이 작품은 재생 요법, TU 드레스덴 (Dresden)의 의료 학부 및 DFG 공동 연구 센터 SFB655 (하위 프로젝트 A20)를위한 센터에 의해 지원되었다. BA는 셋방-BB 프로그램, 드레스덴 (Dresden)의 화목에 의해 지원되었다. 우리는 Drs 감사드립니다. Noriko 스미, 타다 노무라, 디터 Chichung의 거짓말, 그리고 자궁의 electroporation 및 stereotaxic 바이러스 주입에의 설정까지 동안 귀중한 조언 라비 Jagasia.

예비 노트 수술은 동물 복지에 대한 지방 자치 단체의 승인에 따라 완벽하게 훈련 된 조사가 수행해야합니다. 모든주의 깊은 마취, 수술 후 진통제의 투여하고, 이상 10 분, 각막 탈수 실명을 방지하기 위해 눈 윤활제의 응용 프로그램을 지속 운영 등의 동물로 입은 고통과 스트레스를 최소화하기 위해 이동해야합니다. Anesthetized 마우스는 37 지속적으로 따뜻한 보관해야합니다 ° C 전체 복구 및 모든 수술 도구 및 솔루션을 살균해야합니다 때까지. 생물학적 후드의 사용이 엄격하게 필요하지 않습니다 만, 연산자는 실험실 코트, 마스크 및 장갑을 착용하여 작업 동안 동물을 감염 가능성을 최소화하기 위해 모든 합리적인 조치를 취합니다. 마찬가지로, 바이러스의 생성 및 사용에 관한 모든 단계가 승인해야하며 지방 자치 단체의 규정에 따라 S2 영역에서 수행해야합니다.마지막으로, 바이러스와 접촉되었습니다 수있는 모든 도구와 표면에 대한 철저한 정화가 승인 시설 소독 관행 (HIV에 대한 70% 장군님-OH 및 / 또는 autoclaving을 닦고 별)에 따라 수행해야합니다. 제 1 부 : 배아 NSC의 확장 1. 자궁의 electroporation에 <ol><li> 복제 후 PCMS-EGFP (Clontech) 또는 pDSV - mRFPnls 벡터 16 transgenes (예 cdk4/cyclinD1)는 3-5 μg / μl의 농도로 멸균 PBS에 EndoFree 키트와 resuspend를 사용하여 plasmids를 정화. 곧 수술 전에 CA의 최종 비율 PBS에 0.​​05 % FastGreen와 plasmids를 섞는다. 4시 4분 1초하고 모든 침전물 제거 16,000 XG에서 2 분의 혼합물을 원심 분리기. </li><li> 이전에 가져온 붕규산 유리 모세관에 DNA 혼합물을로드합니다. P-97 피펫 풀러를 사용하여 당기는 매개 변수는 다음과 같습니다 풀다운 : 200, 벨 : 140, 시간 : 140. 열이 램프 시험에 의해 주어진과 사양에 따라 달라집니다되어 있습니다모세 혈관의 ific 많이 사용된다. 자궁의 electroporation 플랫폼 (그림 1A)의 근처에 PicoPump의 노즐에 모세관을 장착하고, stereomicroscope 아래의 팁과 반곡 점에서 닉을 구부린다. </li><li> 마른 유리 구슬 살균기의 모든 수술 도구를 소독하고 깊이 isoflurane vaporizer를 사용하여 회임의 날 12-15에서 임신 마우스를 마취. 37 ° C로 설정 난방 플랫폼에 위로 향한 위치에 동물을 놓고 코 콘을 통해 지속적인 isoflurane 관리 이하로 유지하십시오. </li><li> 복부의 피부를 면도, 결국 70 %의 에탄올과 사이에 닦고, Betaisodona 여러 번으로 소독하고, 0.1 MG / 선제 진통제와 같은 kg 농도를에 피하 buprenorphine을 (PBS에 희석) 주입. 고급 가위를 사용하여 복막 캐비티에 액세스 할 수있는 기본 근육 벽의 후 2cm 길이 방향 피부의 절단 등을,합니다. 복막 캐비티 캘리포니아 조제. 이IUE 솔루션 (D-PBS는 펜 / 패 혈성 100 U / ML을 포함)의 ML 37에 prewarmed ° C와 난방 블록에 솔루션을 보관. </li><li> uteri가 제거 될에서 균열 (fissure)를 포함하는 살균 drap와 마우스를 다룹니다. 텅스텐 견인기를 사용하여 절개를 철회, 자궁을 파악하고 인접 태아 사이의 포셉 (그림 1B, 왼쪽)와 함께 개최를 뽑아 마지막으로 무균 drap에 바칠 것이다. 전체 작업 기간 동안, 기관과 몸 캐비티에 보습 크림도 발라과 동물의 탈수를 방지하기 IUE 솔루션 자궁을 씻어. </li><li> 조심스럽게 엄지와 검지 사이를 가지고있는 자궁을 처리하고 머리를 연산자에 대한 가시성과 지향 때까지 한 배아를 켜십시오. telencephalic 반구를 파악하고 dorso - 외 측면에서 중 하나를 삽입. 심실이 FastGreen (; 오른쪽 그림 1b)에 의해 설명 될 때까지 PicoPump의 풋 스위치를 사용하여 DNA 솔루션 1-2 μl를 놓습니다. </li><lI&gt; 장소 주입 사이트와 contralateral 측면 (그림 1C)에서 음극에서 전극의 양극과 사각형 전기 필드를 생성 electroporator를 사용하여 각 펄스 사이 950 밀리 초 간격으로 50 밀리에 30 V의 6 펄스를 제공은 운영 풋 스위치를 통해. 이 출혈 손상 배아의 원인이 될 수 있습니다로 전극이 태반 가까이에 두지 마십시오. </li><li> 모든 배아 주입하고 electroporated 때, 복강에 다시 자궁을 배치하고 모든 3-4mm를 suturing 봉합 문자열로 근육질의 벽을 닫습니다. 노트는 근육에 아늑한하지만 조직의 약간의 붓기를 허용하기에 너무 타이트 해 진해야합니다. 마지막으로, 금속 클립을 사용하여 놓인 피부를 닫습니다. Betaisodona로 피부를 소독, isoflurane 마스크에서 마우스를 제거하고 완전히 깨어 주택 케이지에 전송할 수 있습니다. 전위의 동작이 정상 때까지 마우스의 복구를 모니터링 할 수 있습니다. </li></ol> 2. 샘의 처리ple <ol><li> 하나 이상의 일 electroporation 후, 마우스를 희생 배아를 수집하고 올바르게 형광 stereomicroscope (그림 1D)를 사용하여 electroporated 사람들을 식별합니다. 얼음처럼 차가운 PBS에 머리를 해부하고, 4퍼센트 PFA (인산 완충 산도 7.4의 paraformaldehyde)에 밤을 해결할 수 있습니다. 결국, BrdU는 세포주기의 속도론 및 세포 증식 3 조사하기 위해 서로 다른 패러다임에 따라 희생하기 전에 관리 할 수 있습니다. </li><li> 뇌 그런 다음 sectioning이며 대상 NSC과 자손에 기능 transgenes의 효과를 평가하기 위해 반경 방향 glia의 여러 마커, 기저 progenitors 뉴런 (Pax6, Nestin, Tbr2, Tbr1, Tuj1 등) immunostaining에 처리됩니다 공동 electroporated 리포터 유전자의 표현에 의해 식별. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4093/4093fig1.jpg" alt="그림 1" /> 1 그림.자궁의 electroporation합니다. 자궁의 electroporation 플랫폼에서의 (A) 도식 표현입니다. (B) 수술 중에 임신 마우스 위치 (오른쪽)와 마우스 배아 (왼쪽)의 telencephalic 남반구에있는 DNA / FastGreen 혼합 (파란색)의 주입을 보여주는 그림. (C) 제도 분사의 사이트 (파란색)에 인접한 양극 (+)과 자궁 벽과 접촉 전극의 배치를 보여주고 있습니다. 화살표는 양극에 대한 DNA의 마이그레이션을 나타냅니다. 배아 일 13 살 GFP의 plasmids과 electroporation 후 마우스의 배아 24 시간의 (D) 사진. 점선은 telencephalic 반구를 demarcates. Calegari 외에서 수정되었습니다., 2004 년 17 제도. 2 부 : 성인 NSC의 확장 1. HIV-파생 된 바이러스 입자의 생산 <ol><li> 1 일 : 판 5 × 10 10cm 6 293T 세포D-가상이 열 inactivated 태아 소 혈청의 10 % 펜 / 패 혈성 (문화 매체)의 100 U / ML을 포함하는 8 ML과 요리. 37에 하나의 바이러스 준비와 밤 문화 15 요리를 사용 ° C, 5 % CO 2. </li><li> 일 2 : 모든 음식에 대해) 내가 인코딩을 3 plasmids 각각의 일반 D-가상 5 μg의 1 ML에 VSVG (기공을 갖는 구염 바이러스 유형 G) 봉투 단백질, II) 개그 / 폴을 (그룹 특정 항원 / 효소) 희석 , 그리고 III) polycistronic 이전 9 HIV 기반의 전송 벡터 (p6NST90)에 복제 기능 및 기자 transgenes (예 cdk4/cyclinD1/GFP)를 표현 구성합니다. D-가상은 실온에서 15-30 분에 대해 1 MG / ML 주식 솔루션 및 배양에 PBS에서 사전에 용해 된 polyethylenimine 45 μl를 포함하는 1 ML과이 솔루션을 섞는다. 한편에서는 세포에서 미디어를 제거하고 열 inactivated 태아 소 혈청의 15 % 및 100 U / 펜 / 패 혈성의 ML을 포함하는 신선한 D-가상의 요리에 4 ML를 추가합니다. 2 m을 추가transfection 혼합물과 문화 하룻밤의 리터. </li><li> 3 일 : 500 MM 120 μl transgenes의 표현을 향상시킬 수 있도록 음식에 따라 오세영 - 부티르산을 추가, 문화 매체의 5 ML로 transfection 매체를 대체하는 후 6-8 시간에 부드럽게와 문화를 섞는다. </li><li> 4 일 : supernatants을 (ca. 70 ML 총)를 수집, 2 polyallomer의 원심 분리기 튜브 (35 X 89mm)에 0.22 μm 필터 및 전송을 통해 전달합니다. 4에 90 분에 110,000 XG의 Ultracentrifuge ° C 스윙 로터를 사용합니다. 표면에 뜨는 폐기하십시오, 각 튜브에 PBS 6 ML을 추가하고 1 시간에 얼음을 품다. 펠렛을 Resuspend 한 polyallomer의 원심 분리기 튜브 (14 X 95mm)에 전송할 수 있습니다. 4에 90 분에 110,000 XG의 Ultracentrifuge ° C 스윙 로터를 사용합니다. 표면에 뜨는 폐기하십시오, PBS의 50 μl의 펠렛을 resuspend, -80에서 5 μl aliquots 및 매장을 ° C. 바이러스 titer는 10 8 -10 9 CFU / ML의 범위에있을 것입니다. (참고 : 바이러스가 온도와 스토리지, 아보에 매우 민감한이드 재 냉동은 운송 중에 드라이 아이스를 유지하고 사용하기 전에 빨리 해동.) </li></ol> 2. Stereotaxic 주입 <ol><li> isoflurane과 6~10주 오래된 마우스를 마취하고 적절하게 머리를 해결하기 위해 귀 바, 입맛 지원을 사용하여 stereotaxic 프레임 (그림 2A)에 발생하기 쉬운 위치에 동물을 배치합니다. 동물은 37 ° C에서 지속적인 isoflurane 관리 아래 설정 가열 패드에 따뜻한 보관됩니다. </li><li> 피하 선제 진통제와 같은 buprenorphine 작업 솔루션 100 μl를 삽입, 마우스의 머리에 피부의 스트라이프를 면도 등 1.4에 설명 desinfect. 메스를 사용 CA를합니다. 시상 봉합의 수준에서 두개골을 노출 머리 피부에 1.5 cm 긴 세로 절개. 피부를 철회하고 부드럽게 멸균면 새싹과 뼈 표면을 청소하십시오. </li><li> 파라핀 오일과 모세관 유리 (1.2의 사양) 하프 작성하여 삽입 주입기 펌프에 장착두 번째 링 (그림 2B)까지 모세관. 모세관의 끝은 bregma, 시상 및 측면 봉합 (그림 2C) (stereomicroscope의 도움으로 결정 예정) 사이의 연결 지점에 위치 할 때까지 x, y 및 z 축에있는 모세관 홀더를 이동하고, 재 세트 X, Y 및 Z 값 0. </li><li> 앞 - 뒤 축 (Y)에 ± 만나는-측면 축에 1.6 mm (X)와 -1.9 mm로 모세관를 이동하고 수술 마커 펜을 사용하여 뼈를 표시합니다. CA의 구멍을 확인합니다. 뇌를 손상하지주의를 지불 전기 맹연습을하는 것을 사용하여 두개골에 0.5 mm 지름. </li><li> 귀 바에 위치 parafilm의 한 부분에 바이러스 정지 5 μl 소적 (1 나누어지는)을 넣고 비말에있는 모세관의 끝을 immerge. CA를 빨아 줘. nanoliter 주입기를 사용하여 바이러스 정지 3.5 μl 55 NL / 초에 설정합니다. 물방울이 증발하므로 빠르게이 단계를 실행합니다. </li><li> 사이트 O에 모세관 이동F 주입과 끝이 pial 표면을 감동까지 내려 이동합니다. 0으로 dorso - 복부 축 값 (Z)를 재설정합니다. 이 시점에서 -1.9 mm의 모세관과 조직을 침투와 4 NL / 초의 속도로 바이러스 정지의 1.5 μl를 놓습니다. 바이러스 정지 트로프 모세관 트랙의 역류를 최소화 한 후 모세관를 철회 할 2~3분 기다립니다. 두 번째 주입은 controlateral 남반구에서 수행 할 수 있습니다. </li><li> , 피부를 봉합 소독하고, 자궁 electroporation (1.8)에서 이전에 설명 된대로 동물이 마취에서 회복 할 수 있습니다. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4093/4093fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. Stereotaxic 바이러스 주사. stereotaxic 분사 (A)와 CA의 삽입을 보여주는 분해 모세관 홀더을 수행하기 위해 필요한 구성 요소 (A와 B) 도식 표현두 번째 링 (B)까지 pillary. (C) 피부에 귀 바, 입맛 지원에 의해 고정 마우스 머리 사진이 두개골을 (왼쪽) 노출 컷. 점선 상자의 배율은 (오른쪽) 측면과 시상 봉합, bregma 및 주입 (원)의 사이트를 보여줍니다. 3. 샘플의 처리 <ol><li> 1 대 - 3 주 후 감염, CA와 마우스를 perfuse. 4퍼센트 PFA의 100 ML은 뇌를 해부하고 4퍼센트 PFA의가 하루 아침에 게시 - 수정합니다. 결국, BrdU 및 / 또는 tamoxifen는 각각 9, 세포주기의 속도론을 조사하고 loxP 사이트에서 옆에있는 바이러스 transgenes의 표현을 중지 다른 패러다임에 따라 희생하기 전에 관리 할 수 있습니다. </li><li> 뇌 그런 다음 줄기와 progenitors 세포 뉴런 (예 : Sox2, GFAP, Nestin, Tbr2, doublecortin 등)의 여러 마커를 사용하여 immunostaining을 위해 처리 할 수 있습니다. </li></ol>

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	<li>Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells:+units+of+development,+units+of+regeneration,+and+units+in+evolution.">Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution.</a> Cell. 100, 157-168 (2000).</li><li>Lindvall, O., Kokaia, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+for+the+treatment+of+neurological+disorders.">Stem cells for the treatment of neurological disorders.</a> Nature. 441, 1094-1096 (2006).</li><li>Salomoni, P., Calegari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+control+of+mammalian+neural+stem+cells:+putting+a+speed+limit+on+G1.">Cell cycle control of mammalian neural stem cells: putting a speed limit on G1.</a> Trends Cell Biol. 5, 332-342 (2010).</li><li>Lange, C., Calegari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdks+and+cyclins+link+G(1)+length+and+differentiation+of+embryonic,+neural+and+hematopoietic+stem+cells.">Cdks and cyclins link G(1) length and differentiation of embryonic, neural and hematopoietic stem cells.</a> Cell Cycle. 9, 1893-1900 (2010).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).</li><li>Inoue, T., Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+impulse+to+the+brain--using+in+vivo+electroporation.">An impulse to the brain--using in vivo electroporation.</a> Nat. Neurosci. 4, 1156-1158 (2001).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation:+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex.">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 10, 865-872 (2001).</li><li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex.">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cereb. Cortex. , 120-125 (2009).</li><li>Artegiani, B., Lindemann, D., Calegari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+cdk4+and+cyclinD1+triggers+greater+expansion+of+neural+stem+cells+in+the+adult+mouse.">Overexpression of cdk4 and cyclinD1 triggers greater expansion of neural stem cells in the adult mouse.</a> J. Exp. Med. 208, 937-948 (2011).</li><li>Dixit, R., Lu, F., Cantrup, R., Gruenig, N., Langevin, L. M., Kurrasch, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Gene+Delivery+into+Multiple+CNS+Territories+Using+In+Utero+Electroporation.">Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation.</a> J. Vis. Exp. (52), e2957 (2011).</li><li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Utero+Intraventricular+Injection+and+Electroporation+of+E15+Mouse+Embryos.">In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos.</a> J. Vis. Exp. (6), e239 (2007).</li><li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+in+Utero+Electroporation:+Controlled+Spatiotemporal+Gene+Transfection.">Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection.</a> J. Vis. Exp. (54), e3024 (2011).</li><li>Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+Injection+of+Adeno-associated+Viral+Vectors.">Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors.</a> J. Vis. Exp. (45), e2140 (2010).</li><li>Lepousez, G., Alonso, M., Wagner, S., Gallarda, B. W., Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Viral+Transduction+of+Adult-born+Olfactory+Neurons+for+Chronic+in+vivo+Optogenetic+Stimulation.">Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation.</a> J. Vis. Exp. (58), e3380 (2011).</li><li>Lange, C., Huttner, W. B., Calegari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdk4/cyclinD1+overexpression+in+neural+stem+cells+shortens+G1,+delays+neurogenesis,+and+promotes+the+generation+and+expansion+of+basal+progenitors.">Cdk4/cyclinD1 overexpression in neural stem cells shortens G1, delays neurogenesis, and promotes the generation and expansion of basal progenitors.</a> Cell Stem Cell. 5, 320-331 (2009).</li><li>De Pietri Tonelli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+detection+of+microRNAs+in+developing+vertebrate+embryos+after+acute+administration+of+a+dual-fluorescence+reporter/sensor+plasmid.">Single-cell detection of microRNAs in developing vertebrate embryos after acute administration of a dual-fluorescence reporter/sensor plasmid.</a> Biotechniques. 41, 727-732 (2006).</li><li>Calegari, F., Marzesco, A. M., Kittler, R., Buchholz, F., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+RNA+interference+in+post-implantation+mouse+embryos+using+directional+electroporation+and+whole+embryo+culture.">Tissue-specific RNA interference in post-implantation mouse embryos using directional electroporation and whole embryo culture.</a> Differentiation. 72, 92-102 (2004).</li><li>Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+gene+expressions+by+electroporation+in+the+developing+brain+of+mammalian+embryos.">Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos.</a> Differentiation. 70, 155-162 (2002).</li><li>Pierfelice, T. J., Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound-Guided+Microinjection+into+the+Mouse+Forebrain+In+Utero+at+E9.5.">Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5.</a> J. Vis. Exp. (45), e2047 (2010).</li><li>Osumi, N., Inoue, T. G. e. n. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=transfer+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation.">transfer into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Methods. 24, 35-42 (2001).</li></ol>

BA와 FC는 cdk4/cyclinD1 바이러스 (EP 10160288.6)에 의해 성인 체세포의 줄기 세포의 조건부 확장을 설명하는 특허 신청서를 제출했습니다.

자궁의 electroporation에 대한 중요한 단계는 전기 분야의 배달시의 방향 마이그레이션 충전에 따라 달라집니다 이후 DNA의 품질과 순도입니다. 같은 endotoxins 같은 추가 요금이 부과 분자의 제거를 포함하지 않는 DNA 정화를위한 프로토콜이 좋지 배달로 이어지는 자연의 DNA 부정적인 요금의 마스킹 될 수 있습니다. 분명 가장 가까운 가능한 타겟이 될 수있는 영역에 전극과 자궁 벽을 터치하면 electroporation 효율을 향상시킬 수 있습니다. 또 다른 중요한이 최적의 전기 분야의 전송 기본이기 때문에 사용되는 전극의 품질입니다. 눈 및 / 또는 등등 혈청의 흔적, 지질, 등 유기 잔류 물에 의해도 보이지 않는 미세 흠집이 불가피하게 자신의 속성을 잃지 전극에 이르는 시간이 지남에 축적됩니다. 옛 및 / 또는 더러운 electropes는 electroporation 효율에 갑자기 드롭의 가장 큰 원인이며, 따라서, R이어야합니다가능한 한 빨리이가 발견되기 때문에 eplaced. 비교적 간단하지만, 자궁의 electroporation에 일반적으로 만족하고 재현 결과를 달성하기 위해 훈련의 몇 주이 필요합니다. 가 개발 배아의 기관 및 조직에, 사실상, 적용 할 수 있기 때문에이 기술은 매우 다양한입니다. 물론, 이러한 뇌 등의 캐비티를 포함한 기관은 대상과 DNA의 비교적 큰 볼륨을 주입의 용이성으로 인해 transfected 세포의 높은 비율을 할 수 있도록 특히 용이합니다. stereotaxic 바이러스 주사를 설정에서 발생하는 일반적인 문제는 몇 감염된 세포 및 /하거나 원하지 않는 영역을 타겟팅하는 것입니다. 첫 번째 문제는 주로 낮은 titer 바이러스의 주입과 상관 있습니다. 문화의 통로 낮은 번호를 가진 293T 세포가 빠르게 성장하고 높은 바이러스 titers로 연결됩니다. CA보다 오래된 세포를 사용합니다. 20 구절을 권장 미만 80 % 효율 transfection의 의미없는 것은 좋은을 보장하지 않습니다바이러스 생산. 바이러스 펠렛의 Resuspension도 중요합니다, 바이러스 정지는 모세가 피해야 할 필요가 윗니와 아랫니가 맞 물리다 수 동질 및 바이러스 clumps를 표시 할 수 있습니다. 바이러스는 온도 드랍스 및 장기 저장에 매우 민감합니다. 이 이유로, aliquots이 영구적으로 -80 ° C에서 저장하고 refrozen 할 수 없습니다 필요합니다. 심지어 이런 상황에서, 감염의 감소는 스토리지의 6-12 개월 후에 관찰 할 수있다. 학습 단계에서, 우리는 각각의 바이러스 준비 바이러스 titer를 테스트하고 장기 보관 한 후 다시 수행하는 것이 좋습니다. 뇌의 원치 않는 영역에 감염된 세포의 존재는 연습이 필요합니다 stereotaxic 프레임에 마우스 머리 차선 위치에 따라 달라집니다 수 있습니다. 또한, 그렇지 않으면이 부정확 주입의 결과로, pial 표면에 정확하게 공을 재설정 할 수 없습니다 때문에 두개골에 구멍을 여는 동안 뇌의 표면을 손상하지 중요합니다. 좌표우리가이 프로토콜에서 제공하는 C57/BL6 6-10주 옛 여자라고합니다 그리고 서로 다른 변형 / 연령 / 성별을 위해 최적화하는 것이 좋습니다. 이 기술의 취득은 바이러스를 준비하고 샘플을 분석하는 데 필요한 단계 이상으로 인해 자궁의 electroporation보다 더 많은 시간이 필요할 수 있습니다. 우리는 강력하게 마우스 수술과 stereotaxic 분사가 안정적이고 재현 될 한 후 바이러스 만 사용하는 것이 좋습니다. 이를 달성하기위한 첫 번째 단계는 euthanized 마우스에서 해당 Hoechst 33342와 같은 세포 permeant DNA의 염료를, 삽입 즉시 뇌를 분석하는 것입니다. 자궁의 electroporation 및 stereotaxic 바이러스 주사를 두 개의 강력한 심하게으로 시스템과 조직 - 특히 포유류의 개발 및 성인기 동안 CNS 내에서 유전자 발현을 조작입니다. 세포 만 subpopulation을 타겟팅의 제한에도 불구하고, 이러한 시스템은 전례없는 속도를 제공하고 더 많은 기존의 방법에 비해 쉽게, 전유전자 변형 마우스의 N 특히 힘든 시간이 소요 세대. 그러나,이 유사성에도 불구하고, 몇 가지 차이가​​ 가치가 멘션있는 두 가지 기술 사이에 존재합니다. 이러한 DNA가 주입되어 심실을 delimiting 유일한 세포이기 때문에 첫째, 자궁의 electroporation에, 다른 세포 유형의 타겟팅과 관련하여 초기에 적절한 줄기 세포 (또한 반경 방향 glial 세포라고도 함)의 transfection로 연결됩니다. 세포 분열의 결과로, plasmids은 이후의 전구 및 / 또는 시간의 함수로 피질에 걸쳐 transfected 세포의 재배포에 이르는 neuronal 딸 세포를 타겟으로, 어머니의 줄기 세포에서 상속됩니다. 대조적으로, 성인 뇌의 HIV의 lentiviruses의 사용은 줄기 세포, progenitors, 뉴런뿐만 아니라 성숙 glial 세포를 포함한 모든 세포 타입의 동시 감염 발생합니다. 참고 더 일반적으로 사용되는 레트로 바이러스가 잠복 반대로 HIV의 lentiviruses를 사용에 관한 사실입니다그 lentiviral 통합 따라서 성인, 동작 줄기 세포의도 타겟 수 있도록 독립적으로 세포의 mitotic 상태에서 발생합니다. 둘째, electroporation 및 바이러스 감염 사이의 또 다른 중요한 차이점은 후자에 의해 달성 감염된 세포의 게놈에있는 DNA의 돌이킬 수없는 통합에 반대하는 등의 일시적인, episomal 표현이 전에 의해 달성되는 것입니다. 연속 셀 부문, electroporated plasmids의 희석하고, 이소성 cyclinD1 단백질의 저하의 결과로, 각 세포주기에 있었 것입니다. 이 효과는 몇 개월 (게시되지 않은 결과) 지속하기 위해 발견 된 성인 뇌에있는 동안 따라서, 태아의 개발 기간 동안 NSC의 확장은 지난 약 이일 15에 게재되었습니다. 전) cdk4/cyclinD1 개발 중) 최선을 다하고 신경 progenitors을 더 G1 및 II와 세포에 강력한 영향을 이후 셋째, 더 이상 세포주기를반대 성인 중에 마찬가지 동안 줄기 세포보다 두 조작은 성인 동안 개발과 줄기 세포 중 신경 progenitors의 확장을 주로 실행하는 발견되었습니다. 각각의 경우에 뉴런의 증가는 두 가지 방법에 의해 달성되었습니다. 넷째, 바이러스 주입은 쉽게 간단하게 stereotaxic 좌표를 변경하여 성인 뇌의 여러 지역에서 안정적으로 reproducibly, 수행 할 수 있습니다. 반면에, 자궁의 electroporation에 의한 이러한 뇌 줄기, hippocampal 형성, 또는 척추 등 중추 신경계의 특정 지역의 정확한 타겟팅 reproducibly 달성하기 힘들 것입니다. stereotaxic 분사가 어떤 시대의 쥐를 수행 할 수 있으며 또한, 자궁의 electroporation에 최적의 성능을 E16에 E11에 대한에서 제한되어 있습니다. 이전 E11에 대한 단계는 초음파 후방 산란 현미경 18,19의 사용 또는 전체 배아 컬트 중 하나를 요구우레 시스템 17,20. 자신의 연구와 조작이 소설 셀 기반의 재생 치료의 개발에 대한 기본적인 것으로 생각되기 때문에, 최근 체세포 줄기 세포의 기본 세포 생물학의 증가 관심이 추진되었습니다. cdk4/cyclinD1의 overexpression에 대한 특히, 우리의 프로토콜은 transitorily 성인 뇌에서 생성 된 뉴런의 수를 증가시키기 위해 생체 내 NSC의 확장 (그림 3B와 C와 4B와 C)을 높일 수있는 방법을 제공합니다. 우리는이 조작이 더 뇌 개발, 진화와 항상성뿐만 아니라인지 기능이나 신경 변성이나 부상에서 회복에 대한 그들의 공헌에 NSC의 역할을 이해하기 위해 다양한 상황의 숫자에 중요 할 수 있다고 생각합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 재료 / 장비 </td><td> 공급 업체 </td><td> # 카탈로그를 </td><td></td></tr><tr><td> Endofree의 맥시 플라스미드 키트 </td><td> Qiagen </td><td> 12,362 </td><td></td></tr><tr><td> FastGreen </td><td> 시그마 </td><td> F7258 </td><td></td></tr><tr><td> P-97 불타는 / 브라운 피펫 풀러 </td><td> 셔터 악기 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 필라멘트가있는 붕규산 모세 혈관 </td><td> 셔터 악기 </td><td> BF120-69-10 </td><td></td></tr><tr><td> 표 상단 실험실 동물 마취 시스템 </td><td> VetEquip </td><td> 901806 </td><td></td></tr><tr><td> Isofluran </td><td> 박스터 </td><td> HDG9623 </td><td></td></tr><tr><td> Germinator 500 유리 구슬 살균기 </td><td> SouthPointe 외과 </td><td> GRM5-1460 </td><td></td></tr><tr><td> 아이리스 포셉 </td><td> WPI </td><td> 15,917 </td><td></td></tr><tr><td> Betaisodona 솔루션 </td><td> Mundipharma </td><td> 1931491 </td><td></td></tr><tr><td> 피코 펌프 </td><td> WPI </td><td> PV820 </td><td></td></tr><tr><td> ECM 830 평방 파 electroporator </td><td> 하버드 장치 </td><td> 450052 </td><td></td></tr><tr><td> 라운드 트위터 전극 </td><td> NEPAGENE </td><td> CUY650P1 </td><td></td></tr><tr><td> 봉합 재료 </td><td> Ethicon </td><td> V493H </td><td></td></tr><tr><td> 반동적 인상처 폐쇄에 대한 applier를 클립 </td><td> WPI </td><td> 500345 </td><td></td></tr><tr><td> Temgesic 주입 솔루션 </td><td> 섹스 제약 AG </td></tr><tr><td> DMEM w / Glutamax-I </td><td> Invitrogen </td><td> 31966021 </td><td></td></tr><tr><td> 태아 Bovin 세럼 </td><td> Invitrogen </td><td> 1027016 </td><td></td></tr><tr><td> 페니실린 / Streptomicin </td><td> Gibco </td><td> 15,140 </td><td></td></tr><tr><td> 조직 배양 접시 </td><td> 매 </td><td> 353003 </td><td></td></tr><tr><td> Polyethylenimine 250 ML </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 40872-7 </td><td></td></tr><tr><td> N-버터의 산, 나트륨 소금 </td><td> 시그마 </td><td> B 5887 </td><td></td></tR&gt; <tr><td> 튜브, thinwall, polyallomer </td><td> Beckman </td><td> 331,374분의 326,823 </td><td></td></tr><tr><td> 모델 900 작은 동물 stereotaxic 악기 </td><td> Kopf 악기 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> OPMI의 피코 현미경 </td><td> Zeiss </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SYS-Micro4 컨트롤러 및 Nanoliter2000 주입기 </td><td> WPI </td><td> B203MC4 </td><td></td></tr><tr><td> 유리 교체 3.5 nanoliter </td><td> WPI </td><td> 4878 </td><td></td></tr><tr><td> SR 드릴 일반적으로 응용 프로그램을 </td><td> Foredam </td><td> K2272 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td><strong&gt; 항체 </td><td> 공급 업체 </td><td> # 카탈로그를 </td><td> 노동 희석 </td></tr><tr><td> Doublecortin </td><td> Santacruz </td><td> SC8066 </td><td> 1:100 </td></tr><tr><td> GFAP </td><td> Chemicon </td><td> MAB3404 </td><td> 1:500 </td></tr><tr><td> Nestin </td><td> BD Biosciences </td><td> 556309 </td><td> 1:1000 </td></tr><tr><td> S100β </td><td> Abcam </td><td> Ab868 </td><td> 1:1000 </td></tr><tr><td> Sox2 </td><td> Millipore </td><td> AB-5603 </td><td> 1:500 </td></tr><tr><td> Tbr2 </td><td> Abcam </td><td> Ab23345 </td><td> 1:400 </td></tr><tr><td colspan="4"> 항체 표. </td></tr></tbody>
 </table>
 </td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

expansion of embryonic and adult neural stem cells by in utero electroporation or viral stereotaxic injection

체세포 줄기 세포는 성인 한 동안 배아 개발 및 조직 항상성 동안 조직 형성을위한 중요한 요소입니다 추가 줄기 세포 (확장) 또는 더 차별화 된 세포 유형 (차별화)을 생성하기 위해 나눌 수 있습니다. 현재 큰 노력이이 재생 의학 1,2에 대한 소설 전략을 개발하기위한 기본이라고 생각하기 때문에 차별화로 확장에서 체세포의 줄기 세포의 스위치를 제어 향해 투자하고 있습니다. 그러나, 체세포의 줄기 세포의 연구와 사용의 주요 과제는 자신의 확장을 제어하기가 매우 어렵 입증 된 것입니다. 여기 cdk4/cyclinD1 단지의 표현, G1 단계의 주요 조절기를 조작하여 마우스 배아 피질 또는 성인 해마의 신경 줄기 / 전구 세포의 컨트롤 (모두 NSC로 칭함) 확장 할 수있는 시스템을 설명 세포주기와 체세포 줄기 세포 비교의erentiation 3,4. 특히, 두 개의 다른 접근 방식은 cdk4/cyclinD1 단지는 생체에 NSC에 overexpressed하는에 의해 설명되어 있습니다. 첫 번째 방법으로, 세포주기의 규제 당국의 overexpression은 마우스 telencephalon의 내강에 cdk4/cyclinD1 인코딩을 plasmids은의 episomal 표현을 트리거링, 따라서, 측 방향 피질의 NSC에게 제공하기 위해 자궁의 electroporation의 다음 주입함으로써 얻을 수 있습니다 transgenes 5-8. 두 번째 접근 방법으로, 매우 집중 HIV-파생 바이러스는 stereotaxically 9 감염된 세포의 게놈에있는 바이러스 구조의 통합 후 세포주기의 규제의 제정 표현을 트리거링, 따라서 성인 마우스 해마의 이가있는 이랑에 주입되어 있습니다. 그의 기본적인 원칙 이미 다른 비디오 프로토콜 10-14에서 설명 된 두 가지 방법은, 내가에 최적화 된), II를 조직의 손상을 줄일 수) 매우 구체적인 뇌 regio의 대상 폭 넓은 부분이NS, III)는 각 지역 내에서 조작 세포의 높은 숫자를 얻을, 그리고 IV)는 각 셀 내에서 transgenes 높은 표현 수준을 게재됩니다. 두 접근법을 사용하여 transgenes의 과도 overexpression 인해 Cre-표현 각각 NSC는 loxP 사이트으로 둘러싸인 cdk4/cyclinD1을 가진 바이러스에 감염 9,15의 세포 분열 또는 tamoxifen 관리에 electroporated plasmids 자연 희석하여 즉 다른 방법으로 얻어진다 . 이 방법 심하게 및 조직 - 특히 마우스의 뇌에서 유전자의 표현을 조작 할 수있는 매우 강력한 플랫폼을 제공합니다. 특히, cdk4/cyclinD1 단지의 표현을 조작하여 우리의 시스템은 궁극적으로 포유류의 뇌에서 생성 된 뉴런의 수를 증가, 따라서, 시간적 NSC 확장의 관리 및 차별화에 대한 그들의 스위치를 할 수 있습니다. 우리 접근 방식은 기초 연구에 매우 중요하고 치료를 위해 체세포의 줄기 세포를 사용 할 수 있습니다포유류의 중추 신경계의 난에 대한 이해)을 제공하는 동시에이 체세포 줄기를 사용하여) 성인, III 동안) 개발, II 동안 더 나은인지 기능에 성인 neurogenesis의 역할, 그리고 아마도 IV)를 조직 항상성을 조직 형성에 셀 공헌을 막기 neurodegenerative 질병 모델 세포.

<ol><li> 전반적으로, 자궁의 electroporation에 측면 피질 (그림 3A)의 폭 넓은 영역에서 리포터 유전자의 강력한 표현을 표시 electroporated 배아의 60~80%를 얻을. 형광 단백질은 쉽게 하나 이상의 주 동안 지속 신호 수술 후 가능한 한 빨리 3~6시간으로 전체 마운트 배아에서 발견 할 수 있습니다. 대상 영역에서 세포의 30-50 % 정도는 일반적으로 세포의 비율 보통 90% 위에서는 두 (또는 이상) 공동 electroporated transgenes (그림 3B, 왼쪽) 6,8를 공동 표현으로 transgene (들)을 표현 15. apoptosis (ca. 2.0-2.5 %)의 최소 레벨이 electroporation에서 약 2 시간 후 관찰 할 수 있지만,이 값은 약 6 시간 후 생리 레벨 (ca. 0.5-1.0 %) (FC, 게시되지 않은 데이터)으로 돌아갑니다. 수술로 인해 죽어 배아 나 임신 쥐의 비율 (&lt;5 %) 일반적으로 무시할 수 있습니다. 이러한 상황에서 cd​​k4/cyclinD1과 공동 electroporation 4 다음개발 8 시간 30 %로 신경 전구의 확장 (오른쪽 그림 3B, 그리고 C) 15 증가 트리거합니다. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4093/4093fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. cdk4/cyclinD1 overexpression에 의해 신경 progenitors의 확장. 24시간 배아 일 13 살 GFP 및 RFP plasmids과 electroporation 후 마우스 배아의 측면 피질을 통해 섹션의 (A) 형광 그림. (B) 기초 전구 마커 Tbr2에 대한 cdk4/GFP 및 cyclinD1/RFP plasmids과 immunolabeling과 공동 electroporation 후 48 시간으로 형광등 사진. DAPI counterstainig (왼쪽)와 Tbr2과 형광 기자 (오른쪽) 표시됩니다. 와 subventricular 영역의 경계 (SVZ, 노란색 점선) 선은 심실 영역의 꼭대기 표면 (흰색 라인 VZ)을 나타냅니다. 증가 생을 확인합니다증가 생성 및 cdk4/cyclinD1의 overexpression 후 기저 progenitors의 확장으로 인해 피질의 electroporated 부분 (흰색 화살촉)에 SVZ의 ckness. P &lt;0.05; N = 3 (C) 효과의 정량화는 B. 바 = SD에 표시. C에서 막대 그래프는 랭 외., 2009 15에서 가져옵니다. <ol start="2"><li> 후 바이러스 stereotaxic 사출, CA. 운영 마우스의 80 %는 전체 이가있는 이랑을 통해 transgenes의 강력한 표현을 표시합니다. GFP의 제정 표현은 쉽게 수술 후 가능한 한 빨리 사일 등 40 μm 섹션에서 발견 할 수 있습니다. 이가있는 이랑의 뱃 부리 장식이있는 - 투 - 꼬리 축을 따라 셀 10-30 %는 (CA 총. 10,000-30,000 세포에 해당) 일반적으로 transgene (들) (그림 4A) 9을 표현. 때문에 수술에 죽어 마우스의 비율 (&lt;5 %) 무시할 수 있습니다. 이러한 조건에서 cd​​k4/cyclinD1의 세 가지 주 overexpression은 끝으로 NSC 증가 트리거 두-폴드 (그림 4B) 9 70 % (그림 4C)에 의해 neurogenesis 감소하는 반면. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4093/4093fig4.jpg" alt="그림 4" /> 4 그림. 바이러스 감염의 효과. 해마의 뱃 부리 장식이있는 - 투 - 꼬리 축을 따라 40 μm 두께의 시리얼 코로나 섹션 (1마다 6 수집)에서 찍은 7 형광 사진의 (A) 3D 재건. GFP + 감염된 세포 (녹색)과 이가있는 이랑의 DAPI 핵 염색 (파란색)이 (위) 표시됩니다. A (중간)와 (, 앨런 뇌 아틀라스에서 수정 녹색 pseudocolor으로 강조 해마와 대뇌 반구 전체의 3D 표현 (하단)에 나타난에 해당하는 코로나 섹션의 시야 사진 <a href="http://www.brain-map.org" target="_blank">www.brain-map.org</a> ) . 흰색 화살표는 분사의 사이트를 가리 킵니다. 측면 (L), 뱃 부리 장식이있는 (R), 그리고 가졌염 (D) 축 (X, Y 및 Z 좌표 stereotaxic) (오른쪽) 표시됩니다. nestin + NSC (B)와 DCX + GFP의 인구 내에서 신생아 뉴런 (C) + 삼주 stereotaxic GFP (흰색) 또는 cdk4/cyclinD1/GFP의 주입 (검은 색) 바이러스에 감염된 후 세포의 (B와 C) 비율. 바 = SD, P &lt;0.005, N = 3. B와 C에서 그래프 Artegiani 외., 2011에서 발췌.

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Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

체세포 줄기 세포의 확장을 제어하는​​ 것은 자신의 연구와 치료에 사용 hampering 결정하는 주요 요인입니다. 여기 시간적 마우스 뇌에서 생성 된 뉴런의 수를 증가하는 데 사용할 수있는 개발 및 성인기 동안 신경 줄기 세포 확장을 제어 할 수있는 시스템을 설명합니다.

의 배아와 성인 신경 줄기 세포의 확장<em&gt; 자궁에</em&gt; Electroporation 또는 바이러스 성 Stereotaxic 주입

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

expansion-embryonic-adult-neural-stem-cells-utero-electroporation-or

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

16.7K 조회수.  DFG - Research Center and Cluster of Excellence for Regenerative Therapies Dresden, Germany. 체세포 줄기 세포의 확장을 제어하는​​ 것은 자신의 연구와 치료에 사용 hampering 결정하는 주요 요인입니다. 여기 시간적 마우스 뇌에서 생성 된 뉴런의 수를 증가하는 데 사용할 수있는 개발 및 성인기 동안 신경 줄기 세포 확장을 제어 할 수있는 시스템을 설명합니다.

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Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

절연 및 Neurosphere 어세를 사용하여 성인 마우스 신경 줄기 세포의 확장

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

연구

신경과학

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

마우스 망막 신경절 세포 Transfection로 생체내에 Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

배아 Murine 신경 튜브에서 신경 크레스트 세포의 분리 및 문화

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the use of IUE for investigating behavior or neuropathology in the adult brain has been limited by insufficient methods for monitoring of IUE transfection success by non-invasive techniques in postnatal animals. 
 For the present study, E16 rats were used for IUE. After intraventricular injection of the nucleic acids into the embryos, positioning of the tweezer electrodes was critical for targeting either the developing cortex or the hippocampus. 
 Ventricular co-injection and electroporation of a luciferase gene allowed monitoring of the transfected cells postnatally after intraperitoneal luciferin injection in the anesthetized live P7 pup by in vivo bioluminescence, using an IVIS Spectrum device with 3D quantification software. 
 Area definition by bioluminescence could clearly differentiate between cortical and hippocampal electroporations and detect a signal longitudinally over time up to 5 weeks after birth. This imaging technique allowed us to select pups with a sufficient number of transfected cells assumed necessary for triggering biological effects and, subsequently, to perform behavioral investigations at 3 month of age. As an example, this study demonstrates that IUE with the human full length DISC1 gene into the rat cortex led to amphetamine hypersensitivity. Co-transfected GFP could be detected in neurons by post mortem fluorescence microscopy in cryosections indicating gene expression present at &ge;6 months after birth.
 We conclude that postnatal bioluminescence imaging allows evaluating the success of transient transfections with IUE in rats. Investigations on the influence of topical gene manipulations during neurodevelopment on the adult brain and its connectivity are greatly facilitated. For many scientific questions, this technique can supplement or even replace the use of transgenic rats and provide a novel technology for behavioral neuroscience.

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Genes can be manipulated during development of the cortex or the hippocampus of the rat via in utero electroporation (IUE) at E16, to enable fast and targeted modifications in neuronal connectivity for later studies of behavior or neuropathology in adult animals. Postnatal in vivo imaging for control of IUE success is performed by bioluminescence of activating co-transfected luciferase.

몸에 붙이기 형질 전환 쥐의 발생에 의해<em&gt; 자궁 내</em&gt; 일렉트로 및<em&gt; 생체 내</em&gt; 생물 발광 상영

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central nervous system. We demonstrate a stereotaxic injection technique that allows targeted gene expression or silencing in the dorsal horn of the mouse spinal cord. The surgical procedure is brief. It requires laminectomy of a single vertebra, providing for quick recovery of the animal and unimpaired motility of the spine. Controlled injection of a small vector suspension volume at low speed and use of a microsyringe with beveled glass cannula minimize the tissue lesion. The local immune response to the vector depends on the intrinsic properties of the virus employed; in our experience, it is minor and short-lived when a recombinant adeno-associated virus is used. A reporter gene such as enhanced green fluorescent protein facilitates monitoring spatial distribution of the vector, and the efficacy and cellular specificity of the transfection.

Viral vectors allow for targeted gene manipulation. We demonstrate a method for conditional gene expression or ablation in the mouse spinal cord, using stereotaxic injection of a viral vector into the dorsal horn, a prominent site of synaptic contact between primary somatosensory afferents and neurons of the central nervous system.

마우스 척추 조건부 유전자 조작을위한 바이러스 성 벡터의 Stereotaxic 주입

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the stem cell community. Many current expansion methods are laborious and costly, and those involving complete dissociation may cause several stem and progenitor cell types to undergo differentiation or early senescence. To overcome these problems, we have developed an automated mechanical passaging method referred to as &#8220;chopping&#8221; that is simple and inexpensive. This technique avoids chemical or enzymatic dissociation into single cells and instead allows for the large-scale expansion of suspended, spheroid cultures that maintain constant cell/cell contact. The chopping method has primarily been used for fetal brain-derived neural progenitor cells or neurospheres, and has recently been published for use with neural stem cells derived from embryonic and induced pluripotent stem cells. The procedure involves seeding neurospheres onto a tissue culture Petri dish and subsequently passing a sharp, sterile blade through the cells effectively automating the tedious process of manually mechanically dissociating each sphere. Suspending cells in culture provides a favorable surface area-to-volume ratio; as over 500,000 cells can be grown within a single neurosphere of less than 0.5 mm in diameter. In one T175 flask, over 50 million cells can grow in suspension cultures compared to only 15 million in adherent cultures. Importantly, the chopping procedure has been used under current good manufacturing practice (cGMP), permitting mass quantity production of clinical-grade cell products.

This protocol describes a novel mechanical chopping method that allows the expansion of spherical neural stem and progenitor cell aggregates without dissociation to a single cell suspension.&#160; Maintaining cell/cell contact allows rapid and stable growth for over 40 passages.

인간의 신경의 집계의 cGMP-해당 확장 방법은 줄기 및 전구 세포는 다 능성 줄기 세포 또는 태아 뇌 조직에서 파생 된

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

마우스 뇌량 밑 영역에서의 분리 및 성인 신경 줄기 세포의 문화

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.

절연 및 마우스 배아 신경 줄기 세포의 문화

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative cell replacement therapies while also creating tools to study cell fate in situ. To date, it has been possible to obtain neurons via in vivo reprogramming, but the precise phenotype of these neurons or how they mature has not been analyzed in detail. In this protocol, we describe a more efficient conversion and cell-specific identification of the in vivo reprogrammed neurons, using an AAV-based viral vector system. We also provide a protocol for functional assessment of the reprogrammed cells&#8217; neuronal maturation. By injecting flip-excision (FLEX) vectors, containing the reprogramming and synapsin-driven reporter genes&#160;to specific cell types in the brain that serve as the target for cell reprogramming. This technique allows for the easy identification of newly reprogrammed neurons. Results show that the obtained reprogrammed neurons functionally mature over time, receive synaptic contacts and show electrophysiological properties of different types of interneurons. Using the transcription factors Ascl1, Lmx1a and Nurr1, the majority of the reprogrammed cells have properties of fast-spiking, parvalbumin-containing interneurons.

This protocol aims at generating directly reprogrammed interneurons in vivo, using an AAV-based viral system in the brain and a FLEX synapsin-driven GFP reporter, which allows for cell identification and further analysis in vivo.

바이러스 벡터의 intracerebral 주입에 의해 인터뉴런으로 상주 신경교 세포의 생체 내 직접 재프로그래밍

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...

In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex by In Utero Electroporation

Manipulation of gene expression in vivo during embryonic development is the method of choice when analyzing the role of individual genes during mammalian development. In utero electroporation is a key technique for the manipulation of gene expression in the embryonic mammalian brain in vivo. A protocol for in utero electroporation of the embryonic neocortex of ferrets, a small carnivore, is presented here. The ferret is increasingly being used as a model for neocortex development, because its neocortex exhibits a series of anatomical, histological, cellular, and molecular features that are also present in human and nonhuman primates, but absent in rodent models, such as mouse or rat. In utero electroporation was performed at embryonic day (E) 33, a midneurogenesis stage in ferret. In utero electroporation targets neural progenitor cells lining the lateral ventricles of the brain. During neurogenesis, these progenitor cells give rise to all other neural cell types. This work shows representative results and analyses at E37, postnatal day (P) 1, and P16, corresponding to 4, 9, and 24 days after in utero electroporation, respectively. At earlier stages, the progeny of targeted cells consists mainly of various neural progenitor subtypes, whereas at later stages most labeled cells are postmitotic neurons. Thus, in utero electroporation enables the study of the effect of genetic manipulation on the cellular and molecular features of various types of neural cells. Through its effect on various cell populations, in utero electroporation can also be used for the manipulation of histological and anatomical features of the ferret neocortex. Importantly, all these effects are acute and are performed with a spatiotemporal specificity determined by the user.

Presented here is a protocol to perform genetic manipulation in the embryonic ferret brain using in utero electroporation. This method allows for targeting of neural progenitor cells in the neocortex in vivo.

자궁 에서 뇌포화에 의해 페렛 신피질에서 신경 전구 세포의 생체 포팅

Manipulation of gene expression in vivo during embryonic development is the method of choice when analyzing the role of individual genes during mammalian ...

의 배아와 성인 신경 줄기 세포의 확장

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