thereby leading to the necessity for new methods ...

cryopreservation-zebrafish-spermatogonia-whole-testes-needle-immersed

Research

JoVE Journal

Biology

8.3K 조회수.  Szent István University. 이 연구의 주요 목적은 바늘에 맞게 vitrification (NIV) 절차 전체 zebrafish testes cryopreserve에 몰입 했다. 또한, 5 개의 다른 zebrafish 긴장에서 방법의 반복성 시험 되었다.

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Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, specifically the generation of homozygous gynogenetic diploids is useful in genetic analysis because it allows the direct production of homozygotes from a single heterozygous mother. This article describes a modified protocol for ploidy duplication based on a heat pulse during the first cell cycle, Heat Shock 2 (HS2). Through inhibition of centriole duplication, this method results in a precise cell division stall during the second cell cycle. The precise one-cycle division stall, coupled to unaffected DNA duplication, results in whole genome duplication. Protocols associated with this method include egg and sperm collection, UV treatment of sperm, in vitro fertilization and heat pulse to cause a one-cell cycle division delay and ploidy duplication. A modified version of this protocol could be applied to induce ploidy changes in other animal species.

A modified protocol for ploidy manipulation uses a heat shock to induce a one-cycle stall in cytokinesis in the early embryo. This protocol is demonstrated in the zebrafish but may be applicable to other species.

열 충격이 치료와 제브라 피쉬 배아의 배수성 조작

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, ...

연구

발생학

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding the chromosome events that take place during meiotic prophase, including the pairing, synapsis, and recombination events that ensure proper chromosome segregation. While the mouse has been an important model for understanding the molecular mechanisms underlying these processes, not all meiotic events in this system are analogous to human meiosis. We recently demonstrated the exciting potential of the zebrafish as a model of human spermatogenesis. Here we describe, in detail, our methods to visualize meiotic chromosomes and associated proteins in chromosome spread preparations. These preparations have the advantage of allowing high resolution analysis of chromosome structures. First, we describe the procedure for dissecting testes from adult zebrafish, followed by cell dissociation, lysis, and spreading of the chromosomes. Next, we describe the procedure for detecting the localization of meiotic chromosome proteins, by immunofluorescence detection, and nucleic acid sequences, by fluorescence in situ hybridization (FISH). These techniques comprise a useful set of tools for the cytological analysis of meiotic chromatin architecture in the zebrafish system. Researchers in the zebrafish community should be able to quickly master these techniques and incorporate them into their standard analyses of reproductive function.

Nuclear surface spreads are an indispensable tool for studying chromosome events during meiosis. Here we demonstrate a method to prepare and visualize meiotic chromosomes during prophase I from zebrafish spermatocytes.

제브라피쉬 정자세포에서 메오틱 염색체 스프레드 의 준비

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

유전학

Screening Sperm for the Rapid Isolation of Germline Edits in Zebrafish

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging model systems. CRISPR-Cas genome editing systems use a synthetic guide RNA (sgRNA) to target a CRISPR-associated (Cas) endonuclease to specific genomic DNA loci, where the Cas endonuclease generates a double-strand break. The repair of double-strand breaks by intrinsic error-prone mechanisms leads to insertions and/or deletions, disrupting the locus. Alternatively, the inclusion of double-stranded DNA donors or single-stranded DNA oligonucleotides in this process can elicit the inclusion of precise genome edits ranging from single nucleotide polymorphisms to small immunological tags or even large fluorescent protein constructs. However, a major bottleneck in this procedure can be finding and isolating the desired edit in the germline. This protocol outlines a robust method for screening and isolating germline mutations at specific loci in Danio rerio (zebrafish); however, these principles may be adaptable in any model where in vivo sperm collection is possible.

CRISPR-Cas technologies have revolutionized the field of genome editing. However, finding and isolating the desired germline edit remains a major bottleneck. Therefore, this protocol describes a robust method for quickly screening F0 CRISPR-injected zebrafish sperm for germline edits using standard PCR, restriction digest, and gel electrophoresis techniques.

제브라피쉬에서 생식계열 편집의 신속한 분리를 위한 정자 스크리닝

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

높은 처리량 Zebrafish의 정자 Cryopreservation에 대한 방법과 체외에서 수정

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

생물학

Making Gynogenetic Diploid Zebrafish by Early Pressure

Heterozygosity in diploid eukaryotes often makes genetic studies cumbersome. Methods that produce viable homozygous diploid offspring directly from heterozygous females allow F1 mutagenized females to be screened directly for deleterious mutations in an accelerated forward genetic screen. Streisinger et al.1,2 described methods for making gynogenetic (homozygous) diploid zebrafish by activating zebrafish eggs with ultraviolet light-inactivated sperm and preventing either the second meiotic or the first zygotic cell division using physical treatments (heat or pressure) that deploymerize microtubules. The "early pressure" (EP) method blocks the meiosis II, which occurs shortly after fertilization. The EP method produces a high percentage of viable embryos that can develop to fertile adults of either sex. The method generates embryos that are homozygous at all loci except those that were separated from their centromere by recombination during meiosis I. Homozygous mutations are detected in EP clutches at between 50% for centromeric loci and less than 1% for telomeric loci. This method is reproduced verbatim from the Zebrafish Book3.

This is a method for generating gynogenetic diploid zebrafish embryos (embryos whose only genetic contribution comes from the mother) by blocking the second meiotic division immediately after fertilization with ultraviolet light-inactivated sperm. EP embryos are not fully homozygous due to recombination during the first meiotic division, however they are homozygous at all loci that have not been separated from their centromere by recombination.

초기 압력에 의해 Gynogenetic의 Diploid의 Zebrafish 만들기

Heterozygosity in diploid eukaryotes often makes genetic studies cumbersome. Methods that produce viable homozygous diploid offspring directly from ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

제브라피시 배아와 애벌레의 전체 마운트 면역항암화학

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for forward genetic analysis of developmental processes due to their external fertilization, embryonic size, rapid ontogeny, and optical clarity &#8211; a constellation of traits that enable the direct observation of events ranging from gastrulation to organogenesis with a basic stereomicroscope. Further, zebrafish embryos can survive for several days in the haploid state. The production of haploid embryos in vitro is a powerful tool for mutational analysis, as it enables the identification of recessive mutant alleles present in first generation (F1) female carriers following mutagenesis in the parental (P) generation. This approach eliminates the necessity to raise multiple generations (F2, F3, etc.) which involves breeding of mutant families, thus saving the researcher time along with reducing the needs for zebrafish colony space, labor, and the husbandry costs. Although zebrafish have been used to conduct forward screens for the past several decades, there has been a steady expansion of transgenic and genome editing tools. These tools now offer a plethora of ways to create nuanced assays for next generation screens that can be used to further dissect the gene regulatory networks that drive vertebrate ontogeny. Here, we describe how to prepare haploid zebrafish embryos. This protocol can be implemented for novel future haploid screens, such as in enhancer and suppressor screens, to address the mechanisms of development for a broad number of processes and tissues that form during early embryonic stages.

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

반수체 제브라 피쉬 배아의 생산에 의해<em&gt; 체외</em&gt; 시비

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

높은 처리량 응용 프로그램에 대한 성인 Zebrafish의 마음의 복구

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from zebrafish has not been established. The previous methods for blood collection from zebrafish are lethal, such as lateral incision, decapitation and tail ablation. Thus we have developed a novel &#8220;repeated&#8221; blood collection method, and present here a detailed protocol outlining this procedure. This method is minimally invasive and results in a very low mortality rate (2.3%) for zebrafish, thus enabling repeated blood sampling from the same individual. The maximum volume of blood sampling is dependent on body weight of the fish. The volume for repeated blood sampling at intervals should be&#160;&#8804;0.4% of body weight every week or &#8804;1% every 2 weeks, which were evaluated by measurements of blood hemoglobin. Additionally, hemoglobin, fasting blood glucose, plasma triacylglycerol (TG) and total cholesterol levels in male and female adult zebrafish were measured. We also applied this method to investigate the dysregulation of glucose metabolism in diet-induced obesity. This blood collection method will allow many applications, including glucose and lipid metabolism and hematological studies, which will increase the use of zebrafish as a human disease model organism.

Repeated blood sampling is necessary and important in animal research. We developed a novel, non-lethal and reliable method for repeated blood collection from adult zebrafish, and applied this method to the study of blood biochemistry, including glucose metabolism.

성인 Zebrafish의에서 혈액 검사에 대한 반복 채혈

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from ...

Sequential Immunofluorescence and Immunohistochemistry on Cryosectioned Zebrafish Embryos

Investigation of intercellular interactions often requires discrete labeling of specific cell populations and precise protein localization. The zebrafish embryo is an excellent tool for examining such interactions with an in vivo model. Whole-mount immunohistochemical and immunofluorescence assays are frequently applied in zebrafish embryos to assess protein expression. However, it can be difficult to achieve accurate mapping of co-localized proteins in three-dimensional space. In addition, some studies may require the use of two antibodies that are not compatible with the same technique (e.g., antibody 1 is only suitable for immunohistochemistry and antibody 2 is only suitable for immunofluorescence). The purpose of the method described herein is to perform sequential immunofluorescence and/or immunohistochemistry on individual cryosections derived from early-stage zebrafish embryos. Here we describe the use of sequential rounds of immunofluorescence, imaging, immunohistochemistry, imaging for a single cryosection in order to achieve precise identification of protein expression at the single-cell level. This methodology is suitable for any study in early-stage zebrafish embryos that requires accurate identification of multiple protein targets in individual cells.

This protocol demonstrates sequential immunofluorescence and immunohistochemistry on cryosections from early-stage zebrafish embryos enabling precise colocalization analyses in specific cell populations.

냉동 제브라피시 배아의 순차적 면역형광 및 면역성화학

Investigation of intercellular interactions often requires discrete labeling of specific cell populations and precise protein localization. The zebrafish ...