We appreciate Dr. Jeong-Soo Lee for sharing the Tg(dbh:EGFP-MYCN) transgenic fish with us in our study. This work was supported by a grant 1K99CA178189-01 from the National Cancer Institute, a fellowship from the Pablove Foundation and the Friends for Life, and young investigator awards from the Alex's Lemonade Stand Foundation and the CureSearch for Children's Cancer Foundation.

참고 : 모든 제브라 피쉬의 연구와 동물의 유지 보수는 메이요 클리닉 연구소 IACUC 승인 프로토콜 # A41213에 맞게 시행 하였다. Transgenesis 1. DNA를 구축 <ol><li> DNA 서식 파일로 (BACPAC 자원 센터 (BPRC)에서) CH211-270H11 BAC 클론을 사용하여 5.2 kb의 도파민 베타 수산화 (D βh) 프로모터 영역 (8)을 증폭. 2 분 94 ° C (94 ° C, 15 초, 50 ° C, 10주기 30 초, 68 ° : 긴 DNA 템플릿의 길고 정확한 PCR 증폭을위한 PCR 시스템 적절하고 PCR에 대해 다음주기 프로그램을 사용하여 (94 ° C, 15 초, 53 ° C, 30 초, 68 ° C, 8 분), 68 ° C, 4 분 (정방향 프라이머 5&#39;-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGCGTACTCCCCCTTTTTAGG-3 &#39;30 회 반복 C, 8 분), 역방향 프라이머 5&#39; GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTGTTGCTTTGTCGTCTTTTGA-3 &#39;). </li><li> D βh -pDONRP4-P1R 항목 클리오 만들기NE 8 등 다중 게이트웨이로 상업 재조합 복제 시스템을 사용하는 경우. 정제 dβh PCR 제품 (172 NG / μL) 1 μL (150 NG / μL) pDONRP4-P1R 기증자 벡터의 1 μl를 혼합 (다른 게이트웨이 벡터 박사 카이 빈 치엔, 대학교에서 관대 한 선물은과 함께. 유타) , TE 완충액 (pH 8.0) BP clonase 효소 믹스의 2 μL와의 4 μL는 25 ° C에서 1 시간 동안 배양 한 다음 원샷 TOP10 관할 E.로 변환 대장균 제조 업체의 프로토콜에 따라. </li><li> 생성 D βh : EGFP-MYCN 유전자 변형 단계 1.2에서 언급 한 8 사용하여 재조합 복제 시스템을 구축. 각 항목 클론의 1 μL 5.2 킬로바이트 dβh 프로모터 (dβh -pDONR P4-P1R 구조), EGFP가 정지 코돈 (PME-EGFP 구조를) 부족을 포함하여 (150 NG / μL), 인간 MYCN의 cDNA를 혼합 (관대 한 선물 박사 호가 티에서 펜실베니아의 어린이 병원, MYCN - pDONRP2R-P3 구조), 1 μL I-SceI 제한 효소 인식 부위 (박사 C. Grabher, 기술의 카를 스루에 연구소, 카를 스루에, 독일)에서 관대 한 선물, TE 버퍼의 4 μl를 포함하는 수정 대상 벡터의 (150 NG / μL) ( LR Clonase 효소 믹스의 2 μL으로 pH 8.0), 25 ° C에서 1 시간 동안 배양 한 다음 변환 화학적으로 유능한 E.을에 대장균과 같은 하나의 샷 10 제조업체의 프로토콜을 따르십시오. </li><li> MITF합니다 : MITF 유전자가 PNP-MITF 벡터 소화에 의해 8을 구성 NotI을 SalI을 제한 효소로 2 시간 동안 실온에서, 그리고 발표 2.65 kb의 서브 클로닝하여 (박사 D. Raible, 대학교에서 관대 한 선물을 워싱턴.) MITF 플 랭킹 프로모터 및 I-SceI 제한 효소 절단 부위를 함유하는 개질 된 벡터의 pBluescript 계을 NotI 및 MluI 부위에 지브라 피쉬 MITF 유전자의 코딩 서열을 함유하는 DNA 단편 (휘 박사로부터 철 기질 선물NG, 보스턴 대학), 제조자의 프로토콜에 따라 T4 DNA 리가 제를 사용. 참고 : 안정적인 MYCN 발현 라인을 생성의 효율성을 높이기 위해, D는 βh : EGFP-MYCN와 MITF :. MITF DNA 구조는 하나의 세포 단계의 진주층의 배아에 coinjected되는 자개가 신경이 부족 돌연변이 물고기의 유형 지정 크레스트 유래 개발 36시 melanophore. 따라서, 안료 분사 배아 세포의 모양 MITF의 통합을 시사한다 : MITF DNA는 게놈에 생성한다. 이것은 두세 coinjected DNA 작 제물은 물고기 유전체 (31)에 공적분 될 수 있음을 입증되었다. EGFP-MYCN 유전자와 MYCN 안정적인 형질 전환 라인의 식별을 용이 : 따라서, MITF 발현에 의한 색소 침착은 dβh의 통합을위한 마커 역할을 할 수 있습니다. </li><li> EGFP-MYCN과 MITF : D의 βh 믹스 MITF DNA를I-SceI 제한 효소 효소 1 μL 버퍼 0.75 μL와 15 μL 반응의 총 부피 : 1 비율로 3에서 구축합니다. 반응에서 DNA의 총량이 750 NG를 초과하지 않도록하십시오. </li><li> 4 시간 또는 O / N에 대한 RT에서 I-SceI 제한 효소 소화를 수행하십시오. 둘째 날, I-SceI-하는 DNA는이 마이크로 인젝션 준비 또는 미래에 주입 -20 ° C에서 저장 될 수 소화. 효소의 효율을 유지하기 위해 작은 분취 량을 -80 ℃에서 I-SceI 제한 효소를 저장. </li><li> 박사 C. Grabher에서 (관대 한 선물을 pENTRY1A 벡터의 EcoRI 및 NotI으로 ​​사이트에 한 pcDNA3TM 벡터에서 인간 ALKF1174L 및 야생 형 ALK 유전자 (다나 - 파버 암 연구소에서 박사 조지 관대 한 선물) 7 서브 클론, 기술의 카를 스루에 연구소, 카를 스루에, 독일)는 제조업체의 프로토콜에 따라 T4의 DNA 리가 아제를 사용하여. </li><li> D의 βh 생성 : ALKF1174L을 &lt;/ EM&gt; 또는 dβh 프로토콜 : 1.2에서 언급 한 바와 같이 시스템을 사용하여 재조합 ALKWT 유전자 작 제물. 간단히 세 가지 항목 클론을 결합, dβh -pDONRP4-P1R, ALKF1174L- pENTRY1A (또는 ALKWT -pENTRY1A)과 P3E - 폴리 -A, I-SceI 제한 효소 인식 부위 (박사 C. Grabher, 카를 스루에에서 관대 한 선물을 포함하는 수정 대상 벡터에 기술 연구소, 카를 스루에, 독일), 제조 업체의 프로토콜에 따라, LR Clonase 효소 믹스를 사용하여. </li><li> 혼합 D βh : ALKF1174L (또는 dβh : ALKWT)과 dβh : mCherry DNA가 3에서 구축 : 1의 비율 및 프로토콜 1.5-1.6에 설명 된대로 I-SceI 제한 효소 효소로 선형화. </li></ol> 2. 미세 주입 <ol><li> 모든 주사 37 1.0 mm 직경 유리 마이크로 피펫을 사용합니다. 주입 전에 면도날 유리 마이크로 피펫의 팁을 끊다. 분사에 의해 주입 부피를 보정미네랄 오일 방울로 H 2 O를 보내고. 생성 된 방울의 직경을 측정하고 주입 부피는 하나의 셀 단 배아 세포의 총 부피의 10 % 미만임을 보장하는 마이크로 인젝터 (압력 또는 압력 펄스의 지속 기간)을 조정한다. </li><li> DNA를 함유하는 주사 용액 5 μL의 신선한 I-SceI 제한 효소 (5 유닛 / μL)을 추가로 0.5 μl를 추가하면 주입 transgenesis (38)의 효율을 증가시키기 직전 구성한다. 하나의 세포 단계의 배아의 세포질에 선형화 된 DNA 구조의 50 ~ 80 페이지를 주입한다. 주사의 성공을 보장하기 위해, 시각화를위한 0.25 % 페놀 레드 샘플을 섞는다. 세포 주입 후 빨간색을 설정하면, 미세 주입이 성공. 형질 전환 어류를 생성하는 높은 성공률을 보장하기 위해, 우리는 일반적으로 500 개의 배아를 주입. </li><li> EGFP-MYC : 안정적으로 MYCN를 발현하는 형질 전환 어류를 생성하려면, 선형화 된 D의 βh을 coinjectN과 MITF : MITF DNA 구조 (3에서 : 1 비율) 한 세포 단계에서 색소 돌연변이 진주층의 제브라 피쉬의 배아에. MITF의 발현은 물고기 게놈의 유전자 구조의 통합을위한 기자 역할을합니다. </li><li> dβh로 : ALK F1174L (ALKWT 또는 dβh :) : 야생 형 또는 MYCN 유전자 변형 배아에서 ALK의 모자이크 과발현를 들어, 선형 개발 βh 공동 주입 한 세포로 : mCherry DNA (1 비율 3에서) 구축 야생 형 AB 물고기 형질 전환 어류 : F1 이형의 Tg (EGFP-MYCN dβh)의 번식에 의한 배아. 따라서, 자손의 절반은 MCYN을위한 형질 전환하고 반은 야생 형이다. </li></ol> 안정 또는 모자이크 형질 전환 어류 3. 화면 <ol><li> tricaine (0.02 %)로 주로 주입 진주층 배아 마취, MYCN 안정한 발현 라인 식별의 효율성을 증가시키기t 일 색소 침착에 대한 postfertilization 및 화면의 3-5. 생식 세포에서 EGFP-MYCN 유전자 : D βh을 수행 설립자 물고기에 대한 추가 검사를 위해 성적 성숙에 신선한 계란 물에 새로운 배양 접시에 색소 침착 배아를 전송하고 올립니다. </li><li> EGFP-MYCN, 더 유전자형 1 ~ 2 일 후 수정에서 EGFP 양성 배아 야생 형 AB 물고기와 화면 교배 색소 F0 성인 물고기의 생식 전송과 설립자를 식별합니다. PCR 튜브에 하나의 EGFP 양성 F1 배아를 놓고 모든 액체를 제거합니다. 4 배 용해 버퍼의 12.5 μL, 35 μL의 H 2 O 2.5 ㎕의 단백질 분해 효소 K 단일 배아 (10 ㎎ / ㎖)를 포함 gDNA를 추출 버퍼의 50 μl를 추가합니다. 4 배의 용해 완충액 50 mL로 K. 단백질 분해 효소를 불 활성화 98ºC에서 배양 10 분 뒤에 55 ° C에서 2 ~ 3 시간 동안 반응을 품어 1M 트리스의 500 μl를 추가 (PH 8.4), 2.5 ml의 1M의 의 KCl의 tH 2 O의 O를 47 ml의 참고 : F0 MYCN 안정적인 형질 전환 어류가 야생 형 AB 물고기와 자란 후, 자손의 모든 색소입니다. 따라서, 색소 침착 MYCN- 긍정적 인 물고기의 식별 마커로 사용될 수 없습니다. MYCN 형질 전환 어류에있는 동안, EGFP-MYCN 융합 단백질 등 및 연수에 같은 우수한 경부 신경절 및 교감 체인 순차 분절 신경절 및 비 PSNS의 도파민 성 뉴런의 교감 신경을 포함한 PSNS 표현된다 뇌 신경 8. 따라서, EGFP의 표현은 MYCN 안정적인 형질 전환 배아의 식별을위한 마커 역할을 할 수 있습니다. </li><li> , 템플릿으로 색소 F1 배아에서 추출한 gDNA를 2 μl를 사용하는 것은 MYCN을 프라이머 - 테스트 F1 : 5&#39;-CTG CTT GAG AAC GAG CTG TG-3 &#39;; MYCN -R3 : 5&#39;-AGG CAT CGT TTG AGG ATC AG-3 &#39;다음 프로그램 위트시간 GC-RICH PCR 시스템 : 3 분 95 ° C의 1주기, 30 초 동안 95 ° C의 25주기, 30 초 동안 58 ° C, 3 분 동안 72 ° C. 우리는 일반적으로 착색 된 배아의 통합 MYCN 전이 유전자의 존재, MITF와 MYCN를 과발현 6 개 이상의 설립자 물고기가이 방법에 의해 확인 된 사항을 확인하기 위해 하나의 결합에서 14 ~ 16 착색 된 배아를 유전자형. </li><li> EGFP 양성 F1 배아의 나머지 부분을 올립니다. 핀은 상기 클립 물고기로 MYCN 트랜스의 통합을 확인하기 프로토콜을 사용하여 상기 세 2-3 개월 째 그들을 유전자형. F1 MYCN에게 야생 형 AB 물고기 안정적인 유전자 변형 물고기 새끼를 낳. ALK F1174L (또는 dβh : ALKWT) dβh과 : 선형화 개발 βh을 공동-주입 프로토콜 2.4에 설명 된대로 mCherry DNA는 하나의 세포 배아로 구성한다. </li><li> 정렬 실험에서 배아를 발현 MYCN는 입체 불소를 사용하여 프로토콜 2.4에 설명escence 현미경 일 PSNS에서 EGFP-MYCN의 발현에 대한 postfertilization 1-3에서 주로 주입 된 배아를 화면. 그런 다음, 일 postfertilization의 2-5시, tricaine (0.02 %)와 배아를 마취 및 입체 형광 현미경을 사용하여 PSNS에 mCherry의 발현에 따라 다시 그 MYCN- 양 또는 음의 배아를 정렬 할 수 있습니다. mCherry의 발현은 모자이크 차 주입 동물의 조직에서 ALK의 동시 발현 마커 역할을합니다. 참고 : ALK F1174L 및 dβh : mCherry, dβh : ALKWT 및 dβh : mCherry, 또는 dβh 야생 형 물고기와 MYCN 안정적인 형질 전환 어류의 번식으로 인한 ~ 600 자손 D의 βh 포함, 선형화 된 DNA 구조와 그룹 당 주입 하였다 : mCherry 혼자, 각각. mCherry의 모자이크 식을 주로 주입 물고기 70 ~ 90 %를 관찰 할 수있다. 한 반은 일 대주입 된 물고기의 세 번째는 종양 시계의 애벌레 단계를 통해 살아 남았다. </li><li> mCherry + MYCN + 및 mCherry + MYCN의 모든 올립니다 - 제브라 피쉬의 책 (39)의 표준 프로토콜에 따라 배아를 5 주 postfertilization에서 시작 종양 발병을 모니터링 할 수 있습니다. </li></ol> 모자이크 형질 전환 어류 4. 종양 시계 <ol><li> 종양 발병의 증거 5 주 postfertilization에서 시작하여 매 2 주마다 mCherry- 긍정적 주로 주입 물고기를 모니터링합니다. </li><li> mCherry의 존재 tricaine (0.02 %)와 화면 물고기 마취 -와 EGFP가 디지털 광경 DS-U1 카메라 장착 니콘 SMZ-1500 형광 입체 현미경 PSNS 종양에서 발현. </li><li> 종양이 ALK 변이 유전자를 발현 여부를 확인하려면 mCherry-와 ALK 유전자 분석 PCR에 대한 EGFP 양성 대중을 격리 할 것. </li><li> PCR을 사용하여, 게놈 DNA를 증폭ALK P7 : 5&#39;-AGG CCA GGT GTC CGG AAT의 GC-3 &#39;와 ALK P18 : 5&#39;-TGT CTT CAG GCT GAT GTT GC-3&#39;과 다음 PCR 반응 : 1주기 다음 프라이머와 개발 종양에서 추출 5 분 94 ° C의 30주기 (30 초 30 초 94 ° C, 55 ° C, 60 초 동안 72 ° C). 이어서, 시퀀스의 ALK P7 프라이머로 PCR의 생성물은 더 mCherry 양성 종양에서 돌연변이 또는 야생형 ALK의 존재를 확인한다. </li></ol>

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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-injection+strategies+to+modify+radiation+sensitivity+and+tumor+initiation+in+transgenic+Zebrafish.">Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish.</a> Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+mutations+of+ALK+kinase+in+neuroblastoma.">Oncogenic mutations of ALK kinase in neuroblastoma.</a> Nature. 455 (7215), 971-974 (2008).</li><li>Pugh, T. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+bridges+in+vertebrate+gastrulation.">Intercellular bridges in vertebrate gastrulation.</a> PLoS One. 6 (5), e20230 (2011).</li><li>Ivics, Z., Izsvak, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expanding+universe+of+transposon+technologies+for+gene+and+cell+engineering.">The expanding universe of transposon technologies for gene and cell engineering.</a> Mob DNA. 1 (1), 25 (2010).</li><li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+cell+transplantation+using+adult+rag2+mutant+zebrafish.">Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish.</a> Nat Methods. 11 (8), 821-824 (2014).</li><li>Watson, I. R., Takahashi, K., Futreal, P. A., Chin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+patterns+of+somatic+mutations+in+cancer.">Emerging patterns of somatic mutations in cancer.</a> Nat Rev Genet. 14 (10), 703-718 (2013).</li><li>Sander, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+disruption+in+somatic+zebrafish+cells+using+engineered+TALENs.">Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs.</a> Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

이 대표 연구에서는이 유전자가 현저히 화합물 안정적인 형질 전환 어류 coexpressing에서 우리의 이전 연구 결과와 일치하는 신경 모세포종의 발병을 가속화하기 위해 협력 것을 보여주기 위해 유전자 변형 물고기를 발현 MYCN의 mCherry 리포터 유전자로 과도 공사 출 활성화 ALK의 동시 발현을 사용 모두 ALK와 MYCN 8 활성화. 이 형질 전환 방법은 모자이크 종래 방법에 ...

암은 시간이 지남에 병리학 적 돌연변이, 삭제 및 염색체 이익의 축적에 의해 표시 진보적 인 질병이다. 이러한 유전 적 이상이 저산소증과 같은 스트레스 반응 세포 골격의 세포주기, 세포 사멸, 에너지 대사 및 조립에 이르기까지 다수의 세포 과정에 영향을 미칠 수있다. 따라서, 종양은 생물학적 과정의 스펙트럼에 걸쳐 여러 유전 수차의 집단 행동을 반영한다. 전체 게놈 시퀀싱, 진유 전체 시퀀싱, 타겟 시퀀싱, 깊은 시퀀싱 및 게놈 넓은 협회 연구 등을 포함하여 통합 게놈 연구 노력은, 종양 1-4 본질적으로 모든 종류의 새로운 유전 적 변화의 증가를 확인했다. 많은 경우에, 유전 적 병변은 질병의 발병 기전에서의 협력을 제안, 랜덤하지 않은 방식 5-8에서 함께 발생합니다. F를 결과 비정상적으로 발현 유전자의 큰 배열의 발암 역할을 해부이러한 게놈 병변 ROM 새로운 치료 전략을 고안하고 이러한 에이전트에 종양 세포의 반응을 이해할 필요가 있지만, 이것은 높은 처리량 기능적 게놈 분석의 수행에 대해 매우 강력한 동물 모델 시스템을 필요 곤란한 과제를 증명했다 생체. 포유 동물, 특히 쥐가 암 생물학에서 선호하는 모델이지만, 제브라 피쉬는 상당한 관심을 끌기 시작했다. 경골 제브라 피쉬 (다리오 레 리오 (rerio))는 1960 년대 이후 개발 연구를위한 모델 생물로 사용되었으며, 1982 9-11 종양 발병 기전의 연구에 적용 하였다. 유지 보수, 작은 몸 크기, 높은 생산력의 용이성 제브라 피쉬의 이상과 병리학 적 표현형 (10)을 부여 돌연변이를 확인하는 대규모 앞으로 유전 화면을위한 강력한 모델합니다. 제브라 피쉬 배아의 광학 투명성,이 암 모델의 넓은 사용을 지원하는 또 다른 핵심 기능입니다그것은, 실시간 9 설치류 (12)에 상대적으로 어려운 응용 프로그램을 종양 발생을 찾기 위해 실시하는 생체 내 이미징에 있습니다. 제브라 피쉬 참조 게놈 (Zv9)의 최근 비교 게놈 분석은, 71 %는 82 %가 남자 (OMIM) 데이터베이스 (13)에 온라인 멘델의 상속 질병 관련 유전자와 상관 관계가있는 인간의 orthologues을 갖는, 26,206 단백질 코딩 유전자를 밝혀 (14). 따라서, 제브라 피쉬가 신경 모세포종 (8)을 포함하여 인간의 암의 다양한 유형을 모델링하는 데 사용되었습니다, T 세포 급성 림프 구성 백혈병 (T-ALL) 15, 16, 흑색 종 (17, 18), 유잉 육종 (19), 횡문근 육종 (20, 21), 췌장암 22, 간세포 암 (23)과 골수는 24, 25을 악성 종양, 이종 이식에 대한 암 모델 11,26 연구로 선정되었습니다. 안정적인 형질 전환제브라 피쉬의 접근 방식은 일반적으로 기능 획득 정상적인 발달 또는 질병의 발병 기전 (27, 28)에서 유전자의 효과를 연구하는 데 사용됩니다. 이러한 모델 (도 1a)을 개발하기 위해, 하나의 셀은 하나의 야생형으로 배아 조직 - 특이 적 프로모터에 의해 구동 관심 유전자를 포함하는 DNA 작 제물을 주사. 주입 된 배아는 성적 성숙에 도달하면 세 4 개월 주사 후, 그들은 설립자 물고기로 라이센스를 자신의 생식 세포에 건설 DNA의 통합을 보여주는 것들에 대한 선별 야생 형 물고기와 outcrossed된다. 그러한 카피 수와 트랜스 진의 통합 사이트 등 많은 요소, 안정한 유전자 변형 라인에서의 유전자 발현에 영향을 미친다. 그러므로, 트랜스 제닉 종양 모델을 개발하기 위해, 하나의 종양 유전자를 과발현하는 형질 전환 계통 안정 다중 먼저 생성되고 종양을 유도 이어질 수도 수준에서 트랜스 유전자를 발현하는 라인에 대해 스크리닝 할 수있다. 그러나, 후보 O 과발현ncogene가 생식 세포에 독성이며, 직접 트랜스 29 과발현 형질 전환하여 안정된 선을 생성하는 것이 곤란하다. 따라서, 이러한 접근법은 적절한 암 모델을 생성하기 위해 고장 위험이 높은, 시간 소모적 일 수있다. 여기서 우리는 생체 내에서 기능 게놈 연구에 대한 기존의 안정적인 transgenesis를 통해 독특한 장점을 제공 모자이크 과도 transgenesis (그림 1B)에 따라 다른 전략을 설명한다. 이 방법에서는, 하나 이상의 형질 전환 유전자 구조체는 형질 전환 또는 야생형의 하나의 배아 세포 단계로 주입된다. 유전자를 포함하는 주입 된 DNA 구조는 개별 물고기 (30)의 여러 세포 집단 내에서 혼합 된 유전자형의 결과로, 다음 mosaically 무작위로 차 주입 물고기에 통합되어 있습니다. 또한, 여러 DNA의 공사 출 하나의 세포 배아의 구축은 공동의 통합을 위해 임의의 사이트에서 동일한 셀에, TRA 하나를 허용 리드유전자의 발현과 세포를 CE 및 모자이크 동물 (31)의 질병 발병시 다른 유전자의 상호 작용을 탐구한다. 원리의 증거로서, 우리는 일시적으로 야생 형 물고기와 MYCN 과발현 형질 전환 어류의 도파민 베타 수산화 (D의 βh) 프로모터의 제어하에 주변 교감 신경계 (PSNS)에 mCherry 리포터 유전자와 mutationally 활성화 ALK를 (F1174L) 과발현. 수용체 티로신 키나제를 코딩 ALK는 고위험 신경 모세포종 5-7,32,33에서 가장 빈번하게 돌연변이 된 유전자이다. ALK 가장 빈번한 활성화 및 유력한 체세포 돌연변이 중 하나 (F1174L)은, 표현 위에-IS MYCN- 고위험 신경 모세포종 환자를 증폭하고 안정적인 형질 전환 마우스 및 형질 전환 제브라 피쉬 모델 8,34,35 모두에서 신경 모세포종의 종양 발생을 촉진 MYCN 과발현과 synergizes. 모자이크으로MYCN 유전자 변형 물고기 mCherry와 ALK (F1174L)의 과도 과발현, 우리는 모자이크 transgenesis 전략에 신속하고 효율적으로 사용될 수 있음을 시사 ALK (F1174L) 및 MYCN 모두를 과발현 안정적인 형질 전환 어류에서 관찰 된 종양 발병의 가속도를 효과적으로 요약 생체 내 종양 개시에 여러 개의 종양 유전자의 상대적 기여도를 평가합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="663">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:171px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Expand Long Template PCR System&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Roche Applied Science, IN</td>
			<td style="width:119px;">11681834001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pCR-TOPO vector&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Invitrogen, CA</td>
			<td style="width:119px;">451641</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:171px;">New England Biolabs, MA</td>
			<td style="width:119px;">M0202M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gateway LR Clonase II enzyme 
			Mix</td>
			<td style="width:171px;">Invitrogen, CA</td>
			<td>11791-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gateway&#174; BP Clonase&#174; II enzyme mix</td>
			<td style="width:171px;">Invitrogen, CA</td>
			<td>11789-020</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">GC-RICH PCR System&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Roche Applied Science, IN</td>
			<td>12 140 306 001</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Meganuclease I-SceI&#160;</td>
			<td style="width:171px;">New England Biolabs, MA</td>
			<td>R0694S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nikon SMZ-1500 stereoscopic fluorescence microscope&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Nikon, NY</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nikon digital sight DS-U1 camera</td>
			<td style="width:171px;">Nikon, NY</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mosaic zebrafish transgenesis for functional genomic analysis of candidate cooperative genes in tumor pathogenesis

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers. To robustly and efficiently identify oncogenic &#8220;drivers&#8221; among these tumors and define their complex relationships with concurrent genetic alterations during tumor pathogenesis remains a daunting task. Recently, zebrafish have emerged as an important animal model for studying human diseases, largely because of their ease of maintenance, high fecundity, obvious advantages for in vivo imaging, high conservation of oncogenes and their molecular pathways, susceptibility to tumorigenesis and, most importantly, the availability of transgenic techniques suitable for use in the fish. Transgenic zebrafish models of cancer have been widely used to dissect oncogenic pathways in diverse tumor types. However, developing a stable transgenic fish model is both tedious and time-consuming, and it is even more difficult and more time-consuming to dissect the cooperation of multiple genes in disease pathogenesis using this approach, which requires the generation of multiple transgenic lines with overexpression of the individual genes of interest followed by complicated breeding of these stable transgenic lines. Hence, use of a mosaic transient transgenic approach in zebrafish offers unique advantages for functional genomic analysis in vivo. Briefly, candidate transgenes can be coinjected into one-cell-stage wild-type or transgenic zebrafish embryos and allowed to integrate together into each somatic cell in a mosaic pattern that leads to mixed genotypes in the same primarily injected animal. This permits one to investigate in a faster and less expensive manner whether and how the candidate genes can collaborate with each other to drive tumorigenesis. By transient overexpression of activated ALK in the transgenic fish overexpressing MYCN, we demonstrate here the cooperation of these two oncogenes in the pathogenesis of a pediatric cancer, neuroblastoma that has resisted most forms of contemporary treatment.

mutationally 활성화 ALK의 F1174L 또는 야생형 ALK의 과발현은 신경 모세포종 유도에서 MYCN과 협력 할 수 있는지 여부를 조사하기 위해, 우리는 MYCN를 과발현하는 형질 전환 어류의 PSNS의 개발 βh 프로모터의 제어하에 활성화 인간의 ALK 또는 야생 형 인간 ALK를 과발현. ALKF1174L 또는 dβh - - 다음과 같은 구조, dβh 중 하나 ALKWT는 dβh와</em...

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Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis | Developmental Biology | Video

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis

The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

종양의 병인에 후보 협동 유전자의 기능 게놈 분석을위한 모자이크 Zebrafish의 Transgenesis

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers.  To robustly and efficiently ...

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11.0K 조회수.  Mayo Clinic College of Medicine, Center for Individualized Medicine. The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

비디오: Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the cardiac transcriptome from being masked by the global embryonic transcriptome, it is necessary to collect sufficient numbers of hearts for further analyses. Furthermore, as zebrafish cardiac development proceeds rapidly, heart collection and RNA extraction methods need to be quick in order to ensure homogeneity of the samples. Here, we present a rapid manual dissection protocol for collecting functional/beating hearts from zebrafish embryos. This is an essential prerequisite for subsequent cardiac-specific RNA extraction to determine cardiac-specific gene expression levels by transcriptome analyses, such as quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR). The method is based on differential adhesive properties of the zebrafish embryonic heart compared with other tissues; this allows for the rapid physical separation of cardiac from extracardiac tissue by a combination of fluidic shear force disruption, stepwise filtration and manual collection of transgenic fluorescently labeled hearts.

To analyse cardiac gene expression profiles during zebrafish heart development, total RNA has to be extracted from isolated hearts. Here, we present a protocol for collecting functional/beating hearts by rapid manual dissection from zebrafish embryos to obtain cardiac-specific mRNA.

전사 분석을위한 대규모 Zebrafish의 배아 심장의 해부

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

연구

발생학

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

에반스 블루 염료와 Zebrafish의 애벌레 골격 근육 무결성 분석

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

개발에 미세 주입을 대상으로 기술<em&gt; Xenopus의</em&gt; 신장

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and behavioral phenotypes. The remarkably diverse phenotypes that have evolved as marine populations adapt to countless freshwater environments, combined with the ability to cross marine and freshwater forms, provide a rare vertebrate system in which genetics can be used to map genomic regions controlling evolved traits. Excellent genomic resources are now available, facilitating molecular genetic dissection of evolved changes. While mapping experiments generate lists of interesting candidate genes, functional genetic manipulations are required to test the roles of these genes. Gene regulation can be studied with transgenic reporter plasmids and BACs integrated into the genome using the Tol2 transposase system. Functions of specific candidate genes and cis-regulatory elements can be assessed by inducing targeted mutations with TALEN and CRISPR/Cas9 genome editing reagents. All methods require introducing nucleic acids into fertilized one-cell stickleback embryos, a task made challenging by the thick chorion of stickleback embryos and the relatively small and thin blastomere. Here, a detailed protocol for microinjection of nucleic acids into stickleback embryos is described for transgenic and genome editing applications to study gene expression and function, as well as techniques to assess the success of transgenesis and recover stable lines.

Transgenic manipulations and genome editing are critical for functionally testing the roles of genes and cis-regulatory elements. Here a detailed microinjection protocol for the generation of genomic modifications (including Tol2-mediated fluorescent reporter transgene constructs, TALENs, and CRISPRs) is presented for the emergent model fish, the threespine stickleback.

Threespine 큰가시 고기과에 형질 전환 및 게놈 편집에 대한 미세 주입

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into the developing oocyte. Because these events rely on maternal products which typically act very soon after fertilization-that preexist inside the egg, standard approaches for expression and functional reduction involving the injection of reagents into the fertilized egg are typically ineffective. Instead, such manipulations must be performed during oogenesis, prior to or during the accumulation of maternal products. This article describes in detail a protocol for the in vitro maturation of immature zebrafish oocytes and their subsequent in vitro fertilization, yielding viable embryos that survive to adulthood. This method allows the functional manipulation of maternal products during oogenesis, such as the expression of products for phenotypic rescue and tagged construct visualization, as well as the reduction of gene function through reverse-genetics agents.

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

An optimized protocol for the in vitro maturation of zebrafish oocytes used for the manipulation of maternal gene products is presented here.

사용 모성 유전자 제품의 기능 조작<em&gt; 체외</em제브라 피쉬&gt; 난자의 성숙

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and scanning electron microscopy. The sub-diffraction limit resolution capabilities of super-resolution light microscopes allow improving the accuracy of the correlated data. Briefly, 110 nanometer thick cryo-sections are transferred to a silicon wafer and, after immunofluorescence staining, are imaged by super-resolution light microscopy. Subsequently, the sections are preserved in methylcellulose and platinum shadowed prior to imaging in a scanning electron microscope (SEM). The images from these two microscopy modalities are easily merged using tissue landmarks with open source software. Here we describe the adapted method for the larval zebrafish retina. However, this method is also applicable to other types of tissues and organisms. We demonstrate that the complementary information obtained by this correlation is able to resolve the expression of mitochondrial proteins in relation with the membranes and cristae of mitochondria as well as to other compartments of the cell.

This protocol describes the necessary steps to obtain subcellular protein localization results on zebrafish retina by correlating super-resolution light microscopy and scanning electron microscopy images.

Zebrafish 망막에 단백질 지 방화를 해결 하기 위해 상호 슈퍼 해상도 전자 현미경 검사 법

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Use of a Recombinant Mosquito Densovirus As a Gene Delivery Vector for the Functional Analysis of Genes in Mosquito Larvae

In vivo microinjection is the most commonly used gene transfer technique for analyzing the gene functions in individual mosquitoes. However, this method requires a more technically demanding operation and involves complicated procedures, especially when used in larvae due to their small size, relatively thin and fragile cuticle, and high mortality, which limit its application. In contrast, viral vectors for gene delivery have been developed to surmount extracellular and intracellular barriers. These systems have the advantages of easy manipulation, high gene transduction efficiency, long-term maintenance of gene expression, and the ability to produce persistent effects in vivo. Mosquito densoviruses (MDVs) are mosquito-specific, small single-stranded DNA viruses that can effectively deliver foreign nucleic acids into mosquito cells; however, the replacement or insertion of foreign genes to create recombinant viruses typically causes a loss of packaging and/or replication abilities, which is a barrier to the development of these viruses as delivery vectors.
Herein, we report using an artificial intronic small-RNA expression strategy to develop a non-defective recombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) in vivo delivery system. Detailed procedures for the construction, packaging and quantitative analysis of the rAaeDV vectors, and for larval infection are described.
This study demonstrates, for the first time, the feasibility of developing a non-defective recombinant MDV micro RNA (miRNA) expression system, and thus providing a powerful tool for the functional analysis of genes in mosquito and establishing a basis for the application of viral paratransgenesis for controlling mosquito-borne diseases. We demonstrated that Aedes albopictus 1st instar larvae could be easily and effectively infected by introducing the virus into the water body of the larvae breeding site and that the developed rAaeDVs could be used to overexpress or knock down the expression of a specific target gene in larvae, providing a tool for the functional analysis of mosquito genes.

We report using an artificial intronic small RNA expression strategy to develop a non-defective recombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) in vivo delivery system. A detailed procedure for the construction, packaging, and quantitative analysis of the rAaeDV vectors as well as for larval infection is described.

모기 유 충에서 유전자의 기능 분석에 대 한 유전자 납품 벡터로 재조합 모기 Densovirus의 사용

In vivo microinjection is the most commonly used gene transfer technique for analyzing the gene functions in individual mosquitoes. However, this method ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in developmental biology for decades. Traditionally, most gene expression studies relied on visual evaluation of the ISH signal, a method that is prone to bias, particularly in cases where sample identities are known a priori. We have previously reported on a method to circumvent this bias and provide a more accurate quantification of ISH signals. Here, we present a simple guide to apply this method to quantify the expression levels of genes of interest in ISH-stained embryos and correlate that with their corresponding genotypes. The method is particularly useful to quantify spatially restricted gene expression signals in samples of mixed genotypes and it provides an unbiased and accurate alternative to the traditional visual scoring methods.

Gene editing technologies have enabled researchers to generate zebrafish mutants to investigate gene function with relative ease. Here, we provide a guide to perform parallel embryo genotyping and quantification of in situ hybridization signals in zebrafish. This unbiased approach provides greater accuracy in phenotypical analyses based on in situ hybridization.

제브라피시의 인시투 혼성화 염색의 게놈 및 정량화

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and molecular complexity of skeletal elements increases with development. Tissue heterogeneity, such as at the interface of cartilaginous and osseous elements with each other or with surrounding tissues, is one obstacle to the study of developing cartilage and bone. Our protocol provides a rapid method of tissue processing and isolation of cartilage and bone that yields high quality RNA for gene expression analysis. Fresh frozen tissues of mouse embryos are sectioned and brief cresyl violet staining is used to visualize cartilage and bone with colors distinct from surrounding tissues. Slides are then rapidly dehydrated, and cartilage and bone are isolated subsequently by LCM. The minimization of exposure to aqueous solutions during this process maintains RNA integrity. Mouse Meckel&rsquo;s cartilage and mandibular bone at E16.5 were successfully collected and gene expression analysis showed differential expression of marker genes for osteoblasts, osteocytes, osteoclasts, and chondrocytes. High quality RNA was also isolated from a range of tissues and embryonic ages. This protocol details sample preparation for LCM including cryoembedding, sectioning, staining and dehydrating fresh frozen tissues, and precise isolation of cartilage and bone by LCM resulting in high quality RNA for transcriptomic analysis.

This protocol describes laser capture microdissection for the isolation of cartilage and bone from fresh frozen sections of the mouse embryo. Cartilage and bone can be rapidly visualized by cresyl violet staining and collected precisely to yield high quality RNA for transcriptomic analysis.

유전자 발현 분석을 위한 마우스 배아 연골 및 뼈의 레이저 포획 미세 해부

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine mammary gland is composed of two distinct epithelial cell compartments, serving different functions: the outer, contractile myoepithelial compartment and the inner, secretory luminal compartment. Here, we describe a method by which the cells comprising these compartments are isolated and then combined to investigate their individual lineage contributions to mammary gland morphogenesis and differentiation. The method is simple and efficient and does not require sophisticated separation technologies such as fluorescence activated cell sorting. Instead, we harvest and enzymatically digest the tissue, seed the epithelium on adherent tissue culture dishes, and then use differential trypsinization to separate myoepithelial from luminal cells with ~90% purity. The cells are then plated in an extracellular matrix where they organize into bilayered, three-dimensional (3D) organoids that can be differentiated to produce milk after 10 days in culture. To test the effects of genetic mutations, cells can be harvested from wild type or genetically engineered mouse models, or they can be genetically manipulated prior to 3D culture. This technique can be used to generate mosaic organoids that allow investigation of gene function specifically in the luminal or myoepithelial compartment.

The mammary gland is a bilayered structure, comprising outer myoepithelial and inner luminal epithelial cells. Presented is a protocol to prepare organoids using differential trypsinization. This efficient method allows researchers to separately manipulate these two cell types to explore questions concerning their roles in mammary gland form and function.

차동 시도에 의한 모자이크 유방 오르가노이드 생성

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...