Capture Hi-C를 사용하면 메가베이스 크기의 게놈 관심 영역의 3D 염색질 조직을 고해상도로 해독할 수 있습니다. Capture Hi-C를 사용하면 더 높은 해상도와 대립 유전자 특이성을 달성하는 동시에 기술의 시간 효율성과 경제성을 향상시킬 수 있습니다. 건강 및 병리학적 조건에서 다양한 모델 시스템, 세포 유형 및 발달적으로 조절되는 염색질 환경에 Capture IC를 적용하면 게놈 토폴로지와 유전자 조절 간의 상호 작용에 대한 이해를 용이하게 할 수 있습니다.
시작하려면 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 계수를 위해 특별히 준비된 대조군에서 트립토나이즈 및 세포 계수합니다. 생존 가능한 세포의 백분율을 결정하기 위해 생존력 염색을 포함합니다. 이 세포 수로부터, 가교결합을 위해 준비된 플레이트의 총 세포 수를 추정한다.
가교를 위해 준비된 플레이트로부터 배양액을 제거하고, 이를 고정 용액으로 교체한다. 셰이커에서 부드럽게 혼합하여 실온에서 10분 동안 고정합니다. 2.5 몰 글리신 PBS를 0.125 몰의 최종 농도에 첨가하여 고정된 반응을 소멸시킨다.
10 센티미터 플레이트에서 10 밀리리터에 2.5 몰 글리신 PBS 530 마이크로 리터를 첨가한다. 실온에서 5 분 동안 배양하고 셰이커에서 부드럽게 혼합합니다. 접시를 얼음으로 옮기고 셰이커에서 부드럽게 혼합하면서 얼음에서 추가로 15분 동안 배양합니다.
빠른 취급을 위해 고정 용액을 비커에 부어 세포에서 제거합니다. 10 센티미터 플레이트를 5 밀리리터의 차가운 0.125 몰 글리신 PBS로 빠르게 두 번 헹구어 파편과 죽은 세포를 씻어냅니다. 빠른 취급을 위해 비커에 액체를 부어 접시에서 액체를 제거합니다.
차가운 0.125 몰 글리신 PBS 5 밀리리터를 10 센티미터 플레이트에 첨가한다. 그리고 플라스틱 셀 스크레이퍼를 사용하여 플레이트에서 셀을 빠르게 긁어냅니다. 혈청학적 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 예냉된 50밀리리터 원추형 원심분리 튜브로 옮깁니다.
5밀리리터의 차가운 0.125몰 글리신 PBS로 플레이트를 2회 헹구고 세포 현탁액을 원추형 원심분리기 튜브에 첨가한다. 섭씨 4도에서 10분 동안 480G에서 회전합니다. 탁상형 흡인 시스템으로 흡인하여 상층액을 제거합니다.
세포를 재현탁하고 세포 현탁액의 500 마이크로리터를 계산된 수의 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리 튜브에 분취한다. 섭씨 4도에서 10분 동안 480배 G로 회전하고 건전지 펠릿을 섭씨 80도에서 보관합니다. 세포 용해를 위해, 얼어 붙은 펠릿을 얼음 위에서 해동하십시오.
물에 1.5 밀리리터의 용해 완충액을 준비하십시오. 600마이크로리터의 저온 용해 완충액을 넣고 얼음에 잘 재현탁합니다. 섭씨 4도에서 5분 동안 2, 655G에서 회전하고 탁상용 흡인 시스템을 사용하여 상층액을 제거합니다.
100 % SDS의 0.5 마이크로 리터에서 다시 일시 중단하십시오. 섭씨 62도에서 1400RPM으로 10분 동안 소용돌이치며 배양한 후 물 290마이크로리터와 10%트리톤 X 100 50마이크로리터를 넣고 기포를 피하면서 잘 섞는다. 섭씨 37도에서 1400RPM으로 10분 동안 소용돌이치면서 배양한 후 50마이크로리터의 10 X DPN 튜브 버퍼를 추가하고 튜브를 뒤집어 혼합합니다.
품질 관리를 위해 소화되지 않은 DNA 50마이크로리터를 별도의 튜브에 넣습니다. 소화되지 않은 대조군 샘플을 섭취하는 것을 잊지 마십시오. DPN2 소화를 위해 10마이크로리터의 DPN2 고농도를 추가하고 뒤집어서 혼합합니다.
샘플과 소화되지 않은 대조군을 섭씨 37도의 열 혼합기에서 배양하고 4시간 이상 동안 분당 1400회 회전합니다. 결찰 및 가교 역전을 위해 별도의 튜브에서 품질 관리를 위해 결찰된 소화된 DNA 50마이크로리터를 채취합니다. 소화되지 않고 결찰되지 않은 대조군은 섭씨 20도에서 보관하십시오.
800 마이크로 리터의 결찰 칵테일을 추가하십시오. 섭씨 16도에서 배양하여 밤새 분당 1000 회전으로 소용돌이 치십시오. DNA 정제를 위해 얼음 위의 샘플을 15밀리리터 원추형 원심분리기 튜브로 옮기고 물 2밀리리터, 얼음처럼 차가운 에탄올 10.5밀리리터, 3몰 아세트산나트륨 583마이크로리터를 추가합니다.
얼음처럼 차가운 에탄올 200 마이크로 리터, 아세트산 나트륨 10.8 마이크로 리터 및 공동 침전제 1 마이크로 리터를 소화되지 않은 결찰 된 품질 관리에 첨가하십시오. 섭씨 영하 80도에서 최소 4시간에서 최대 하룻밤 동안 배양합니다. 섭씨 4도에서 2200G의 15밀리리터 튜브를 45분 동안 돌립니다.
조심스럽게 에탄올을 제거하고 샘플을 공기 건조시키고 실온에서 10-15 분 동안 대조군을 건조시킵니다. 과도하게 건조하지 마십시오. 샘플과 대조군을 각각 100마이크로리터와 20마이크로리터의 물에 재현탁합니다.
3C 템플릿 준비의 품질 관리를 위해 각 샘플 및 각 대조군의 100-200 나노그램을 1% agros 1XTBE 젤에 로드합니다. 그런 다음 pared end multiplex 시퀀싱을 위한 표적 농축을 수행하기 위해 4마이크로그램의 3C 템플릿을 취하여 각 포획 반응에 대해 130마이크로리터의 물에 재현탁합니다. 샘플을 초음파 처리하고 전단 된 DNA 3 마이크로 그램으로 준비를 계속하십시오.
제조된 DNA 샘플을 표적 특이적 RNA 프로브에 혼성화하기 위해, 3.4 마이크로리터의 최종 부피에 750 나노그램의 DNA 샘플을 사용하여, 마이크로리터당 221 나노그램의 초기 농도를 생성한다. 3.4마이크로리터의 최종 부피를 달성하기 위해 필요한 경우 속도 진공 농축을 사용하십시오. 10 마이크로 리터에 재현 된 샘플의 경우 15-20 분 동안 농축하면 충분합니다.
제조자의 지시에 따라, 섭씨 105도에서 가열된 뚜껑을 가지고 섭씨 65도에서 16 내지 18시간 동안 혼성화 혼합물을 배양한다. 표적 결찰 단편을 포획하기 위해, 결합된 비드에 스트렙티바이드를 프로브 혼성화된 샘플에 첨가하십시오. 마지막으로, 다중 시퀀싱을 위한 샘플을 준비하기 위해 쌍 및 다중 시퀀싱을 위해 이 연구에서 사용된 표적 농축 시스템에 따라 프로토콜을 계속합니다.
Capture Hi-C 상호작용 맵의 해상도를 통해 Tsix 유전자좌의 프로모터를 포함하는 Tsix-tad에서 두 개의 더 작은 도메인을 식별할 수 있습니다. 이것은 이전에 5C에서 달성되지 않았습니다. 또한, 접촉 루프와 같은 다른 서브 태드 구조는 이전에 Capture C로 식별된 Xist와 FTX 간의 루프 및 Capture Hi-C에 대해 유사한 프로토콜을 사용하여 최근에 식별된 Xist와 Xert 사이의 루프와 같은 Capture Hi-C 데이터에서 명확하게 볼 수 있습니다.
다른 접촉은 또한 캡처 Hi-C 프로파일의 증가된 해상도로 인해 더 정확하게 매핑될 수 있으며, 예를 들어 Linx, Chic1 및 Xite 유전자좌 사이의 Tsix-tad 내에서 알려진 접촉 핫스팟을 형성하는 것과 같은 프로파일. 표시된 Hi-C 데이터와 비교하여 Capture Hi-C는 해상도를 4배 증가시킬 수 있었지만 시퀀싱 깊이의 1/4만 필요했습니다. 3C 템플릿 준비의 품질 관리로 50마이크로리터의 소화되지 않고 결찰되지 않은 DNA 샘플을 섭취하는 것을 잊지 않는 것이 매우 중요합니다.
