마우스 뇌의 면역 -히스토케미칼 염색은 신경 과학 연구에서 일반적으로 사용되는 기술입니다. 그러나, 품질, 신뢰성, 그리고 뇌 역사 학 결과의 재현성은 다른 연구자와 실험실 중 다를 수 있습니다. 우리는 재현 가능하고 신뢰할 수 있으며 효율적인 것으로 입증 된 마우스 뇌의 조직학 연구를위한 확립 된 방법론을 제시합니다.
절차를 입증하는 데 도움이 박사 춘메이 왕, 내 실험실에서 조교수 8 ~ 16 주 오래된 C57 검은 / 6J 마우스에서 성공적인 마취를 확인 한 후, 거품 보드에 마우스를 수정하고 흉부와 복부를 통해 중간라인을 따라 세로 피상 절개를 한 다음 복부의 복부에 피부를 옆으로 이동합니다. 다음으로, 간과 창자를 노출하는 근육 층에 절개를합니다. 그런 다음 가위를 사용하여 흉곽을 잘라 흉곽을 열고 심장과 폐를 노출시하십시오.
혈전성 집게를 사용하여 흉곽을 옆으로 당겨 작업 영역을 넓힙니다. 다음. 관류 캐뉼라를 배치하려면 무딘 캐뉼라로 왼쪽 심장 심실을 직접 침투하여 오름차순 대동맥에 조심스럽게 삽입하십시오. 칸누라와 결합된 튜브를 폼 보드에 부착하여 관류 중에 캐뉼라를 제자리에 고정시키고 혈액이 순환에서 유출될 수 있도록 올바른 아트리움을 절단합니다.
식염수의 경우 식염수 압력 스위치를 켜고 식염수 40 ~60 밀리리터로 마우스를 트랜스카디어로 퍼프합니다. 오른쪽 아트리움에서 유출과 간 의 색상을 밀접하게 관찰하십시오. 다음으로, 포르말린을 견딜 수 있도록 식염수 압력 스위치를 끄고 포르말린 압력 스위치를 켜서 10% 중성 버퍼링 포멀린의 40 밀리리터로 마우스를 견딜 수 있다.
떨림의 증거를 위해 동물의 팔다리를 관찰하십시오. 뇌 격리를 위해 가위를 사용하여 머리를 제거하고 정각을 따라 중간 선 절개를하여 두개골을 노출한 다음 피부와 근육 부착물을 다듬습니다. 다음으로, 궤도 능선에서 잘라 내고 홍채 가위의 날카로운 끝을 포멘 매그넘에 놓습니다.
두개골의 내부 표면을 따라 가위를 전진시키고 뇌의 손상을 피하기 위해 위쪽으로 압력을 유지합니다. 그런 다음 열린 두개골에서 뇌를 제거하기 전에 정수리및 정면 뼈와 수막을 조심스럽게 제거합니다. 드라이 아이스를 슬라이딩 마이크로톤의 높이 조절 플레이트 위에 놓고 흰 서리가 보일 때까지 기다린 다음, 자당이 얼어 붙은 후 단단한 베이스 층을 형성하기 위해 접시 위에 30% 자당 5밀리터를 조심스럽게 퍼뜨립니다.
다음으로, 모든 뇌 샘플을 30% 자당 500 마이크로리터로 자당 기지 위에 수평으로 놓습니다. 5~10분 후에 뇌가 단단하고 하얗게 변하면 원하는 층이나 부위에 도달할 때까지 뇌를 다듬고 트림 모드에서 사료 모드로 전환하고 뇌 조직을 절개하여 25마이크로미터 두께의 단면을 생성합니다. 다음으로, PBS로 채워진 48웰 플레이트를 준비하고 마우스 뇌 1개를 위한 5개의 우물을 표시합니다.
페인트 브러시를 사용하여 한 섹션을 수집하고 하나의 섹션에 잘 넣은 다음 동일한 마우스의 후속 섹션을 수집하고 두 번째 에 잘 배치합니다. 다섯 번째 우물이 첫 번째에서 다섯 번째에 섹션 6 ~ 10을 배치 할 때까지 절차를 반복하십시오. 세포 스트레이너를 PBS로 채워진 6웰 세포 배양 판의 한 웰에 넣고 페인트 브러시를 사용하여 한 일련의 뇌 섹션을 세포 여과기에 옮습니다.
셀 스트레이너를 셰이커에 PBS로 잘 채워진 다른 부분으로 이송하여 PBS에서 이러한 섹션을 헹구세요. 그런 다음, 세포 스트레이너에서 뇌 섹션을 비오틴 라벨 WFA 의 1 밀리리터를 포함하는 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고 하룻밤 사이에 50 RPM의 흔들 플랫폼에 배양합니다. 다음 날, 이전에 입증 된 바와 같이 PBS와 뇌 섹션을 헹구고, 다음 스트렙타비딘 일광 488 솔루션의 1 밀리리터를 포함하는 튜브로 섹션을 전송하고 흔들 플랫폼에서 2 시간 동안 배양.
다시 PBS와 뇌 섹션을 헹구고, 2 시간 동안 버퍼를 차단에 그들을 배양, 흔들 플랫폼에 하룻밤 기본 항체에 잠복 다음. 다음 날, PBS 헹구기 다음, 2 시간 동안 이차 항체의 섹션을 배양. 페트리 요리 2개를 100밀리리터의 PBS로 채우고, 한 여과기에서 첫 번째 요리로 모든 뇌 섹션을 옮킨다.
코달에서 장밋빛에 신경 해부학 순서의 뇌 섹션을 정렬합니다. 그런 다음 한 슬라이드를 스탠드로 약간 기울어 두 번째 접시에 담그고 미세 한 페인트 브러시를 사용하여 공기 버퍼 인터페이스 바로 아래에 뇌 섹션을 기울인 슬라이드에 부드럽게 놓습니다. 다음으로, 전달 파이펫을 사용하여 완충을 천천히 부드럽게 제거하여 뇌 단면도가 공기 버퍼 인터페이스 위에 완전히 올라갈 때까지 레벨을 낮춥춥다.
슬라이드의 맨 아래에 도달하고 모든 섹션이 슬라이드에 장착될 때까지 이 프로세스를 계속 반복합니다. 이미징의 경우 스캐너와 컴퓨터를 켜고 슬라이드홀더에 로딩 장치로 슬라이드를 배치하고 홀더를 스캐너에 삽입합니다. 스캐너용 소프트웨어를 열고 적절한 저장소 위치 및 스캐닝 프로파일을 선택합니다.
미리 보기 시작 스캔 버튼을 클릭하여 미리 보기 스캔을 시작합니다. 스캔 후 조직 검출 마법사를 열고 이미징에 대한 관심 영역을 동그라미로 이동합니다. 이미징을 위한 영역을 선택한 후 시작 스캔 버튼을 클릭하고 컴퓨터가 스캔을 완료할 때까지 기다립니다.
결과 파일을 확인하고 이미지를 내보냅니다. 여기에 표시된 브레그마-네거티브 0.82 밀리미터에서 관상 마우스 뇌 섹션의 대표적인 형광 면역-조직화학 이미지, 등나무 플로리분다 agglutinin, 아르기닌 바소프레신 및 DAPI의 분포를 표시. 와이스테리아 플로리분다 agglutinin 신호는 전방 시상 하부 및 망상 핵의 perifornical 영역에서 관찰 되는 반면, 아르기닌 혈관 핵에서 관찰 되는 반면.
처음으로이 프로토콜을 시도 할 때, 우리는 경험이 풍부한 연구원의 감독하에 수행하는 것이 좋습니다. 이 프로토콜은 다른 연구자와 실험실 사이에서 최적이고 일관된 조직학적 결과를 생성하는 데 도움이 되며, 이 기술을 배우는 초보자를 위한 참고 자료로 사용될 것입니다.
