시작하려면 형광 현미경을 설정합니다. 이미징하기 전에 Stage Top 인큐베이터를 섭씨 37도로 예열하고 챔버에서 분당 0.02리터의 가습 이산화탄소를 실행합니다. 그런 다음 감염된 단층이 있는 슬라이드를 인큐베이터 챔버에 넣고 뚜껑을 밀봉합니다.
명시야 조명에서 20X 대물렌즈를 사용하여 단층 내 시야의 X 및 Y 좌표를 선택합니다. 이미징 파라미터를 최적화하고 488나노미터의 여기 파장을 사용하여 이미지를 획득합니다. 광독성을 최소화하려면 광원을 50밀리초의 노출 시간으로 50%전력으로 설정하십시오.
포화된 픽셀이 없는지 확인하고 형광 칼슘 센서의 전체 동적 범위를 감지하도록 조정합니다. 이미징 루프를 설정하고 1분 루프에서 선택한 모든 X 및 Y 좌표에서 이미지를 획득하고 이 루프에서 이미지를 지속적으로 획득합니다. 형광 태그가 지정된 바이러스의 경우 10번째 루프마다 적절한 채널에서 이미지를 획득합니다.
비형광 바이러스를 사용하는 경우 이미징 후 아미노 형광 염색을 수행합니다. 먼저 100 마이크로 리터의 포름 알데히드로 단층을 고정합니다. 배양 후 고정액을 제거하고 100 마이크로 리터의 50 밀리몰 염화 암모늄으로 10 분 동안 담금질합니다.
염화 암모늄을 제거한 후 실온에서 1 시간 동안 100 마이크로 리터의 0.1 % Triton X-100으로 단층을 투과시킵니다. 그런 다음 용액을 제거하고 100 마이크로 리터의 차단 용액을 넣고 1 시간 동안 배양합니다. 그런 다음 차단 용액을 제거하고 1X PBS에 속인 100 마이크로 리터의 1 차 항체를 추가합니다.
섭씨 4도에서 밤새 부드럽게 흔들면서 배양합니다. 배양 후 1차 항체를 제거하고 1X PBS로 3회 세척합니다. 마지막으로 1X PBS에서 착각된 100마이크로리터의 형광 접합 2차 항체를 추가합니다.
광표백을 방지하려면 플레이트를 빛으로부터 보호하고 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 배양 후 2차 항체를 제거하고 DAPI 용액으로 검체를 염색합니다. 그런 다음 이미징을 위해 고정 단층을 100마이크로리터의 1X PBS에 배치합니다.
슬라이드를 현미경 s에 다시 놓습니다.tag이자형. 라이브 이미징 실행에서 X 및 Y 좌표를 다시 로드하고 염색에 사용되는 2차 항체에 해당하는 채널의 각 멀티 포인트를 이미징합니다. 라이브 이미징 실행의 이미지를 참조하여 동일한 지점을 캡처할 수 있습니다.
이 기술을 사용하여 이 단층을 채점한 후 hIO 단층에서 로타바이러스 감염을 이미지화했습니다. mRuby와 같은 형광 단백질을 발현하는 로타바이러스의 재조합 균주의 경우 실시간 이미징 중에 감염이 확인되었습니다. 반면 마커를 발현하지 않는 균주를 사용한 경우, 이미징 후 면역형광으로 감염을 검출했습니다.
