이 실험 방법은 후성유전체 테스트를 위해 재사용 가능한 단일 세포의 장기 보관을 허용합니다. 또한 동일한 단일 세포에서 많은 후성유전학적 표지와 전사 인자를 분석할 수 있습니다. 단세포 후성유전체 분석을 위한 현재의 방법에서는 동일한 단일 세포를 재분석할 수 없습니다.
그러나 재사용 가능한 단일 셀을 사용하면 동일한 단일 셀을 여러 번 재분석할 수 있습니다. 이 기술은 특히 환자 세포의 수가 제한되어 있는 경우 후성유전학적 치료의 진단 및 설계에 유용합니다. 이 방법은 후성유전체 연구, 유전자 발현 조절 및 후성유전학적 표지에 대한 특정 항체를 사용할 수 있는 한 기타 시스템에 가장 적합합니다.
이 기법을 처음 시도할 때는 너무 귀중하지 않은 샘플에 대해 연습하고 MiSeq 또는 iSeq 100과 같은 얕은 시퀀싱을 사용하여 실험의 유효성을 검사하는 것이 좋습니다. 시작하려면 깨끗한 층류 후드에서 1 밀리리터의 세포 현탁액과 199 밀리리터의 1 밀리몰 EDTA PBS를 혼합하여 DNA 용 인터 칼레이터 염료를 함유합니다. 혼합 후, 200 마이크로리터의 세포 현탁액을 평평한 바닥 96-웰 플레이트의 각 웰로 옮긴다.
덮개를 96웰 플레이트에 놓고 주사 현미경을 사용하여 플레이트를 스캔합니다. 다음으로, 플레이트를 기울이고 단일 셀이 우물의 아래쪽 가장자리로 가라 앉을 때까지 몇 분 동안 기다리십시오. 그런 다음 피펫 팁을 하단 모서리에 놓고 단일 세포와 완충액을 PCR 튜브에 옮깁니다.
형광현미경을 이용하여 웰을 확인하여 전사를 확인하였다. 단일 세포가 여전히 웰에 있는 경우, DNA에 대한 삽입기 염료를 함유하는 1밀리몰 EDTA PBS를 웰당 200마이크로리터 첨가하고 전달을 반복한다. 이송 후 96-웰 PCR 플레이트에 커버를 놓고 스윙 로터를 이용하여 플레이트를 끊김 없이 원심분리한다.
원심분리 후 자동 액체 처리 로봇의 데크에 플레이트를 놓습니다. 그런 다음 보충 코드 1을 액체 처리 로봇의 소프트웨어 창으로 끌어다 놓고 프로그램을 실행하여 매우 느린 피펫팅 속도로 195마이크로리터의 상층액을 제거합니다. 50 마이크로 리터의 4 % TEMED 또는 미네랄 오일을 넣고 실온에서 밤새 플레이트를 배양합니다.
다음날, 피펫팅에 의해 미네랄 오일을 제거하고, 200 마이크로리터의 TP 마그네슘 음성 완충액으로 세포를 5회 세척한다. 마지막 세척 후, 상청액을 제거하고, 15 마이크로리터의 어닐링 완충액을 첨가하고, 1시간 동안 얼음 위에서 배양한다. 배양 후 PCR 튜브를 열 순환기에 놓고 섭씨 94도에서 3분 동안 가열합니다.
그런 다음 튜브를 얼음 냉각 금속 블록으로 옮기고 2 분 동안 배양합니다. 다음으로, 4 마이크로 리터의 황산 마그네슘 - 염화나트륨, DNTP를 넣고 최대 속도로 와동하여 혼합합니다. 그런 다음 1마이크로리터의 BST 중합효소 큰 조각을 추가하고 볼텍싱으로 혼합한 다음 셰이커에서 4시간 동안 배양합니다.
배양 후 PCR 튜브를 열 순환기에 놓고 텍스트에 설명된 대로 4시간 또는 야간 프로그램을 실행합니다. 항체 결합을 위해 1.625 마이크로 리터의 염화나트륨 EDTA BSA 용액을 튜브에 첨가하십시오. 저속으로 소용돌이 치면서 혼합하고 튜브를 얼음 위에서 1 시간 동안 배양합니다.
그런 다음 밀리리터당 0.1 마이크로 그램의 항체를 추가하고 항체 프로브와 결합 된 IgG를 조절하십시오. 항체를 추가한 후 부드럽게 흔들면서 얼음 위에서 튜브를 배양합니다. 다음날, 얼음 위에서 200 마이크로리터의 TPM-T 완충액으로 세포를 2회 세척한다.
그런 다음 상층액을 제거하고 T4 DNA 리가제 완충액으로 한 번 세척합니다. 다음으로, 19 마이크로 리터의 결찰 어댑터 용액을 첨가하고 섭씨 25도에서 1 시간 동안 배양한다. 그런 다음 1마이크로리터 T4 DNA 리가아제를 추가하고 중간 속도로 볼텍싱하여 튜브를 혼합합니다.
열 순환기에 튜브를 놓고 근접 결찰 프로그램을 실행합니다. 실행 후 200 마이크로리터의 BST 마그네슘 음성 EDTA 양성 완충액으로 세포를 두 번 세척하고 섭씨 4도에서 밤새 세포를 보관합니다. 다음날, 200 마이크로리터의 BST 마그네슘 음성 EDTA 음성 완충액으로 세포를 2회 세척하고, BST, DNTPs 및 황산마그네슘을 함유하는 혼합물 20 마이크로리터를 첨가한다.
그런 다음 소용돌이 믹서와 혼합하고 궤도 셰이커에서 4 시간 동안 튜브를 배양합니다. 배양 후 튜브를 열 순환기에 놓고 텍스트 원고에 설명된 대로 전체 확장 프로그램을 실행합니다. 다음으로, 다중 변위 증폭을 위해, 0.4 마이크로리터의 100 마이크로몰 제 2 무작위 프라이머를 첨가하고, 와류에 의해 혼합한다.
그런 다음 튜브를 오비탈 셰이커에서 2시간 동안 배양한 후 튜브를 섭씨 94도에서 가열하기 위해 열 순환기에 놓습니다. 3분 후, 튜브를 얼음으로 냉각된 금속 블록에 넣고 1마이크로리터의 BST DNA 중합효소를 추가합니다. 튜브를 느린 속도로 소용돌이칩니다.
그런 다음 튜브를 열 순환기에 올려 다중 변위 증폭 프로그램을 실행합니다. 프로그램 후 약 20 마이크로 리터의 상청액을 PCR 튜브에 옮기고 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 다음으로, 재사용 가능한 단일 세포를 함유하는 PCR 튜브에 0.05% TWEEN 20 및 0.1X TE 완충액 20마이크로리터를 첨가하고, 튜브를 섭씨 4도에서 밤새 배양한다.
다음날 상청액을 수집하여 이전에 수집 한 상청액과 결합합니다. 그런 다음 50% 글리세롤, 5밀리몰 EDTA, 0.5% BSA 및 0.05% TWEEN 20을 포함하는 재사용 가능한 단일 세포 및 TBS 완충액을 담근 다음 오비탈 셰이커에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후 재사용 가능한 단일 세포를 추가로 사용할 때까지 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오.
마지막으로 40마이크로리터의 엑소 네거티브 마스터 믹스를 추가하고 튜브를 열 순환기에 올려 텍스트 원고에 설명된 대로 프로그램을 실행합니다. K562 재사용 가능한 단일 세포는 이 프로토콜을 사용하여 생성되었습니다. 단일 세포를 폴리아크릴아미드 비드의 외층에 포매하고 DNA 염색을 위해 인터칼레이터 염료를 사용하여 시각화했습니다.
BciVI 소화 전후의 DNA 산물이 여기에 표시됩니다. 소화된 제한효소는 19 내지 20, 31 내지 32, 49, 및 49 초과의 염기쌍 단편을 예상하였다. 또한, 구축된 DNA 라이브러리를 목적 생성물에 대해 모세관 전기영동에 의해 분석하였다.
시퀀싱 결과는 항히스톤 H3 아세틸화 라이신 27 및 항히스톤 H3 트리메틸화 라이신 27의 고유한 매핑된 판독값이 대조군 IgG보다 훨씬 더 많다는 것을 나타냅니다. REpi 시퀀싱 신호는 REpi 시퀀싱 데이터를 벌크 ChIP 시퀀싱 데이터와 비교하여 평가되었습니다. 평균적으로 REpi 시퀀싱에서 히스톤 H3 아세틸화 라이신 27 신호의 약 91%가 벌크 ChIP 시퀀싱에서 히스톤 H-3 아세틸화 라이신 27 피크와 겹쳤습니다.
비활성 히스톤 마크인 히스톤 H3 트리메틸화 라이신 27에 대한 REpi 시퀀싱의 정밀도는 52%였으며 REpi 시퀀싱의 민감도는 REpi 시퀀싱 재생 판독에 의해 얼마나 많은 벌크 ChIP 시퀀싱의 피크가 검출되었는지 측정하기 위해 분석되었습니다. REpi 시퀀싱의 민감도는 히스톤 H3 아세틸화 라이신 27에서 55.30%, 히스톤 H3 트리메틸화 라이신 27에서 50.94%였습니다. DNS가 없는 시약을 사용해야 합니다.
또한 개방 튜브 리드 또는 시약 리드와 관련된 모든 작업은 깨끗한 후드에서 수행해야 합니다. 이 절차의 DNA 산물은 시퀀싱된 다음 게놈에 매핑되어 단일 세포에서 게놈의 어느 영역에 어떤 히스톤 변형이 존재하는지 나타냅니다. 이 기술을 통해 동일한 단일 세포에서 여러 후성유전학적 마크를 분석할 수 있었고 모든 단일 세포에서 다중오믹스 분석을 위한 길을 열었습니다.
