5, 000 명의 젊은 성인 Caenorhabditis Elegans 벌레로부터 염색질 가교 결합 및 핵 수집 후 첫날에, 450 마이크로 리터의 깨끗한 물에 재현 된 핵 펠릿을 깨끗한 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 60 마이크로 리터의 10X DPN2 제한 효소 완충액을 넣고 잘 섞는다. 섭씨 37도에서 15 마이크로 리터의 10 % 도데 실 황산나트륨으로 샘플을 교반하면서 1 시간 동안 배양합니다.
75 마이크로 리터의 20 % 트리톤 X 100을 첨가하고 이전에 입증 된대로 배양하여 반응을 소멸시킵니다. 소화되지 않은 대조군으로 샘플에서 10마이크로리터를 분취하여 섭씨 4도에서 보관합니다. 나머지 샘플에 400 단위의 DPN 2를 첨가 한 후, 염색질 소화를 위해 교반하면서 섭씨 37도에서 밤새 배양한다.
둘째 날에 DPN 2 200단위를 샘플에 추가합니다. 가교 결합 된 샘플의 소화를 완료하려면 섭씨 37도에서 4 시간 동안 교반하면서 배양하십시오. 열을 가하여 샘플을 섭씨 65도에서 20분 동안 배양하여 제한 효소를 비활성화합니다.
효소가 열에 의해 비활성화 될 수 없다면, 10 % 나트륨 도데 실 설페이트 80 마이크로 리터를 첨가하고 배양한다. 그런 다음 375마이크로리터의 20% Triton X 100을 샘플에 추가하고 소용돌이치며 혼합합니다. 소화 조절을 위해 샘플에서 10마이크로리터 분취량을 따로 보관하십시오.
염색질 결찰의 경우 샘플을 깨끗한 50밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 분자 등급의 물로 샘플 부피를 5.7 밀리리터로 조정하고 소용돌이 치면서 혼합합니다. 이어서, 700 마이크로리터의 10 X T4 리가제 완충액, 이어서 60 유닛의 T4 DNA 리가아제를 첨가하고, 샘플을 섭씨 16도에서 밤새 배양한다.
3일째에는 단백질 분해 및 역가교를 진행합니다. 3C 샘플에 밀리리터당 10밀리그램의 프로테이나제 K 30마이크로리터를 첨가하고 교반하면서 섭씨 65도에서 밤새 배양합니다. 4일째에 3C 라이브러리의 정제를 시작하려면, 밀리리터당 10밀리그램의 RNase A 30마이크로리터를 샘플에 첨가하고 소용돌이에 의해 혼합한다.
배양 후, 7 밀리리터의 페닐 클로로포름을 샘플에 첨가하고 흔들어서 혼합한다. 샘플을 3, 270 G 및 실온에서 15분 동안 원심분리한다. 수성상을 수집하여 깨끗한 50밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
같은 부피의 클로로포름을 첨가하고 흔들어서 샘플을 혼합합니다. 예시된 바와 같이 샘플을 다시 원심분리한 후, 수성상을 다른 깨끗한 50 밀리리터 원뿔형 튜브로 옮긴다. 분자 등급의 물 7.5 밀리리터, 100 % 에탄올 35 밀리리터 및 글리코겐 밀리리터 당 1 밀리그램 7 마이크로 리터를 첨가하십시오.
적절하게 혼합된 샘플을 섭씨 영하 80도에서 동결합니다. 샘플이 얼어붙는 동안 분자 등급의 물을 사용하여 대조군의 부피를 500마이크로리터로 조정하여 대조군 샘플을 정제하기 시작합니다. 밀리리터 RNase A당 10밀리그램의 2마이크로리터를 추가하고 튜브를 튕겨 혼합합니다.
다음으로, 1 밀리리터의 페닐 클로로포름을 대조군이 들어있는 튜브에 넣고 흔들어서 혼합합니다. 튜브를 원심분리합니다. 수성상을 깨끗한 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브로 옮긴 후 동일한 부피의 클로로포름을 첨가하십시오.
수성상을 수집하기 전에 이전에 입증된 바와 같이 원심분리한다. 수집 된 수성 상에 1 밀리리터의 에탄올과 2 밀리리터의 글리코겐 당 1 밀리그램의 2 마이크로 리터를 첨가한다. 시료를 진탕하여 혼합한 후 섭씨 영하 80도에서 30분 동안 배양한다.
다음으로, 샘플을 섭씨 4도에서 3, 270 G에서 15분 동안 원심분리한다. 상청액을 제거한 후 750 마이크로 리터의 냉각 된 70 % 에탄올과 원심 분리기를 첨가하십시오. 공기 건조 펠릿을 50 마이크로 리터의 분자 등급 물에 다시 현탁하십시오.
즉시 더 이상 진행하지 않으면 여기에서 정지를 동결할 수 있습니다. 3C 샘플 정제를 계속하기 위해, 냉동고로부터 샘플을 꺼내고 3, 270 G에서 30분 동안 원심분리한다. 식힌 70 % 에탄올 10 밀리리터를 넣고 DNA 펠릿을 분해합니다.
원심분리 및 상층액을 제거한 후, 샘플을 실온에서 부분적으로 자연 건조시킨다. 펠릿을 pH 7.5에서 10 밀리몰 트리스 HCL의 150 마이크로리터에 재현탁시켜 위아래로 피펫팅하여 정제된 3C 라이브러리를 얻었다. 하나의 실험 및 두 개의 대조군 3C 샘플에 대해 수행된 QPCR은 소화 효율 데이터를 생성하는 데 도움이 되었습니다.
3C 샘플은 테스트된 7개의 게놈 유전자좌에서 약 88%의 소화 효율을 보였습니다.
