쥐 소장 선와(small intestinal crypt) 분리를 위해, 분리된 쥐 소장의 5mm x 5mm 단편을 적절하게 세척하여 사용한다. 조각을 진탕 없이 얼음 위에서 30분 동안 2밀리몰 EDTA를 함유하는 PBS 항생제에서 배양합니다. 세포외 기질(ECM)의 응고를 용이하게 하기 위해 미리 섭씨 37도의 조직 배양 배양기에서 24웰 플레이트를 배양합니다.
조직 단편으로부터 EDTA 용액을 흡인 한 후, 25 밀리리터의 신선한 차가운 PBS 항생제를 첨가한다. 그런 다음 용기를 손으로 30-40 번 세게 흔든다. 70미크론 스트레이너를 통해 현탁액을 한 번 걸러냅니다.
다음 단계로 넘어 가기 전에 현미경으로 크립트의 존재를 확인하십시오. 다음으로, 현탁액을 390G 및 섭씨 4도에서 3분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 2% 소르비톨을 함유하는 20밀리리터의 DMEM에 크립트 펠릿을 다시 현탁합니다(이하 소르비톨 DMEM이라고 함).
10 밀리리터의 크립트 서스펜션을 두 개의 새로운 15 밀리리터 튜브 각각에 옮깁니다. 이번에는 두 개의 튜브를 섭씨 4도에서 3분 동안 80G의 낮은 속도로 원심분리하여 큰 세포 덩어리를 세포나 파편에서 분리합니다. 상층액을 부드럽게 흡인하여 각 튜브에 약 2 밀리리터의 상청액을 남깁니다.
그런 다음 각 튜브에 10 밀리리터의 소르비톨 DMEM을 추가합니다. 현탁액을 다시 80G, 섭씨 4도에서 3분 동안 원심분리합니다. 이전에 입증된 바와 같이 상청액을 흡인하고, 재현탁을 위해 10 밀리리터의 소르비톨 DMEM을 첨가한다.
상층액을 흡인 한 후, 10 밀리리터의 완전한 DMEM을 첨가하고 위아래로 피펫팅하여 펠릿을 다시 현탁시킨다. 떠 다니는 크립트를 효율적으로 얻기 위해 서스펜션을 1 분 동안 그대로 두십시오. 1 분 후, 두 튜브의 현탁액을 70 미크론 셀 스트레이너를 통해 새로운 튜브로 여과하여 크립트를 정제합니다.
씨를 뿌리기 전에 순수한 지하실을 세려면 25 마이크로 리터 물방울을 3 점에서 6 센티미터 접시에 떨어 뜨립니다. 현미경으로 4X 배율로 지하실의 수를 세고 25마이크로리터당 지하실의 농도를 계산합니다. 그런 다음 전체 여과액을 섭씨 4도에서 3분 동안 290G에서 원심분리합니다.
파종을 위해 ECM의 크립트를 ECM 40마이크로리터당 100개의 크립트 농도로 매달아 놓습니다. 5-10회 위아래로 피펫팅하여 기포를 피하면서 부드럽게 피펫팅하여 균질한 현탁액을 얻습니다. 이어서, 웰 당 40 마이크로리터의 크립트 현탁액을 예열된 24 웰 플레이트에 시딩한다.
ECM의 중합을 위해 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 15분 동안 24웰 플레이트를 배양합니다. 마우스 표피 성장 인자, 재조합 마우스 R-Spondin 1 및 재조합 마우스 노긴을 함유하는 500 마이크로리터의 배양 배지로 웰 당 ECM을 덮는다. 웰 당 물질의 최종 농도가 여기에 표시됩니다.
섭씨 37도와 이산화탄소 5%에서 배양하여 지하실을 배양합니다. 최대 7일 동안 3시간마다 타임랩스 이미지 현미경을 사용하여 오가노이드 형태 형성을 기록하기 위해 라이브 이미징을 수행하고 직렬 Z 스택 이미지를 얻습니다. 거의 모든 고립된 지하실은 즉시 봉인되었고 상피 틈새에서 압착되면 원뿔 모양으로 나타났습니다.
또한, 최종 분획의 크립트가 통합되어 배양에 사용하기에 적합했습니다. 오가노이드 성장의 타임랩스 이미지는 장 줄기 세포의 활성 증식 및 분화가 신아와 함께 선와 영역에서 발생했음을 보여주었습니다. 출아(王性)는 세포 이동, 증식 및 파네스 세포 분화와 결합되었다.
