Hepatocellular Carcinoma Organoid Culture and Digestion to Study Liver Cancer Pathogenesis

오가노이드 도금을 수행하려면 먼저 원심분리기에서 상층액을 제거하고 세척된 간세포 암종 세포를 제거합니다. 도금을 위해 웰당 50마이크로리터의 기저막 추출물 또는 BME에 세포를 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 고급 DMEM/F12에서 셀을 일시 중단합니다.

그런 다음 균일한 현탁액이 보일 때까지 세포 응집체를 부드럽게 피펫팅합니다. 현탁액에 BME를 추가하여 BME 농도가 30%에서 50% 사이가 되도록 합니다.이제 50웰 플레이트 중앙에 셀 클러스터가 있는 24마이크로리터의 BME 방울을 시드합니다. 물방울이 섭씨 37도에서 20분 동안 굳도록 합니다.

각 웰에 500마이크로리터의 예열된 배지를 추가하고 섭씨 37도의 세포 인큐베이터에서 배양합니다. 2-3일마다 배양 배지를 새로 고칩니다. 2주 후 분리 배지를 오가노이드 확장 배지로 교체합니다.

7-10일 배양 후 오가노이드가 적절한 밀도에 도달하면 필요에 따라 배양액을 처리합니다. 오가노이드를 통과시키려면 먼저 인큐베이터에서 초저 부착 표면 세포 배양 플레이트를 예열합니다. 다음으로, 냉동 BME를 사용 직전까지 섭씨 4도에서 밤새 해동합니다.

오가노이드 수확 용액과 트립신 대체품을 섭씨 37도에서 30분 동안 예열합니다. 준비 단계 후 오가노이드 배양 플레이트에서 배양 배지를 제거합니다. 그런 다음 오가노이드 현탁액을 15밀리리터 튜브로 옮깁니다.

이제 BME의 양에 비례하여 오가노이드 수확 용액을 추가합니다. 서스펜션을 혼합하려면 1000마이크로리터 피펫 건을 사용하여 위아래로 긁고 피펫팅합니다. 튜브를 실온에서 30분 동안 배양한 후 1밀리리터 피펫을 사용하여 BME를 조심스럽게 흡입합니다.

BME가 완전히 디졸브되었는지 확인합니다. 명확한 오가노이드 세포 클러스터가 보일 때까지 10분마다 추출물을 모니터링합니다. 그런 다음 실온, 400g에서 5분 동안 원심분리합니다.

가능한 한 많은 상층액을 제거하십시오. 간세포 암 오가노이드의 효소 분해를 시작하려면 배양된 오가노이드 펠릿에 1-5mL의 예열된 트립신 대체품을 추가합니다. 현탁액을 섭씨 37도에서 2분 동안 배양합니다.

현미경을 사용하여 오가노이드가 2개에서 10개의 세포로 구성된 작은 클러스터로 분리되는지 확인합니다. 소화를 멈추려면 적절한 양의 차가운 기초 배지를 추가하십시오. 그런 다음 오가노이드를 섭씨 8도에서 5분 동안 400g으로 원심분리합니다.

가능한 한 많은 상층액을 조심스럽게 제거하십시오. 도금을 위해 적절한 매트릭스에 원하는 수의 오가노이드를 다시 현탁시킵니다. 10일마다 오가노이드 성장의 밀도에 따라 오가노이드를 통과합니다.

HCC 오가노이드 스페로이드는 배양 후 3일 이내에 관찰되었습니다. 둥근 가장자리와 투과성 세포질을 가진 조밀한 스페로이드는 설립 첫날에 관찰되었습니다. 오가노이드는 크기가 비슷했으며 30-50% BME에서 배양했을 때 직경이 가장 컸습니다.

BME는 10%로 가장 단편화되어 가장 작은 오가노이드를 생성했습니다. BME는 100%에서 가장 온전했지만 중간 직경의 오가노이드가 생성되었습니다. 증식하는 간세포암 오가노이드는 3세대 후 각 배양에서 500마이크로미터를 초과하는 크기에 도달했습니다.

실질적으로 크기가 1000마이크로미터보다 높은 HCC 오가노이드를 20일 배양 기간 내에 수득하였다.