DATP-Tailing, Adapter Ligation, and PCR Amplification of Scarce Cell DNA

시작하려면 희소 한 세포의 DNA 조각을 비오틴으로 채취하십시오. dATP 테일링용 시약을 첨가하여 마스터 믹스를 준비하고 섭씨 37도에서 30분 동안 샘플을 배양합니다. 그런 다음 샘플을 섭씨 65도에서 10분 동안 배양하고 얼음 위에서 냉각하여 Klenow exo-minus를 비활성화합니다.

비드를 각각 300 마이크로리터의 TB, NTB 및 100 마이크로리터의 결찰 완충액으로 세척한 후, 50 마이크로리터의 결찰 완충액에 재현탁시킨다. 4 마이크로리터의 15 마이크로몰 프리-어닐링된 어댑터 믹스 및 1 마이크로리터 T4 DNA 리가아제당 2000 유닛의 1 마이크로리터를 샘플에 첨가한다. 400 마이크로리터의 TB, 200 마이크로리터의 NTB 및 100 마이크로리터의 제한 완충액 2로 비드를 세척한다.

PCR로 라이브러리를 증폭한 후 동일한 샘플에서 50마이크로리터 반응을 모두 1.5밀리리터 DNA 저결합 튜브에 풀링합니다. 튜브 자석에 놓고 모든 구슬이 벽에 붙을 때까지 기다리십시오. 라이브러리가 들어 있는 상청액을 새로운 1.5밀리리터 DNA 저결합 튜브로 옮기고 TLE 완충액을 500마이크로리터까지 보충합니다.

상자성 비드 정제를 사용하여 양면 선택을 수행하려면 200마이크로리터의 스톡 비드를 라이브러리에 추가하고 볼텍싱으로 혼합한 다음 실온에서 회전하면서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 라이브러리를 자석 위에 놓고 모든 구슬이 벽에 붙을 때까지 기다립니다. 라이브러리를 포함하는 상청액을 새로운 1.5 밀리리터 DNA 저 결합 튜브로 옮깁니다.

750 마이크로 리터의 스톡 비드를 가져 와서 자석의 1.5 밀리리터 튜브에 넣어 비드를 농축합니다. 모든 비드가 벽에 달라붙으면 상층액을 제거하고 300마이크로리터의 새 스톡 비드를 소용돌이쳐 비드를 다시 현탁합니다. 300마이크로리터의 농축 비드를 샘플에 추가합니다.

소용돌이로 혼합하고 실온에서 회전하면서 10 분 동안 배양합니다. 자석 위에 놓습니다. 모든 구슬이 벽에 달라 붙을 때까지 기다렸다가 상청액을 제거하십시오.

70 % 에탄올 1 밀리리터를 튜브에 첨가하여 구슬을 자석에 올려 놓으십시오. 비드를 공기 중에서 건조시키고 볼텍싱을 통해 21마이크로리터의 TLE 버퍼에 다시 현탁합니다. 비드에서 라이브러리를 용리하려면 Thermoblock에서 섭씨 37도에서 10분 동안 샘플을 배양합니다.

튜브를 자석에 넣고 라이브러리가 들어 있는 상층액을 새로운 1.5밀리리터 DNA 저결합 튜브로 옮깁니다.