이 방법은 시험관내에서 완전히 분화된 골세포의 다량을 얻는 데 사용될 수 있기 때문에 중요하다. 이 방법의 주요 장점은 더 안정적이고 안전하며 전통적인 절차에 비해 적은 노력으로 적은 시간에 골수를 격리한다는 것입니다. 이 기술은 골다공증, 패러디염 및 periprosthetic 골다정수를 포함하여 뼈 대사 질병의 중요한 객체인 골다락의 안정한 근원을 제공할 수 있습니다.
사소한 수정으로, 이 프로토콜은 또한 쥐 또는 그밖 동물에 있는 세포를 파생한 골수의 각종 종류를 얻기에 적합할 수 있습니다. 우선, 안락사된 동물을 소핀 위치에 있는 소독된 보드에 놓습니다. 멸균 가위를 사용하여 근해 대퇴골에서 약 1센티미터 길이의 절개를 만들어 피부를 벗겨냅니다.
다음으로, 대퇴골과 티바이어스를 해부한다. 조심스럽게 부드럽게, 고관절 주위 양측 연결 부분을 잘라, 무릎, 발목 관절은 티바이어스와 대퇴골을 분리. 뼈 주위 조직의 일부를 잘라 철저 하 게 있는지 확인.
그런 다음 청소된 뼈를 완전한 배양 배지 5밀리리터가 있는 접시에 넣습니다. 멸균 가위를 사용하여 긴 뼈를 잘라냅니다. 1 밀리리터 주사기 바늘을 사용하여 골수 구멍이 흰색으로 변할 때까지 10 밀리리터의 완전한 미디어로 골수 구멍을 조심스럽게 플러시하십시오.
이 세포 현탁액을 50 밀리리터 튜브로 옮기고 70 마이크로미터 여과기로 필터링하여 나머지 조직을 제거합니다. 적혈구 용해 버퍼 5밀리리터를 넣고 8분 동안 얼음 에 세포를 배양합니다. 그 후, 세포 펠릿을 산출하기 위해 5분 동안 250배 G에서 세포를 원심분리한다.
수퍼내티퍼를 흡인하고 완전한 매체의 10 밀리리터에서 세포를 재일시 중단합니다. 혈종계를 사용하여 셀을 계산하고 이 메서드에 대해 취한 작업에 소요된 시간을 계산합니다. 첫째, 소염된 보드에 안락사 된 동물을 척추 위치에 놓습니다.
멸균 가위를 사용하여 근해 대퇴골에서 약 1센티미터 길이의 절개를 만들어 피부를 벗겨냅니다. 다음으로, 대퇴골과 티바이어스를 해부한다. 조직을 완전히 제거 할 필요가 없지만 뼈 주위의 조직의 일부를 잘라냅니다.
PBS의 12 밀리리터로 티비아와 대퇴골을 헹구고 반으로 자른다. 스네핑된 티에비아와 대퇴골을 준비된 1밀리리터 파이펫 팁에 넣고 준비된 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다. 원심 분리는 튜브를 1, 000 배 G에서 세 번, 45 초 동안 섭씨 4도에서 세 번 분리합니다.
그 후, 튜브에서 뼈가 들어 있는 파이펫 팁을 제거하고 골수를 튜브에 둡시합니다. 튜브에 PBS 200 마이크로리터를 추가하고, 골수를 완전히 분해하기 위해 반복적으로 피펫을 위아래로 넣습니다. 이 세포 현탁액을 50 밀리리터 튜브로 옮기고 70 마이크로미터 여과기로 필터링하여 남은 조직을 제거합니다.
그런 다음 혈전계를 사용하여 세포를 계산하고 이 섹션에서 취한 단계에 소요된 시간을 계산합니다. 멸균 실리코화된 원심 튜브에 세포 분리 용액 6밀리리터를 추가합니다. 희석된 셀 서스펜션을 튜브에 추가합니다.
현탁액을 추가하면 셀 층과 분리 용액 사이에 명확한 제한이 나타납니다. 다음으로, 45도 각도로 튜브의 내부 표면에 파이펫 팁을 부착합니다. 30분 동안 500배 G의 수평 원심분리기에서 층화된 용액을 원심분리합니다.
그 후 대상 셀을 위쪽에서 아래로 포함하는 흐린 두 번째 층을 흡인합니다. 대상 셀을 새 튜브로 전송합니다. PBS의 5 밀리리터를 추가하여 세포를 씻고 원심분리기를 5분 동안 250배 G로 세척합니다.
총 3개의 세척을 위해 PBS와 원심분리기를 추가하여 이 세척 과정을 반복하십시오. 골수 유도 매체로 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 혈세포계를 사용하여 세포를 계산합니다.
그런 다음, 골수 유도 배지의 5~8밀리리터를 추가하여 밀리리터당 300, 000세포의 최종 세포 용액을 얻습니다. 이 셀 용액의 밀리리터 1밀리리터를 24웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 24시간 동안 섭씨 37도에서 세포를 배양한 후, 배지를 부드럽게 흡인시키고 각 웰에 1밀리리터의 골세포 유도 배지를 추가합니다.
접시를 부드럽게 교반하고 인큐베이터에 반환합니다. 48시간마다 각 웰에서 0.8 밀리리터의 골세포 유도 배지를 제거하고 교체하십시오. 접시를 부드럽게 조인하여 인큐베이터로 돌려놓습니다.
뼈 조각을 미리 치료하기 시작하려면 마이크로 전기 톱을 사용하여 신선한 소 대퇴골 뼈 피질을 세로 축을 따라 2 센티미터 두께의 슬라이스로 자른다. 슬라이스를 자르고 연마한 후, 탈이온화된 물의 비커에 담그고 1시간 동안 100 헤르츠에서 초음파를 적용하여 슬라이스를 씻으셔도 됩니다. 이 세탁 과정을 세 번 반복하십시오.
세척된 슬라이스를 75%의 알코올로 2시간 동안 담급드시면 됩니다. 그런 다음, 알코올을 흡입하고 깨끗한 플랫폼에서 1 시간 동안 자외선에 슬라이스의 각 슬라이드를 노출. toluidine 블루 염색을 시작하려면, 24 웰 플레이트의 우물에 미리 처리 된 뼈 조각을 배치합니다.
그 후, 24 웰 플레이트에 배양 배지를 추가하여 2시간 동안 뼈 조각을 담그게 한다. 식물 및 이전에 입증 된 바와 같이 세포를 유도. 골세포가 4~6일 후에 는 0.25 개의 어금니 암모늄 수산화물로 슬라이스를 씻으시면 됩니다.
살아있는 세포를 제거하고 뼈 조각에 재흡수 구덩이의 분석을 허용하기 위해 각각 5 분 동안 슬라이스를 세 번 초음파 처리합니다. 그런 다음, 암모늄 수산화를 제거하고 2 분 동안 슬라이스 당 1 %의 toluidine 블루 용액의 1 밀리리터로 슬라이스를 얼룩지게합니다. PBS로 얼룩 조각을 씻으시다.
무작위로 5개의 뷰를 선택하고 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 재흡수 영역의 반정량 분석을 수행합니다. 먼저, 실온에서 2시간 동안 슬라이스당 2.5%의 글루타랄데히드 1밀리리터로 뼈 조각을 접두사합니다. 전세 된 슬라이스를 3 분 동안 3 분 동안 3 번 초음파 처리하여 수산화 암모늄 1 개를 사용하여 세포를 제거합니다.
그런 다음 수산화 암모늄을 제거하고 PBS로 뼈 조각을 세 번 씻고 각 세척은 12 분 동안 지속됩니다. 실온에서 2시간 동안 세척된 뼈 조각을 1%의 오스미산으로 수정합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 에탄올 그라데이션 탈수 작업을 수행합니다.
그 후, 에탄올을 이소아밀 아세테이트로 15분간 교체하십시오. 슬라이스를 금 팔라듐으로 코팅하고 전자 현미경 검사를 스캔하여 분석합니다. 이 연구에서는 많은 수의 골세포 전구체가 분리되고 정제되었으며 성공적으로 골세포가 되도록 유도되었습니다.
M-CSF와 RANKL을 보완함으로써, 거대한 골막세포는 5일에서 6일 동안 볼 수 있습니다. 이러한 골세포의 형성은 트랩 염색에 의해 성공적으로 확인된다. 크고 보라색 세포는 다중 핵을 가진 TRAP 양성 세포로 간주됩니다.
이 방법을 통해, 24웰 플레이트에서 골세포당 30개의 핵을 함유하는 800개의 골세포를 얻는 것이 일반적이다. 기존 방법에 비해 이 향상된 방법은 전체 격리 프로세스 중에 약 20분을 절약합니다. 뼈 조각을 사용하여 뼈 흡수의 활성을 평가하는 것은 일반적인 시험관 내 방법입니다.
toluidine 블루 스테인링을 통해 흡수 영역은 밝은 녹색으로 시각화됩니다. 뼈 구덩이의 구조와 특성은 전자 현미경 검사를 스캔하여 명확하게 관찰 할 수 있습니다. CTR, 골세포 특정 세포 마커 중 하나, 골세포를 식별 하 고 뼈에 있는 골세포의 형성을 연구 하는 것이 중요 하다.
CTR의 긍정적 인 표현은 명확하게 골을 식별하고 대식세포 폴리 카리온에서 구별. CTR은 녹색색에 의해 면역형광 분석기에서 명확하게 표시되고, 파란색은 세포 핵을 나타낸다. 골수를 잃지 않도록 대퇴골과 티바이어스를 골절하지 않도록하십시오.
이전에이 기술을 수행 한 적이없는 개인은 세포 수술 솔루션을 도울 때 어려움을 겪을 수 있습니다. 파이펫 팁은 튜브의 내부 표면에 부착하고 내부 표면에 45도 각도로 유지되어야 합니다.
