희생된 임신한 쥐를 해부 판에 등에 올려놓는 것으로 시작합니다. 집게를 사용하여 복부 정중선을 꼬집습니다. 날카로운 가위로 생식기에서 정중선 위의 흉곽까지 피부와 복막을 통해 복부를 자릅니다.
배아가 들어있는 자궁을 제거하고 즉시 얼음 위에 놓습니다. 태반 쪽의 난황낭을 조심스럽게 자르고 배아를 제거하십시오. 그런 다음 목이 잘린 배아 머리를 칼슘과 마그네슘 결핍 HBSS가 들어 있는 얼음 접시에 넣습니다.
왼쪽을 향한 35mm 접시에 머리를 놓습니다. 집게의 가장자리로 한쪽 눈을 뚫고 다른 쪽 턱을 단단히 잡습니다. 목덜미에서 정중선을 따라 주둥이를 향해 두피 피부를 부드럽게 찢습니다.
각진 집게를 사용하여 흰색 타원형 척수를 통해 들어가 정중선을 따라 두개골을 부수어 뇌를 노출시킵니다. 두개골을 측면에서 부드럽게 떼어냅니다. 그런 다음 두개골에서 뇌를 들어 올려 두개골을 폐기하십시오.
집게를 사용하여 수막을 제거하십시오. 2 밀리리터의 칼슘과 마그네슘 결핍 HBSS가 들어있는 비쥬에 뇌를 놓습니다. 비쥬에 250마이크로리터의 10X 트립신을 추가합니다.
비쥬를 흔들어 뇌를 분쇄한 다음 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다. 다음으로, 각 비쥬에 2 밀리리터의 대두 트립신 억제제를 첨가하십시오. 억제제가 고르게 분산되도록 흔들어줍니다.
원심분리하지 않고 각 비쥬에서 상층액 2ml를 15밀리리터 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 5밀리리터 주사기에 부착된 19게이지 바늘을 사용하여 현탁액을 두 번 흡인하여 비쥬의 나머지 세포를 분쇄합니다. 21게이지 바늘로 흡인을 두 번 반복합니다.
23G 바늘을 사용하여 비쥬에서 세포 상청액이 들어 있는 15밀리리터 원심분리 튜브로 옮기고 실온에서 5분 동안 200G에서 원심분리합니다. 5mm 혈청학적 피펫을 사용하여 펠릿을 방해하지 않고 모든 상층액을 새로운 15mm 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 원심 분리를 반복하십시오.
두 원심분리 단계에서 결합된 펠릿이 들어 있는 튜브에 10밀리리터의 도금 매체를 추가하고 잘 혼합하여 전체 현탁액을 만듭니다. 트리판 블루로 세포를 염색하고 혈구계 또는 세포 계수기를 사용하여 계산합니다. 쥐 E17 배아 뇌 세포 현탁액의 필요한 부피를 웰 플레이트에 첨가하여 세포를 플레이트합니다.
섭씨 37도에서 5-7 %의 이산화탄소 하에서 2-4 시간 동안 세포를 배양하십시오. 배지를 제거한 후 각 웰에 새 분화 배지를 추가합니다. 멸균 피펫 팁을 사용하여 플로팅 커버 슬립을 누릅니다.
상청액의 일부를 제거하고 매주 세 번 새로운 분화 배지로 교체하여 배양을 유지합니다. 배양은 발달 마커로서 NG2 및 네스틴, 뉴런 마커로서 SMI31, MBP 및 NeuN, 신경교 마커로서 CNP, GFAP 및 Iba1에 대한 면역형광 염색에 의해 시각화되었다. 감염된 세포에 대한 qRT-PCR 조사는 인터페론 베타로 처리된 배양물에서 화학주성 사이토카인 Ccl5 mRNA의 상향 조절을 입증했습니다.
ELISA 연구는 상청액에서 Ccl5가 증가하여 mRNA와 단백질 발현 사이의 상관 관계를 나타냅니다. 단일 세포 현탁액에 대한 유세포 분석 연구는 세포의 70%가 생존 가능한 것으로 나타났습니다. 많은 수의 미세아교세포, 뉴런 및 성상교세포가 존재했지만 희소돌기아교세포는 가장 풍부하지 않았습니다.
