1 부. 외과 영역 준비 <ol><li> biohazardous 시약 (예 : retroviral 벡터)와 함께 일하고있다면, 수술은 Biosafety II 캐비닛 (BSC) 안에서 수행되어야합니다. 초음파 후방 산란 현미경 (UBM)는 BSC 안에있는 변환기와 BSC 옆에 앉아 있고, 특별히 고안된 수술 무대에서 모터 제어 지원이 장소에서 개최한다. 동영상에 표시된 무대를 구축하는 데 필요한 구성 요소는 라인에 나열되어 있습니다. 이 목록은 함께 여러 각도 (요청시 제공)에서 무대의 영상과 건설을 허용해야합니다. </li><li> 개복술의 열고 닫는 (복강은 내장에 대한 액세스를 허용하는 열 절단되는 수술)은 일반적으로 플라스틱 뒷면과 흡수 패드에 수행됩니다. 전에 수술에 필요한 도구 (예 : 면도기는, 외과 가위, 집게, 로드된 autoclip applier 등) 및 자료 (예 : PBS, 봉합, 마취, 마우스 홀더 및 overlying 판 등) 소독과에 배치해야합니다 모든 외과 영역입니다. 절개가 열려있는 시간을 제한하는 것은 수술의 성공 가능성을 극대화하는 것이 중요합니다. 모든 동물의 처리는 메가바이트 - 10 솔루션 또는 동등한와 소독되었습니다 장갑과 함께 수행한다. 글러브 멸균 것을 보장하기 위해 필요에 따라 반복 소독을 실시하여야한다. </li></ol> 2 부. 마우스 아나스타샤 <ol><li> 한 부분 Nembutal (50 MG / ML pentobarbital) PBS에서 25 MG / ML 마그네슘 황산을 살균 필터 4 부품을 포함하고있는 마취 솔루션으로 1 CC의 주사기를 채우십시오. 이것은 10 MG / MG / ML 마그네슘 황산 pentobarbital 20 ML있는 솔루션에 발생합니다. 각 마우스가 개별적으로 가중치와 bodyweight의 pentobarbital 당 kg의 90 밀리그램을 주사해야합니다 (예, 28 GM 마우스는 250 μL로 주입됩니다.) </li><li> 피부와 복부 근육을 모두 관통 배아 일 (E) 9.5에서 임신 마우스의 복부 (intraperitoneal, IP) (필요에 따라 다른 연령대를 사용할 수 있습니다)에 주입. 마우스에 대한 8~12분이 아닌 응답이 될 수 있습니다. 적절한 마취는 동물의 편안한 자세로 확인하고, 꼬리와 발가락 핀치스에 대한 응답으로 운동 부족합니다. 부드럽게 손가락 사이에 못을 곤란하게하는 것은 매우 민감하고, 그러한 곤란 어떤 응답의 부족은 동물이 충분히 anesthetized을 나타냅니다. 꼬리와 발가락 핀치스 완전히 응답받는 동물은 몇 시간이 초기 수술 절개에 대한 응답으로 약간 떨리는 수도 있습니다. 그러나, 이것은 재귀 응답하고 부적 절한 마취를 나타내는하지 않습니다. 석유 기반 안과 밤은 수술 도중에 건조하지 않도록 마우스의 눈을에 적용해야합니다. </li><li> 마우스가 anesthetized되기 위해 기다리는 동안 수술 영역과 초음파 기계 설정합니다. 레트로 바이러스 또는 lentivirus의 사용이 필요로하기 때문에 같은 바이러스 주사 상기 ​​BSL2 봉쇄는 Biosafety II 내각에서 수행되어야합니다. 또한, 바이러스에 접촉 들어오는 모든 솔루션 및 일회용 재료는 10 % 표백제 솔루션 소독해야합니다. 수술 도구와 초음파 장비 등 메가바이트 - 10 (같은 살균제로 치료해야 <a href="http://www.quiplabs.com/mb10.htm">http://www.quiplabs.com/mb10.htm</a> ) 또는 해당 시설에서 사용 동등한. </li></ol> 부 3. 태아의 노출 <ol><li> 가능하다면 (주어진 동물 시설 및 사용 가능한 공간의 제약에 따라) 그것은 외과 영역에서 별도의 위치에 수술 준비 영역을 가지고 좋습니다. 이것은 동물 사이의 교차 오염 가능성을 최소화합니다. 수술을 시작하려면, 살균 흡착제 표면에의 다시에 동물을 배치하고 70 % 에탄올로 철저하게 복부 영역을 씻으십시오. 더 광범위한 presurgical 치료는 (Betadine의 예, 연속 라운드 및 70 % 에탄올 세척) 고용하지만, 우리의 경험이 쥐 생존 수술의이 유형을 위해 필요하지 않습니다 수 있습니다. 더블 에지 면도날을 사용하여 약 1 인치 와이드 및 1.5 인치 길이의 영역에있는 복부의 머리를 면도. 약 45 ° 각도에서 면도칼로 짧은 빠른 동작을 사용합니다. 이것은 외과 영역이 적절한 치료를하는 것이 중요하지만, 과도한 젖음의 대상이 아니라, 이것이 동물의 불필요한 냉각을 초래할 수있는, 그리고 아마도 심지어는 저체온증. </li><li> 미세 수술 가위를 사용하면 동물 (두 번째 절개 도움이됩니다 결합 조직을 통해 절단 근육으로 피부를 유지)의 복부 근육을 통해 다음 먼저 피부를 통해 1 &quot;세로 절개를합니다. 참고하는 절차를 관리 전반에 걸쳐해야합니다 수술 도구 살균 유지하고, 필요에 따라 툴팁이 아닌 인트와 접촉하는 경우 살균제와 치료 (예을 수행한다고 확신로 이동합니다) 자료를 성나게하다. </li><li> 사용 포셉 신중하게 자궁 뿔을을 그리기, 그리고 양쪽에 배아의 수를 기록합니다. 동물로 다시 자궁 뿔의 대부분이 인접한 노출된 배아 (두 양쪽에 구성에 따라 달라집니다 중 선택), 자리를 떠나있는 동안. 어머니가 그녀의 뒷면에 남아있는 동안,이 맥락에서 두 개의 배아가 주어진 시간에 노출되고 PBS에서 목욕. </li><li> 그것이 수술 (Figure1A) 동안 거기에있을 것이다 플렉시 글라스 홀더로의 뒷면에있는 동물을 플레이스 *. 다음, 녹색 silastic 멤브레인 (L RTV 실리콘 고무베이스를 사용했고,을 통해 약간 위치 포셉 한 쌍의과 함께 아래의 어머니 이상 (사용하기 전에 메가바이트 - 10로 소독한다) 10cm 조직 문화 요리 **을 낮출 에이전트를 치료, 다우 코닝 - 제품 번호는 각각 3,142,761과 2,156,946). 당신은 동물을 통해 번호판을 아래로 내려가서로 주입하는 두 태아의 자궁 조직을 그립에 포셉를 사용하고 부드럽게 세포막을 통해 그들을 가져옵니다. 동시에, 접시가 완전히 홀더에 넣어 져서, 그리고 압정을 제자리에 고정에 적용됩니다. 사전 예열 (37 ° C) PBS가 다음 완전히 배아를 커버하기 위해 요리에 추가됩니다. </li><li> 이번에는 질 벽에 (Figure1B)를 통해 노출된 태아의 실시간 영상을 만들 수있는 초음파 프로브 (Figure1A)에서 동물과 노출된 태아가 들어있는 사출 단계를 놓습니다. 프로브는 다음 직접 몇 군데있을 수있는 배아를 통해 PBS 욕조에 (전동 컨트롤을 사용하여) 저하됩니다. 탐사선이 약 2~3밀리미터 멀리 배아에서 경우 ​​이미지를 얻을 수 있습니다. 그것이 이미지를 수집하기 위해 앞뒤로 진동으로 프로브 헤드가 배아에 충돌하지 않도록하는 것은 매우 중요합니다. </li></ol> * 어머니가 수술 도중에 달려있다 홀더는 쉽게 기계 공장에서 만들 수 있습니다. 그것은 위에 접착이 플렉시 글라스의 측면과 함께 다양한 플렉시 글라스 기지, 그리고 그들 사이에 공백을 (와이드 충분히 마우스에 대한 누워있는 동안 맞게) 포함해야합니다. 양측 다음 검은색 왁스 (절개 트레이에서 예) 사람들로 가득 차 있습니다 그들의 계곡 접지 아웃을해야한다. 그 왁스 압정은 배아가 주사하는 동안 목욕을하는 PBS의 번호판을 잡아 누르면됩니다 어떤에 자료로 제공합니다. : ** 10cm 세균 요리 하단의 중심 (이것은 헤비 듀티 휴대용 펀치와 16분의 13 일 인치 원형 죽어과 함께 할 수있는 밖으로 펀치 구멍 (직경 약 2cm)해야 <a href="http://roperwhitney.com/punching/2-1011.cfm">http://roperwhitney .com/punching/2-1011.cfm</a> ). 또한, 센터 구멍의 양쪽 (거리 약 1.5cm)에 두 개의 작은 구멍은 불꽃 - 온수 바늘 (또는 그들이 당연히 드릴로 만든 수)로 불타게한다. 이 구멍은 다음 진공 그리스 덮여 있으며, 홀더에 접시를 보유하고있는 압정은 검은 왁스로 이겨내는 어디 것입니다. 진공 그리스 밖으로 새어에서 PBS를 방지하는 것입니다. 부 4. Microinjection 니들에 바이러스를 로딩 <ol><li> 1mm (내경)을 beveling하여 패션 microinjection 바늘은 유리가 모세 뽑아. 바늘의 날카로움은 중요하고, 충분 날카로운 바늘로 작업하는 것은 심각하게 이번에는 질 벽에과 amnionic 색의 침투를 손상 수 있으며, 실험 실패로 이어질 수 있습니다. 날카롭게 바늘은 다음 수동 주입 / 탈퇴 펌프 (다른 장치가 로딩과 바늘의 배출을 규제하기 위해 사용하지만, 이것은 무엇입니다 수에 탑재 25 μL microsyringe에 튜브를 통해 연결되어있는 피펫 홀더로 배치됩니다 ) 동영상에 표시됩니다. 최적의 대응 (공기 가득 시스템과 관련된 확장과 압축을 피하기 위해)은 microsyringe, 튜브, 그리고 바늘은 미네랄 오일로 가득해야합니다. </li><li> 이전에 바늘을 로딩하면 주사기에서 시스템에 공기 방울이 바늘 끝에 모든 방법이 없습니다 있는지 확인하십시오. 그런 다음 바이러스를로드 시작하기 전에 바늘에 작은 공기 방울 (1-2밀리미터 길이)를 다시 그립니다. 이 공기 주머니는 바이러스와 광유 사이의 분리를 유지하는 데 도움이됩니다. 주입되는 바이러스성 주가는 0.08 MG / ML의 최종 농도 (바이러스 제작에 대한 자세한 내용은 참고 문헌 1, 2 참조)에서 polybrene을 포함해야합니다. titer 10 배 드롭 - 집중 retroviral 주식은 일반적으로 전염성 물질의 대부분을 포함 미립자 물질의 상당한 금액을 포함하고 그래서 5 않고 필터링 수 없습니다. 또한, 준비에 따라 바이러스 재고가 lysed 포장 세포의 게놈 DNA (특히 MLV / VSV pseudotyped 바이러스를 생성하는 293 세포를 사용하는 경우)에서 점성 수 있습니다. 바이러스의 나누어지는가 점성 경우, DNAse 소량 내가하고 주식을 느슨하게에 추가되어야하거나 바늘이 매우 어려울 것입니다 실었습니다.<html> 바이러스 주식 (8-10 μL)의 비말은 바늘 로딩 준비 parafilm의 살균 조각에 배치해야합니다. 그런 다음, 탈퇴 펌프를 사용하여, 신중하게 나막신을 피하기 위해 바늘을 지불 관심을로드합니다. 배아에있는 바늘 또는 초음파 프로브를 휴식하지 않도록주의하고, 사출 분야에서 micromanipulator 위치에 로드된 바늘을 놓으십시오. 주사가 발생하기 전에 어떤 이유로 바늘이 상당히 로드된 경우는 주사를 시작하기 전에 제대 수있는 팁, 내부에 공기의 작은 금액을 그리는 도움이 될 수 있습니다. 이 공기 주머니는 바늘의 끝 (거의 항상 그로드 바늘 쓸모없는 렌더링합니다 사건)에서 건조 바이러스 주식으로부터 보호할 수 있습니다. </li></ol> 제 5 부. 초음파 가이드 바이러스성 사출 <ol><li> 초음파 프로브 만든 실시간 이미지는 비디오 모니터에 시각이며, 배 (胚)에 microinjection 바늘을 안내하는 데 사용할 수 있습니다. 이 시스템의 바이러스를 사용하는 것은 E8.5에서 amniotic 색으로 주입 또는 E9.5 - E11.5 (Figure1B)에서 amniotic 색 또는 심실 시스템 중 하나가 될 수 있습니다. 이 절차의 가장 어려운 부분이며, (탐정에 따라 50~20시간 순서)에 마스터 경험에 손이 상당히 필요합니다. 바늘 끝이 화면에 가장 밝은 장소로 초음파 이미지에 분명하고, Y 및 Z 비행기의 동력 컨트롤을 사용하여 프로브의 위치의 조정 (에 따라 움직이는 볼 수 있어야하고, X의 수동 제어 비행기). 그것은 프로브의 진동 방향은 바늘의 길이에 평행하는 것이 매우 중요합니다. 이것은 바늘 끝이 배아에 주입을 위해 위치로 동작하는 동안 이미지 비행기에 남아 것을 보장합니다. </li><li> 배아는 대상 지역 (이 경우 forebrain 뇌실)을 쉽게 볼 수 있으며, 사출 경로에 자궁 물질의 최소 금액과 바늘에 액세스할 수 같은 것을 배치해야합니다. 또한, 그것은 태반을 통해 삽입하지 않는 것이 중요합니다. 대상 두뇌 영역이 바늘 발전의 방향 (micromanipulator에있는 노브를 사용하여)와 줄지어되면, 바늘은 질 벽에를 만지고해야하고 짧은 빠른 잽을 앞으로 조직을 침투해야합니다. 유사한 접근 방식은 amnionic 색 후 두뇌에 침투하는 데 사용됩니다. 바늘은 매우 날카로운 특히 경우에는 어떤 경우에는 경험이 풍부한 수사관이 한 운동의 뇌실에 충돌 수 있습니다. 프로브, 바늘, 그리고 수정란을 (무대에서 어머니를 이동하여) 이동의 역학은 연습 실습 마스터해야합니다. </li><li> 배아의 원하는 번호가 주입되면, 5.0 실크 봉합과 복벽을 닫습니다. suturing의 역학은 수술의이 유형에 특정되지 않습니다. 마지막으로, 복부 근육에 바늘을 통해 함께 주요 피부에 수의과 autoclips를 사용합니다. 마우스가 바늘을 씹어 때문에 피부를 Suturing하지 않는 것이 좋습니다. 진통제는 그것이 깨어난다로 마우스에 의해 경험 고통의 양을 줄이기 위해 절개 영역에 적용되어야합니다. 그것은 0.25 %의 Bupivacaine 솔루션 (0.8 ML / kg, 또는 2 MG / kg) 절개 사이트를 함께 subcutaneously마다 몇 mm를 주입하는 것이 좋습니다. </li><li> 마우스가 복구하는 동안 부드럽게 젤 팩 (먹이 및 수화를 촉진하기 위하여)이있는 깨끗한 새장에 흡수 종이에 동물을 믿는다. 37 슬라이드 따뜻한 설정에 케이지를 놓고 ° C 체온을 유지하기 위해. 잠에서 때, 깨끗한 새장에 마우스 젤 팩을 장소와 동물의 걸이로 돌아갑니다. </li><li> 그 다음날은 낙태를 나타내는 모든 것 중에서 어떤 질 출혈, 복부 수축, 및 / 또는 전반적인 고민 모양에 대한 마우스를 확인하십시오. 이 경우, 즉시 마우스를 안락사. 잘 손질이 머리 전체 건강한 모습은 수술의 성공적인 복구를 나타냅니다. 주입 배아는 추가 분석을 위해 embryonically 또는 postnatally 희생하실 수 있습니다. 바이러스가 인간과 같은 알칼리성 인산 가수 분해 효소 (PLAP) 또는 GFP 같은 리포터 유전자를 표현하는 경우, 얼룩이 긍정적인 바이러스성 감염 (Figure1C)의 영역을 공개합니다. </li></ol> 대표 결과 주입 배아는 성인에 이르기까지 1~2일 게시물 주입 모든 방법을 희생하실 수 있습니다. 바이러스가 같은 PLAP 또는 GFP로 리포터 유전자를 표현한다면, 기자의 표현을 그 세포의 virally 감염된 세포 클론을 식별하는 역할을합니다. 예를 들어, 그림 1C에 표시된 것은 retroviral 벡터 표현 PLAP과 E9.5에서 utero에 감염 출생 후의 두뇌의 조직 섹션입니다. 감염된 세포는 histochemical 얼룩 후 보라색 클러스터로 시각입니다. virally 감염된 세포를 식별하는 것 외에도 기자 표현식 하나는 세포 형태와 위치뿐만 아니라 유전자 발현 상태를 조사 수 있습니다. NT &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/2047/2047fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. E9.5 마우스 forebrain의 심실로 바이러스성 주사. A. anesthetized 동물은 사출 단계에 있습니다. 두 개의 배아는 (화살표) 표시된 초음파 프로브 아래에 노출 및 위치 것입니다. 바이러스로 가득 microinjection 바늘은 배아 근처에 위치하고 있으며 초음파 프로브와 줄지어있다. B. 화면 E9.5 마우스 배아에서 실시간으로 초음파 영상을 캡처합니다. V, 뇌실, AS, amniotic 색, UW, 자궁 벽. C.의 태아도 E10.5에서 PLAP - 표현 바이러스에 주입했다. PLAP에 대한 Histochemical 얼룩은 바이러스성 감염 이벤트의 위치를​​ 나타낸다.

<ol>
	<li>Yee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+high-titer+pseudotyped+retroviral+vectors+with+very+broad+host+range.">Generation of high-titer pseudotyped retroviral vectors with very broad host range.</a> Methods Cell Biol. 43, 99-112 (1994).</li><li>Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+rapid+gain-of-function+studies+in+the+mouse+embryonic+nervous+system.">A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system.</a> Nat Neurosci. 2, 812-819 (1999).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

amniotic 색과 심실 시스템을 모두 E9.5 - E11.5에서 주입 수 있지만 초음파 가이드를 사용하여 바이러스 주사는 amniotic 색이 E8.5에서 주입 수 있습니다 E8.5 - E11.5,에서 진행하실 수 있습니다. 제대로 수행되면, 초음파지도를 사용하여 심실 시스템에 주입 바이러스 입자 따라서 forebrain (네크로 텍스, 기저 신경, diencephalon, 눈, 등), midbrain의 다양한 구조를 감염시킬 수 있습니다, 심실 시스템을 내벽 세포에 대한 액세스 권한을 가지고 그리고 hindbrain (Figure1C). amniotic 색에 주입 바이러스는 배아의 외부에있는 세포에 액세스할 수 있습니다. 바이러스 이외에 초음파 안내도 개발 배아에 세포를 주입하는 데 사용할 수 있습니다. 따라서이 기술은 실험을 디자인할 때 (발달 기간, 구조, 바이러스 / 세포)에서 선택할 여러 옵션을 제공합니다. 이것은 주입된 바이러스 또는 세포가 감염 / 주입 세포 쉽게 식별 기자를 표현하는 것은 매우 중요합니다. 역사적으로, 인간 placental 알칼리성 인산 가수 분해 효소 (PLAP) 또는 GFP가 사용되었습니다. 경험에서, 우리는 PLAP histochemical과 immunohistochemical 얼룩 모두 샤프하고 뚜렷한 하나의 세포 하나가 세포 형태와 위치를 분석할 수 있도록하는 얼룩 및 clonal 분석을 수행하기 위해 수익률 때문에 PLAP은 매우 유용한 리포터 유전자 수 있습니다 나타났습니다. 바이러스성 GFP의 표현이 희미 수 있기 때문에, GFP의 기자 조직 염색법 적합하지 않을 수 있습니다,하지만 그 중 하나가 형광 활성 세포 분류 (외과)에 의해 하나의 세포를 얻기 원한다면 유용합니다.

&quot;다음 초음파 후방 산란 현미경 중 하나는 비디오에서 패러다임 - 의료의 P40을 사용했지만, P40 더 이상 상업적으로 사용할 수 없습니다.이 절차에 사용할 수 있으며, 비슷하게 가격 및 수있다 P60에 의해 대체되었습니다 동일한 응용 프로그램에 사용할 수 있습니다. 무대 건축에 대한 설명 추가 자료 패러다임 - 의료 기기 (S)와 함께 사용할 수 있습니다. Vevo 2100 작은 동물 이미징 장비와 함께 제공됩니다. <ol><li> 패러다임 - 의료에서 P60 초음파 BioMicroscope (UBM) ( <a href="http://www.paradigm-medical.com/ubms.html">http://www.paradigm-medical.com/ubms.html</a> ). </li><li> VisualSonics에서 Vevo 2100 ( <a href="http://www.visualsonics.com/">http://www.visualsonics.com/</a> ) </li></ol> 마취 및 진통제 Nembutal 솔루션은 (pentobarbital 50 MG / ML 주사용 나트륨, 애보트 연구소에 의해 만들어진) 불터 Schein 동물 보건에서 구할 수 있습니다. 이 일정 II 제어 물질과 마약 집행 기관 (DEA)을 구하는 라이센스가 필요합니다. Bupivacaine 용액 (0.25 %, 기타 중 Hospira, 부동산에 의해 생산)은 무어 의료를 포함한 유통 업체의 숫자에서 얻을 수 있습니다.

ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at e9.5

마우스에 utero 서바이벌 수술 개발하는 동안 유전자 발현의 분자 조작 수 있습니다. 이번에는 질 벽에 일찍 embryogenesis 동안 불투명이기 때문에 그러나, microinjection에 대한 배아의 특정 부분을 대상으로 능력이 크게 제한됩니다. 다행히도, 고주파 초음파 이미징 관심의 배아 지역에 microinjection 바늘 안내를 실시간으로 사용할 수있는 이미지의 생성을 허용합니다. 여기 우리는 배아 하루 마우스 forebrain의 심실 시스템 (E) 9.5에 r​​etroviral 벡터의 주사를 안내하기 위해 이미지의 사용을 설명합니다. 이 방법은 자궁 뿔에 접근하고, 그들이 몇 군데와 주입하는 동안 호수에서 목욕하는 호스트 배아를 허용 특별히 고안된 접시를 허용하는 개복술을 사용합니다. 성공적인 수술은 종종 대부분 또는 주입된 배아의 모든 관심의 후속 시점 (embryonically 또는 postnatally)에 생존의 결과. 여기에서 설명한 원칙 E8.5 태아의 amnionic 유체 (따라서 아직 해결되지 않은 신경 튜브의 앞쪽에 후부 범위 따라 감염을 허용)에 주사를 수행하기 위해 약간의 수정과 함께 사용할 수있는, 또는의 심실 시스템으로 E10.5/11.5에서 뇌. 또한, 중간 neurogenic 세 (~ E13.5)에서 초음파 영상은 바이러스 감염이나 세포 이식에 대해 특정 뇌 영역에 직접 주사를 사용할 수 있습니다. 마우스에 utero 주사에 가이드 초음파 이미징의 사용은 달리 예외적으로 어려운이 없다면 불가능하다 방식으로 마우스 배아의 분자 및 세포 조작을 허용하는 매우 강력한 기술입니다.

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Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

마우스에 utero 서바이벌 수술 개발하는 동안 유전자 발현의 분자 조작 수 있습니다. 여기 우리는 배아 하루 마우스 뇌 (E) 9.5에 r​​etroviral 벡터의 주사를 안내 고주파 초음파 이미징의 사용을 설명합니다.

마우스 Forebrain에 초음파 유도 Microinjection Utero에서 E9.5에서

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development.  However, because the uterine wall is opaque ...

ultrasound-guided-microinjection-into-mouse-forebrain-utero-at

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

17.8K 조회수.  Johns Hopkins University School of Medicine. 마우스에 utero 서바이벌 수술 개발하는 동안 유전자 발현의 분자 조작 수 있습니다. 여기 우리는 배아 하루 마우스 뇌 (E) 9.5에 r​​etroviral 벡터의 주사를 안내 고주파 초음파 이미징의 사용을 설명합니다.

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Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

개발 Zebrafish Forebrain에 Clonally 관련 신경 전구 세포의 시간 경과 라이브 영상

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

연구

신경과학

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental pathways. Several powerful and well established transgenic technologies are available to manipulate gene expression levels in mouse, allowing for the generation of both loss- and gain-of-function models. However, the generation of mouse transgenics is both costly and time consuming. Alternative methods of gene manipulation have therefore been widely sought. In utero electroporation is a method of gene delivery into live mouse embryos1,2 that we have successfully adapted3,4. It is largely based on the success of in ovo electroporation technologies that are commonly used in chick5. Briefly, DNA is injected into the open ventricles of the developing brain and the application of an electrical current causes the formation of transient pores in cell membranes, allowing for the uptake of DNA into the cell. In our hands, embryos can be efficiently electroporated as early as embryonic day (E) 11.5, while the targeting of younger embryos would require an ultrasound-guided microinjection protocol, as previously described6. Conversely, E15.5 is the latest stage we can easily electroporate, due to the onset of parietal and frontal bone differentiation, which hampers microinjection into the brain. In contrast, the retina is accessible through the end of embryogenesis. Embryos can be collected at any time point throughout the embryonic or early postnatal period. Injection of a reporter construct facilitates the identification of transfected cells.
To date, in utero electroporation has been most widely used for the analysis of neocortical development1,2,3,4. More recent studies have targeted the embryonic retina7,8,9 and thalamus10,11,12. Here, we present a modified in utero electroporation protocol that can be easily adapted to target different domains of the embryonic CNS. We provide evidence that by using this technique, we can target the embryonic telencephalon, diencephalon and retina. Representative results are presented, first showing the use of this technique to introduce DNA expression constructs into the lateral ventricles, allowing us to monitor progenitor maturation, differentiation and migration in the embryonic telencephalon. We also show that this technique can be used to target DNA to the diencephalic territories surrounding the 3rd ventricle, allowing the migratory routes of differentiating neurons into diencephalic nuclei to be monitored. Finally, we show that the use of micromanipulators allows us to accurately introduce DNA constructs into small target areas, including the subretinal space, allowing us to analyse the effects of manipulating gene expression on retinal development.

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

In utero electroporation allows for rapid gene delivery in a spatially- and temporally-controlled manner in the developing central nervous system (CNS). Here we describe a highly adaptable in utero electroporation protocol that can be used to deliver expression constructs into multiple embryonic CNS domains, including the telencephalon, diencephalon and retina.

사용하여 여러 개의 CNS 준주로 효율적인 유전자 전달 Utero에서 Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

마우스 Utero에 Electroporation : 통제 Spatiotemporal 진 Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

성인 마우스 Forebrain의 급성 슬라이스에 Neuroblast 마이그레이션의 시간 경과 영상

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

사용하는 마우스 대뇌 피질과 해마의 시각화 및 Dendrites와 쪽이의 유전자 조작<em&gt; utero에서</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing

Glucose metabolism is a useful marker for local neural activity, forming the basis of methods such as 2-deoxyglucose and functional magnetic resonance imaging. However, use of such methods in animal models requires anesthesia and hence both alters the brain state and prevents behavioral measures. An alternative method is the use of in vivo microdialysis to take continuous measurement of brain extracellular fluid concentrations of glucose, lactate, and related metabolites in awake, unrestrained animals. This technique is especially useful when combined with tasks designed to rely on specific brain regions and/or acute pharmacological manipulation; for example, hippocampal measurements during a spatial working memory task (spontaneous alternation) show a dip in extracellular glucose and rise in lactate that are suggestive of enhanced glycolysis1-3,4-5, and intrahippocampal insulin administration both improves memory and increases hippocampal glycolysis6. Substances such as insulin can be delivered to the hippocampus via the same microdialysis probe used to measure metabolites. The use of spontaneous alternation as a measure of hippocampal function is designed to avoid any confound from stressful motivators (e.g. footshock), restraint, or rewards (e.g. food), all of which can alter both task performance and metabolism; this task also provides a measure of motor activity that permits control for nonspecific effects of treatment. Combined, these methods permit direct measurement of the neurochemical and metabolic variables regulating behavior.

Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing

Modulation of hippocampally-dependent spatial working memory by direct intrahippocampal microinjection, accompanied and followed by in vivo microdialysis for metabolites in conscious, behaving animals.

Hippocampal 인슐린 Microinjection 및<em&gt; 생체에</em공간 메모리 테스트 기간 동안&gt; Microdialysis

Glucose metabolism is a useful marker for local neural activity, forming the basis of methods such as 2-deoxyglucose and functional magnetic resonance ...

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked seizures, epilepsy can be acquired as a result of an insult to the brain or a genetic mutation. Efforts to model seizures in animals have primarily utilized acquired insults (convulsant drugs, stimulation or brain injury) and genetic manipulations (antisense knockdown, homologous recombination or transgenesis) in rodents. Zebrafish are a vertebrate model system1-3 that could provide a valuable alternative to rodent-based epilepsy research. Zebrafish are used extensively in the study of vertebrate genetics or development, exhibit a high degree of genetic similarity to mammals and express homologs for ~85% of known human single-gene epilepsy mutations. Because of their small size (4-6 mm in length), zebrafish larvae can be maintained in fluid volumes as low as 100 &mu;l during early development and arrayed in multi-well plates. Reagents can be added directly to the solution in which embryos develop, simplifying drug administration and enabling rapid in vivo screening of test compounds4. Synthetic oligonucleotides (morpholinos), mutagenesis, zinc finger nuclease and transgenic approaches can be used to rapidly generate gene knockdown or mutation in zebrafish5-7. These properties afford zebrafish studies an unprecedented statistical power analysis advantage over rodents in the study of neurological disorders such as epilepsy. Because the "gold standard" for epilepsy research is to monitor and analyze the abnormal electrical discharges that originate in a central brain structure (i.e., seizures), a method to efficiently record brain activity in larval zebrafish is described here. This method is an adaptation of conventional extracellular recording techniques and allows for stable long-term monitoring of brain activity in intact zebrafish larvae. Sample recordings are shown for acute seizures induced by bath application of convulsant drugs and spontaneous seizures recorded in a genetically modified fish.

A simple method to record extracellular field potentials in the larval zebrafish forebrain is described. The method provides a robust in vivo read-out of seizure-like activity. This technique can be used with genetically modified zebrafish larvae carrying epilepsy-related genes or seizures evoked by administration of convulsant drugs.

애벌레의 Zebrafish의 Forebrain Electrophysiological 기록

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very powerful experimental approach. However, generating novel mouse mutants is often frustratingly slow. It has been shown that access to the mouse brain developing in utero with reasonable post-operatory survival is possible. Still, results with this procedure have been reported almost exclusively for the most superficial and easily accessible part of the developing brain, i.e. the cortex. The thalamus, a narrower and more medial region, has proven more difficult to target. Transfection into deeper nuclei, especially those of the hypothalamus, is perhaps the most challenging and therefore very few results have been reported. Here we demonstrate a procedure to target the entire hypothalamic neuroepithelium or part of it (hypothalamic regions) for transfection through electroporation. The keys to our approach are longer narcosis times, injection in the third ventricle, and appropriate kind and positioning of the electrodes. Additionally, we show results of targeting and subsequent histological analysis of the most recessed hypothalamic nucleus, the mammillary body.

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Despite the functional and medical importance of the hypothalamus, in utero genetic manipulation of its development has rarely been attempted. We show a detailed procedure for in utero electroporation into the mouse hypothalamus and show representative results of total and partial (regional) hypothalamic transfection.

마우스의 유전자 조작을 통해 시상 하부 개발<em&gt; 자궁 내</em&gt; 일렉트로

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the over-production of amyloid-beta and the deposition of amyloid-beta plaques in brain regions of the afflicted individuals. Throughout the years scientists have generated numerous Alzheimer&#8217;s disease mouse models that attempt to replicate the amyloid-beta pathology. Unfortunately, the mouse models only selectively mimic the disease features. Neuronal death, a prominent effect in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients, is noticeably lacking in these mice. Hence, we and others have employed a method of directly infusing soluble oligomeric species of amyloid-beta - forms of amyloid-beta that have been proven to be most toxic to neurons - stereotaxically into the brain. In this report we utilize male C57BL/6J mice to document this surgical technique of increasing amyloid-beta levels in a select brain region. The infusion target is the dentate gyrus of the hippocampus because this brain structure, along with the basal forebrain that is connected by the cholinergic circuit, represents one of the areas of degeneration in the disease. The results of elevating amyloid-beta in the dentate gyrus via stereotaxic infusion reveal increases in neuron loss in the dentate gyrus within 1 week, while there is a concomitant increase in cell death and cholinergic neuron loss in the vertical limb of the diagonal band of Broca of the basal forebrain. These effects are observed up to 2 weeks. Our data suggests that the current amyloid-beta infusion model provides an alternative mouse model to address region specific neuron death in a short-term basis. The advantage of this model is that amyloid-beta can be elevated in a spatial and temporal manner.

Here, we present a protocol for direct stereotaxic brain infusion of amyloid-beta. This methodology provides an alternative in vivo mouse model to address the short-term effects of amyloid-beta on brain neurons.

마우스 해마에 올리고머 아밀로이드 - 베타의 정위 주입

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous system. Overexpression of desired genes is just as possible as shRNA mediated loss-of-function studies. Therefore it offers a wide range of applications. The feasibility to target particular cells in a distinct area further increases the range of potential applications of this very useful method. For efficiently targeting specific regions knowledge about the subtleties, such as the embryonic stage, the voltage to apply and most importantly the position of the electrodes, is indispensable.
Here, we provide a detailed protocol that allows for specific and efficient in utero electroporation of several regions of the C57BL/6 mouse central nervous system. In particular it is shown how to transfect regions the develop into the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus. For this information about the appropriate embryonic stage, the appropriate voltage for the corresponding embryonic stage is provided. Most importantly an angle-map, which indicates the appropriate position of the positive pole, is depicted. This standardized protocol helps to facilitate efficient in utero electroporation, which might also lead to a reduced number of animals.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

This protocol describes in detail how to specifically transfect different regions in the C57BL/6 central nervous system via in utero electroporation. Included in this protocol are detailed instructions for transfections of regions that develop into the cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, lateral septal nucleus and striatum.

코어 텍스, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, 횡 중격 Nucleus-과 줄무늬 별<em&gt; 자궁 내</em&gt; C57BL / 6 마​​우스에서 Electroporation에

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous ...