렌즈 상피 explants의 준비, 닥터 존 맥어보이 9 연구실에서 유래 방법에서 조정되었습니다. 이 작품은 국립 안과 연구소, 교내 연구 프로그램 Z01 - EY000238 - 22에 의해 투자입니다

1 부 : 렌즈의 제거 재료 및 시약 : <ol><li> 마이크로 해부 가위, 곡선, 무딘 팁, (예 : as.RS - 5983, Roboz 외과 악기 (주) 부동산, 게이 더 스버그, MD), 마이크로 해부 핀셋, 곡선 팁 (예 : Roboz # RS5137 등). </li><li> 중지 매체 : 중간 199 소 혈청 100 단위, 알부민 / ML 페니실린 0.1 %, 100μg/ml의 스트렙토 마이신, 2.5 μg / ML Amphotericin B.의 시약을 포함 Invitrogen, 칼스 배드, CA에서 사용할 수 있습니다. </li></ol> 절차 : <ol><li> 건강, 베데스다, MD 국립 연구소에서 제공하는 지침에 따라 신생아 쥐 (2-4일 세) 안락사. </li><li> 수술 가위로 눈꺼풀을 제거합니다. 바깥쪽으로 팽창에 눈을 강제로 눈을 소켓 반대편에 곡선 핀셋로 부드럽게 누르십시오. 가위로 눈 후부 측면에 작은 절개를합니다. 절개 반대 눈의 측면에 대한 족집게로 누르면, 렌즈와 부착된 유리 본체의 작은 금액은 다음 렌즈 곡선 핀셋로 데리러 수 있도록, 파열을 통해 밖으로 강제로 수 있습니다. 케어는 렌즈 캡슐을 깰하지 않도록해야합니다. </li><li> 5ml 따뜻하고 살균 서스펜션 매체를 포함하는 60mm 플라스틱 조직 문화 요리에 렌즈를 전송하는 곡선 핀셋을 사용합니다. </li></ol> 2 부 : explants의 Microdissection 재료 및 시약 : <ol><li> 마이크로 분석 해 봅시다 족집게, 0.1 mm 팁 (예 Roboz RS - 4976 등). 우리는 때문에 팁의 유연성의 Dumostar 합금을 사용할 수 있지만 다른 철강 합금도 가능합니다. 그들은이 절차를 수행하는 동안 휴식이나 구부하는 경향으로 0.1mm 이상의 얇은 팁을 핀셋은 권장되지 않습니다. </li><li> 서스펜션 매체 (1 부 참조) </li><li> 햄의 F12 중간 또는 중간 199 (Invitrogen, Carlsburg, CA) Unsupplemented </li></ol> 절차 : <ol><li> 다음 단계는 살균 해부 도구 및 멸균 매체를 사용하여 청소, 초안이없는 환경에서 수행되어야합니다. </li><li> 스테레오 - 해부 현미경을 사용하여 0.1 mm 팁 핀셋있는 모든 준수 조직의 렌즈를 청소하고 5ml 살균 정지 매체 (이 단계는 오염을 줄이기 위해 도움)이있는 두 번째 60mm 문화 요리로 전송할 수 있습니다. 핀셋으로 5ml 살균, unsupplemented 매체를 포함하는 35mm 문화 요리에 렌즈의 원하는 번호를 전송합니다. (낮은 염료 농도가 해부 쉽게하기 때문에 우리는 종종이 단계 햄의 F12 (Invitrogen)을 사용되지만, 보통 199도 허용 않습니다 항생제 또는 다른 추가이 단계에서 필요하지 않습니다..) 12 explants이 이루어질 수있는만큼 많은 요리이 정도 크기의 중심 인치 적은 explants는 해부 도구를 작은 접시에 쉽게 넘어가지 수 없기 때문에, 만들 수 경우에도 그러나, 35mm 요리를 사용해야합니다. 37 조직 문화 인큐베이터로 남은 렌즈가 들어있는 접시를 전송 ° 그들이 필요한 C까지. </li><li> 렌즈의 후부 측면을 식별합니다. 이것을 인식하는 방법에는 여러 가지가 있습니다 : 1) 뒷부분이 약간 평평있는 앞쪽에보다 라운드 시합이며, 절개하는 동안 실내 온도와 같은 사람들이 시원한 2) 신생아 쥐 렌즈는 백내장 추위를 형성합니다. 추위 백내장 완전히 렌즈를 가득하지 않은 경우 사후 측면이 불투명 지역에서 먼 쪽입니다. 불투명도 37로 요리를 온난 화, 렌즈를 가득있는 경우 ° C 몇 분 동안 그것을 반대합니다. 후부 측면은 냉각시 백내장 개혁으로 확인하실 수 있습니다. 3) 투니카 vasculosa lentis의 흔적은 후부 측면에서 볼 수 있습니다. 4) 사후 치료는 사후 측면에서 볼 수 있습니다. 캡슐을 열 것입니다 어디에이이기 때문에 제대로 후부 측면을 확인하는 것은 필수입니다. 앞쪽에 측면에 렌즈를 여는 것은 상피 찢어 것입니다. </li><li> 뒷부분 측면이 확인되면 위쪽으로 그것을 설정하고 (오른손잡이 노동자의 경우) 왼쪽 핀셋에 렌즈를 파악. 그런 다음 작은 배 생산에 대한 권리 핀셋으로 후부 캡슐을 꼬집어. </li><li> 오른쪽 핀셋으로 후부 캡슐을 잡고있는 동안, 왼쪽 핀셋과 캡슐의 공간 이동을 파악하여 캡슐에 작은 균열을 만들어 반대 방향으로 족집게의 두 쌍을 가져옵니다. </li><li> 핀셋으로 retracting 캡슐의 가장자리를 쥐고 있지만, 핀셋으로 접시의 플라스틱으로 그것을 누르면, 다른 클릭한 다음, 한쪽에 먼저 아래로 당기세요. 캡슐 단단히 여러 지점에서 판에 부착된 때까지, 모든 렌즈의 적도 주변에 이동이 여러 번 반복합니다. 왼쪽 핀셋과 장소에서 캡슐을 잡고 부드럽게 렌즈 적도에서 섬유 세포와 상피 세포 사이의 첨부 파일을 깰 수있는 권리 핀셋으로 섬유 덩어리를 바위. 다음의 하단에 부착된 남아있는 캡슐 / 상피를 벗어 압연, 멀리 섬유 질량 밀어요리. 접시에있는 모든 렌즈와 함께이 과정을 계속합니다. 제거하고 섬유 대중 (또는 그들이 다른 연구에 대한 렌즈 단백질의 소스로 냉동 저장) 폐기. </li></ol> 파트 3 : Microdissection 및 중앙 explants 문화 재료 및 시약 : <ol><li> 멸균 일회용 메스, # 15 블레이드 (신시내티 외과 주 신시내티, OH) </li><li> 멸균 인산은 칼슘과 마그네슘 (Invitrogen, 칼스 배드, CA)를 살린 버퍼 </li><li> 문화 매체 : 100ng/ml FGF - 2 (시그마 - 알드리치 (주) 세인트 루이스, MO)가 포함된 정지 매체. </li></ol> 절차 : <ol><li> 멸균 메스를 사용하여 단 (CE) (그림에게 중앙 상피 세포로 구성된, 측면에서 중앙 광장에 약 2.0mm 떠나, 차별화 (그림 1A)의 초기 단계의 세포를 포함하는 주변 상피 (PE)를 멀리 트림 1B). </li><li> biosafety 캐비닛에 중앙 explants 들어있는 접시를 전송합니다. 멸균 PBS 신선한, equilibrated (37 ° C, 5 % CO 2) 정지 매체의 1ml로 한 칼슘, 마그네슘을 포함하고 3 번 씻으십시오. 이들은 크게 오염의 가능성을 줄일 수 씻는다. </li><li> 차별 하나를 유발하고, 37 humidified, 조직 문화 인큐베이터에 explants을 배치 문화 매체 2mL를 추가 ° C, 5 % CO 2. 문화 기간이 몇 시간처럼 짧은하거나 연구하는 매개 변수에 따라 한 2-3주로 확장할 수 있습니다. 매체는 2-3일마다 변경해야합니다. </li></ol> 4 부 : 차별과 연관된 이벤트의 분석에 explants의 착취 1. 단백질이나 RNA의 분석을위한 수확 explants 자료 : <ol><li> Microdissecting 핀셋 </li><li> SDS 용해 버퍼 또는 RNA - 나중에 </li></ol> 절차 : <ol><li> 잠복기의 끝에, 문화 매체를 제거합니다. </li><li> 스테레오 - 해부 현미경을 사용하여 부드럽게 각 explant의 가장자리를 느슨하게. </li><li> 핀셋 각 explant을 들어 100μl SDS의 용해 버퍼 (단백질 분석을 위해) 또는 RNA - 이상 (RNA 분석을위한)에 대한 포함된 튜브로 전송할 수 있습니다. explant가 핀셋에 집중하지 않도록하기 위해 솔루션에 핀셋의 끝부분을 선동하다. </li></ol> 2. immunofluorescence을위한 수확 explants 재료 및 시약 : <ol><li> 인산은 칼슘과 마그네슘 (Invitrogen, 칼스 배드, CA)를 살린 버퍼 </li><li> 인산가 (Invitrogen, 칼스 배드, CA) (칼슘, 마그네슘 제외) 살린 버퍼 </li><li> 4 % paraformaldehyde (보스톤 Bioproducts, 우스터, MA) </li><li> Microdissecting 핀셋 </li><li> 소수성 마킹 펜 </li><li> 유리 현미경 슬라이드 </li><li> 0.25 % Triton은 인산의 X - 100 살린 버퍼. </li></ol> 절차 : <ol><li> PBS는 칼슘과 마그네슘을 포함하는으로 간단히 explants 린스. </li><li> 실온에서 30 분 4 % paraformaldehyde를 추가하여 조직을 수정. </li><li> 정착액을 제거하고 인산은 생리 버퍼로 바꿉니다. 고정 explants 그들이 immunostaining에 대한 해제와 유리 슬라이드로 전송하므로 다소 딱딱하게된다. </li><li> 위치 조직을 도움 컬링을 방지하기 위해 슬라이드에 PBS의 작은 방울 (칼슘, 마그네슘 제외) 놓습니다. microdissecting 핀셋을 사용하여 explant를 들고 슬라이드에있는 드롭에를 삽입합니다. explant을 건드리지 않고, 조심스럽게 유리에 explant을 버리고 종이 심지로 액체를 제거하고 3-5분 위해 상온에서 공기에있는 조직이 건조하게. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1519/fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1 대답 : 주변 상피는 차별화 특정 단백질을 표현하고 있습니다. 표시된 explant는 즉시 microdissection 후 N - cadherin을위한 immunostained했다. 표현식은이 지역의 세포가 주변 상피가 세포를 제거하는 멀리 줄어들 수 있습니다. B.에게 차별하기 시작 것을 나타내는 주변 상피의 세포의 밴드에서 본 것을 표현 N - cadherin과 다른 차별화 특정 단백질. 빨간색 고리는 세포의 위치를​​ 나타내는 회색으로 나와있는 작은 광장이 패널 1A에 표시된 상피의 사분면을 나타내는 동시에 표현 N - cadherin. 주변 상피는 아직 구별하기 시작하지 않은 유일한 세포를 포함하는 중앙 광장을 떠나, 넷 메스 상처에 의해 제거할 수 있습니다.

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	<li>McAvoy, J. W., Chamberlain, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+(FGF)+induces+different+responses+in+lens+epithelial+cells+depending+on+its+concentration.">Fibroblast growth factor (FGF) induces different responses in lens epithelial cells depending on its concentration.</a> Development. 107 (2), 221-228 (1989).</li><li>Campbell, M. T., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onset+of+fibre+differentiation+in+cultured+rat+lens+epithelium+under+the+influence+of+neural+retina-conditioned+medium.">Onset of fibre differentiation in cultured rat lens epithelium under the influence of neural retina-conditioned medium.</a> Exp Eye Res. 39 (1), 83-94 (1984).</li><li>Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+lens+epithelial+explants+induced+to+differentiate+into+fibres+by+fibroblast+growth+factor+(FGF).">Structural analysis of lens epithelial explants induced to differentiate into fibres by fibroblast growth factor (FGF).</a> Exp Eye Res. 49 (3), 479-494 (1989).</li><li>Golestaneh, N., Fan, J., Fariss, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lens+major+intrinsic+protein+(MIP)/aquaporin+0+expression+in+rat+lens+epithelia+explants+requires+fibroblast+growth+factor-induced+ERK+and+JNK+signaling.">Lens major intrinsic protein (MIP)/aquaporin 0 expression in rat lens epithelia explants requires fibroblast growth factor-induced ERK and JNK signaling.</a> J Biol Chem. 279 (30), 31813-31822 (2004).</li><li>Saravanamuthu, S. S., Gao, C. Y., Zelenka, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+is+required+for+lateral+induction+of+Jagged1+during+FGF-induced+lens+fiber+differentiation.">Notch signaling is required for lateral induction of Jagged1 during FGF-induced lens fiber differentiation.</a> Dev Biol. 332 (1), 166-176 (2009).</li><li>Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF-induced+lens+cell+proliferation+and+differentiation+is+dependent+on+MAPK+(ERK1/2)+signalling.">FGF-induced lens cell proliferation and differentiation is dependent on MAPK (ERK1/2) signalling.</a> Development. 128 (24), 5075-5084 (2001).</li><li>Dirks, R. P., Kraft, H. J., Van Genesen, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cooperation+between+two+silencers+creates+an+enhancer+element+that+controls+both+the+lens-preferred+and+the+differentiation+stage-specific+expression+of+the+rat+beta+B2-crystallin+gene.">The cooperation between two silencers creates an enhancer element that controls both the lens-preferred and the differentiation stage-specific expression of the rat beta B2-crystallin gene.</a> Eur J Biochem. 239 (1), 23-32 (1996).</li><li>Yang, Y., Stopka, T., Golestaneh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+alphaA-crystallin+via+Pax6,+c-Maf,+CREB+and+a+broad+domain+of+lens-specific+chromatin.">Regulation of alphaA-crystallin via Pax6, c-Maf, CREB and a broad domain of lens-specific chromatin.</a> The EMBO journal. 25 (10), 2107-2118 (2006).</li><li>McAvoy, J. W., T, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+retinas+promote+cell+division+and+fibre+differentiation+in+lens+epithelial+explants.">Neural retinas promote cell division and fibre differentiation in lens epithelial explants.</a> Curr Eye Res. 3 (6), 827-834 (1984).</li></ol>

쥐 렌즈 explant 시스템은 성공적으로 렌즈 섬유 21,3,4,5에 렌즈 상피 세포의 터미널 차별을 연구하는 실험실의 숫자가 사용되었습니다. 100ng/ml에서 FGF - 2에 노출하면 explants는 형태와 며칠 동안 순차적으로 3,4,5 나타나는 유전자 발현의 변화와 함께, 분 6 시간내에 신호의 변화를 보여주기 시작합니다. 치료가 오염을 방지하기 위해 촬영하는 경우에는 문화 2-3 주 동안 가능한 남아있다. FGF - 2 이전에 분화 마커를 표현하는 세포가 1.5을 추가하는 경우 그들은 몇 가지가 포함부터이 프로토콜에 설명되어있는 중앙 explants는 차별과 연관된 이벤트의 순서를 공부에 특히 유용합니다. 세포가 그것이 가능한 차별과 연관된 신호 및 transcriptional 이벤트의 시간 과정을 따르도록하고, 군대로, 동기 구별. 시간이 서로 다른 길이에 대한 Culturing의 explants 따라서 순서 이벤트에 대한 정확한 시간적 정보를 제공합니다. 특정 저해제는 관련 신호 경로를 식별하는 문화 매체에 추가할 수 있습니다. Explants는 SDS 젤 전기 영동과 immunoblotting하여 단백질 발현을 분석하거나 RT - PCR에 의해 특정 mRNAs의 표현을 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 문화 시대의 길이에 따라 600 NG / explant - 20-50 μg / explant와 RNA 수율에서 단백질 수익률 범위는 약 200입니다. 우리는 일반적으로 요리마다 5-6 explants 몇 assays위한 충분한 단백질 또는 RNA를 제공할는 것을 발견했습니다. explants에서 RNA는 차별 화를위한 중요한 수 있습니다 소설 유전자를 식별할 수 microarray 분석에 의해 유전자 발현을 평가하기위한 cDNA를 준비하는 데 사용할 수 있습니다. Explants도 transfected 수 있습니다. transfection 효율은 일반적으로 낮은이지만, 그것은 기자의 유전자에게 4 시금을하기에 충분, 7, 8. explants의 Immunofluorescence 현미경 관심의 단백질의 subcellular 위치를 결정하여 생화 학적 방법에 유용한 외래를 제공합니다. 따라서, 쥐 렌즈 explants의 준비와 문화는 유전자 변형 및 노크 아웃 마우스의 생성과 같은 생체내 기술에서 보완 할 수 포유류에서 터미널 렌즈 차별을 공부위한 강력한 시스템을 제공합니다.

preparation and culture of rat lens epithelial explants for studying terminal differentiation

안구 렌즈의 앞쪽에 표면은 모양체를 기본 환상 영역에서 세포 분열 따위에 의해 번식 상피 세포의 monolayer로 덮여 있습니다. 망막에서 diffusing FGF 그들이 렌즈의 대량를 작성할 길쭉한 렌즈 섬유 세포의 후부 배열로 차별화 유도 어디 분할에 따라, 이들 세포는 뒤로 마이 그 레이션. 렌즈 섬유로 렌즈 상피 세포의 분화는 FGF - 2의 존재의 앞쪽에 상피의 중심 지역의 culturing의 explants에 의해 체외에서 유도된 수 있습니다. Explants은 안구의 렌즈를 제거하고 해부 핀셋으로 후부 측면에 렌즈 캡슐을 쥐고하여 신생아 쥐의 렌즈에서 준비가되어 있습니다. 후부 캡슐은 다음 부드럽게 열고 찢어진과 조직 문화 요리의 플라스틱 바닥에 내려 누르고있다. explant의 주변 지역은 메스로 제거하고 중앙 지역은 다음 공부하는 매개 변수에 따라, 한 2-3으로 주 100ng/ml FGF - 2의 존재 양식이다. 교양 explants의 상피 세포가 주 일 기간 동안 대략 synchrony의 차별 때문에, 신호 및 유전자 발현의 시간 코스는, 분자 생화학 및 약리 기술을 이용하여 결정하실 수 있습니다. 그것이 관심의 단백질의 subcellular 지방화을 보여주고 신호 경로의 실험 조작의 생리적 결과를 확인할 수 같이 Immunofluorescence 현미경이 방법은 강력한 부가됩니다.

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Preparation and Culture of Rat Lens Epithelial Explants for Studying Terminal Differentiation

FGF - 2의 존재 양식 때 쥐 렌즈 상피 조직의 중심 지역의 Explants는 동기 구별. 이러한 문화의 Immunofluorescence 현미경은 유전자 발현 및 단말 차별과 연관된 신호 이벤트에 대한 소설 정보를 제공하실 수 있습니다.

터미널 차별 유학을위한 준비 및 랫 렌즈 상피 Explants의 문화

The anterior surface of the ocular lens is covered by a monolayer of epithelial cells, which proliferate in an annular zone underlying the ciliary body.  ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.6K 조회수.  National Eye Institute (NEI), National Institutes of Health (NIH). FGF - 2의 존재 양식 때 쥐 렌즈 상피 조직의 중심 지역의 Explants는 동기 구별. 이러한 문화의 Immunofluorescence 현미경은 유전자 발현 및 단말 차별과 연관된 신호 이벤트에 대한 소설 정보를 제공하실 수 있습니다.

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Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, organotypic slice cultures allow one to perform a number of manipulations that are not presently feasible in-vivo. To date, organtotypic embryonic brain slice cultures have been used to follow individual cells using time-lapse microscopy, manipulate the expression of genes in the ganglionic emanances (a region that is hard to target by in-utero electroporation), as well as for pharmacological studies. In this video protocol we demonstrate how to make organotypic slice cultures from rat embryonic day 18 embryos. The protocol involves dissecting the embryos, embedding them on ice in low melt agarose, slicing the embedded brains on the vibratome, and finally plating the slices onto filters in culture dishes. This protocol is also applicable in its present form to making organotypic slice cultures from different embryonic ages for both rats and mice. 

E18 랫 두뇌의 Organotypic 슬라이스 문화

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, ...

연구

생물학

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the function and structure of human epithelial cells. Here we describe in detail the method of growing bronchial epithelial cells from bronchial airway tissue that is harvested by the surgeon at the times of lung surgery (e.g. lung cancer or lung volume reduction surgery). With ethics approval and informed consent, the surgeon takes what is needed for pathology and provides us with a bronchial portion that is remote from the diseased areas. The tissue is then used as a source of explants that can be used for growing primary bronchial epithelial cells in culture. Bronchial segments about 0.5-1cm long and &le;1cm in diameter are rinsed with cold EBSS and excess parenchymal tissue is removed. Segments are cut open and minced into 2-3mm3 pieces of tissue. The pieces are used as a source of primary cells. After coating 100mm culture plates for 1-2 hr with a combination of collagen (30 &mu;g/ml), fibronectin (10 &mu;g/ml), and BSA (10 &mu;g/ml), the plates are scratched in 4-5 areas and tissue pieces are placed in the scratched areas, then culture medium (DMEM/Ham F-12 with additives) suitable for epithelial cell growth is added and plates are placed in an incubator at 37&deg;C in 5% CO2 humidified air. The culture medium is changed every 3-4 days. The epithelial cells grow from the pieces forming about 1.5 cm diameter rings in 3-4 weeks. Explants can be re-used up to 6 times by moving them into new pre-coated plates. Cells are lifted using trypsin/EDTA, pooled, counted, and re-plated in T75 Cell Bind flasks to increase their numbers. T75 flasks seeded with 2-3 million cells grow to 80% confluence in 4 weeks. Expanded primary human epithelial cells can be cultured and allowed to differentiate on air-liquid interface. Methods described here provide an abundant source of human bronchial epithelial cells from freshly isolated tissues and allow for studying these cells as models of disease and for pharmacology and toxicology screening.

Here we describe a detailed method for growing primary human bronchial epithelial cells from explants of human bronchial airway tissue including differentiated growth on an air-liquid interface. This method provides an abundant source of primary cells for investigating the role of the airway epithelium in human lung health and disease.

Explants에서 들어라 기본 인간 기관지 상피 세포

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

뉴트의 렌즈 재생을 공부 Culturing 이리스 안료 상피 세포에 대한 시스템

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

A Novel Method for the Culture and Polarized Stimulation of Human Intestinal Mucosa Explants

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper homeostasis directly depends on these interactions, as they shape an entire immunological response inducing tolerance against food antigens while at the same time mounting effective immune responses against pathogenic microbes accidentally ingested with food.
Intestinal homeostasis is preserved also through various complex interactions between the microbiota (including food-associated beneficial bacterial strains) and the host, that regulate the attachment/degradation of mucus, the production of antimicrobial peptides by the epithelial barrier, and the "education" of epithelial cells' that controls the tolerogenic or immunogenic phenotype of unique, gut-resident lymphoid cells' populations. These interactions have been so far very difficult to reproduce with in vitro assays using either cultured cell lines or peripheral blood mononuclear cells. In addition, mouse models differ substantially in components of the intestinal mucosa (mucus layer organization, commensal bacteria community) with respect to the human gut. Thus, studies of a variety of treatments to be brought in the clinics for important stress-related or pathological conditions such as irritable bowel syndrome, inflammatory bowel disease or colorectal cancer have been difficult to carry out.
To address these issues, we developed a novel system that enables us to stimulate explants of human intestinal mucosa that retain their in situ conditioning by the host microbiota and immune response, in a polarized fashion. Polarized apical stimulation is of great importance for the outcome of the elicited immune response. It has been repeatedly shown that the same stimuli can produce completely different responses when they bypass the apical face of the intestinal epithelium, stimulating epithelial cells basolaterally or coming into direct contact with lamina propria components, switching the phenotype from tolerogenic to immunogenic and causing unnecessary and excessive inflammation in the area.
We achieved polarized stimulation by gluing a cave cylinder which delimited the area of stimulation on the apical face of the mucosa as will be described in the protocol. We used this model to examine, among others, differential effects of three different Lactobacilli strains. We show that this model system is very powerful to assess the immunomodulatory properties of probiotics in healthy and disease conditions.

We introduce a novel method for the maintenance of human intestinal mucosa in culture and monitoring of the response to various types of stimuli over at least 24 hrs. With our method, the polarity of the tissue is maintained, allowing for a physiological stimulation via the apical route.

인간의 장내 점막의 Explants의 문화와 편광 자극을위한 새로운 방법

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper ...

Preparation of Rat Serum Suitable for Mammalian Whole Embryo Culture

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.

Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.

포유류의 전체 배아 문화에 적합 쥐 혈청의 제조

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator and that it is possible to monitor and quantify single cells along several cell cycles. We describe the full protocol used to monitor and quantify a HeLa cell culture for 2.7 days. First, cell culture acquisition is performed with a lens-free video microscope, and then the data is analyzed following a four-step process: multi-wavelength holographic reconstruction, cell-tracking, cell segmentation and cell division detection algorithms. As a result, we show that it is possible to gather a dataset featuring more than 10,000 cell cycle tracks and more than 2 x 106 cell morphological measurements.

Lens-free video microscopy enables us to monitor cell cultures directly inside the incubator. Here we describe the full protocol used to acquire and analyze a 2.7 day long acquisition of cultured HeLa cells, leading to a dataset of 2.2 x 106 measurements of individual cell morphology and 10584 cell cycle tracks.

동적에 대 한 렌즈 무료 비디오 현미경 및 부착 세포 배양의 정량 분석

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or macrophage precursors. Excessive bone resorption is one the most significant cellular mechanisms leading to osteolytic diseases, including osteoporosis, periodontitis, and periprosthetic osteolysis. The main physiological function of osteoclasts is to absorb both the hydroxyapatite mineral component and the organic matrix of bone, generating the characteristic resorption appearance on the surface of bones. There are relatively few osteoclasts compared to other cells in the body, especially in adult bones. Recent studies have focused on how to obtain more mature osteoclasts in less time, which has always been a problem. Several improvements in the isolation and culture techniques have developed in laboratories in order to obtain more mature osteoclasts. Here, we introduce a method that isolates bone marrow in less time and with less effort compared to the traditional procedure, using a special and simple device. With the use of density gradient centrifugation, we obtain large amounts of fully differentiated osteoclasts from rat bone marrow, which are identified by classical methods.

Osteoclasts are tissue-specific macrophage polykaryons derived from the monocyte-macrophage lineage of hematopoietic stem cells. This protocol describes how to isolate bone marrow cells so that large quantities of osteoclasts are obtained while reducing the risk of accidents found in traditional methods.

쥐 골 골에서의 파 골 세포 전 구체의 분리, 정제 및 분화

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, epithelial progenitor cells can self-renew and generate differentiating progeny that exhibit cellular functions similar to those of their in vivo counterparts. Herein we describe a step-by-step protocol to isolate region-specific progenitors from human lung and generate 3D organoid cultures as an experimental and validation tool. We define proximal and distal regions of the lung with the goal of isolating region-specific progenitor cells. We utilized a combination of enzymatic and mechanical dissociation to isolate total cells from the lung and trachea. Specific progenitor cells were then fractionated from the proximal or distal origin cells using fluorescence associated cell sorting (FACS) based on cell type-specific surface markers, such as NGFR&#160;for sorting basal cells and HTII-280 for sorting alveolar type II cells. Isolated basal or alveolar type II progenitors were used to generate 3D organoid cultures. Both distal and proximal progenitors formed organoids with a colony forming efficiency of 9-13% in distal region and 7-10% in proximal region when plated 5000 cell/well on day 30. Distal organoids maintained HTII-280+ alveolar type II cells in culture whereas proximal organoids differentiated into ciliated and secretory cells by day 30. These 3D organoid cultures can be used as an experimental tool for studying the cell biology of lung epithelium and epithelial mesenchymal interactions, as well as for the development and validation of therapeutic strategies targeting epithelial dysfunction in a disease.

This article provides a detailed methodology for tissue dissociation and cellular fractionation approaches allowing enrichment of viable epithelial cells from proximal and distal regions of the human lung. Herein these approaches are applied for the functional analysis of lung epithelial progenitor cells through the use of 3D organoids culture models.

오가노이드 배양을 위한 인간 폐 상피 전구 세포의 분리 및 농축

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...

닭 수정체 발달 중 단백질 발현 연구

Microinjection of Recombinant RCAS(A) Retrovirus into Embryonic Chicken Lens

Embryonic chicken (Gallus domesticus) is a well-established animal model for the study of lens development and physiology, given its high degree of similarity with the human lens. RCAS(A) is a replication-competent chicken retrovirus that infects dividing cells, which serves as a powerful tool to study the in situ expression and function of wild-type and mutant proteins during lens development by microinjection into the empty lumen of lens vesicle at early developmental stages, restricting its action to surrounding proliferating lens cells. Compared to other approaches, such as transgenic models and ex vivo cultures, the use of an RCAS(A) replication-competent avian retrovirus provides a highly effective, rapid, and customizable system to express exogenous proteins in chick embryos. Specifically, targeted gene transfer can be confined to proliferative lens fiber cells without the need for tissue-specific promoters. In this article, we will briefly overview the steps needed for recombinant retrovirus RCAS(A) preparation, provide a detailed, comprehensive overview of the microinjection procedure, and provide sample results of the technique.

저자 스포트라이트: Investigating Lens Development and Function Through Microinjection of RCAS(A) Retrovirus in Embryonic Chicken Lens(배아 닭 수정체에서 RCAS(A) 레트로바이러스의 미세주입을 통한 렌즈 발달 및 기능 조사) 

This protocol paper describes the methodology of embryonic chicken lens microinjection of an RCAS(A) retrovirus as a tool for studying in situ function and expression of proteins during lens development.

재조합 RCAS(A) 레트로바이러스를 배아 닭 수정체에 미세주입

Embryonic chicken (Gallus domesticus) is a well-established animal model for the study of lens development and physiology, given its high degree of ...