이 문서는 M. 씨흐에 학부 학생 연구 보너스로 G.의 부모와 FRSQ하는 장학금으로 NSERC 부여 # 299280, IRSST에 의해 지원되었다. 우리는 비디오 기록 조작을 수행하기위한 Yoan 르뮤 - Laneville 감사합니다.

<html> 전에 어떤 조작에, 당신이 실시하는 실험을하고 처분의기구에 따라 사용되는 힘줄의 그룹을 식별해야합니다. 우리의 목적을 위해, 복부 힘줄은 단면적을 측정하여 생물 반응기 챔버에 그들을 맞는 경우 조작하기 때문에 쉽게 그들이 작은되기 때문에 선정되었다. 모든 악기가 autoclaved 또는 70 % 에탄올로 소독되는주의하시기 바랍니다. 또한, 70 % 에탄올을 포함하는 스프레이 병은 각 작업 전에 경험 장갑을 소독하기 위해 각 작업 역 옆에 배치됩니다. 1 부 : 추출 절제술 후, 꼬리는 신중하게 조직 손상을 방지하기 위해 사지에 의해 조작할 수 있습니다. 또한, 세포 생존을 보존하기 위해 모든 조작은 차가운 생리 식염수에 실시하고 있습니다. 1A) 자료 : <ul><li> 차가운 생리 식염수 (D - PBS) </li><li> 얼음 조각 </li><li> 표면 보호 </li><li> 보드를 절단 </li><li> 개별 조작 플레이트 </li><li> 2 500 ML 요리 </li><li> 이 2L 유리 요리 </li><li> 접착제 테이프 </li><li> 1 족집게 </li><li> 1 포셉 </li><li> 1 족집게는 서 </li><li> 외과 가위 1 쌍 </li><li> 1 메스 </li><li> 외과 가위 1 쌍 <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 오리 엔테이션 식별 개별 조작 ( &quot;근위&quot;를 &quot;P&quot;) </li></ul> 1B) 워크 스테이션 : <ol><li> 표면 보호를 펴고 위에 도마를 놓습니다. </li><li> 얼음 조각과 함께 중간 각이 큰 유리 접시를 입력하고 종이에 그들을 놓으십시오. </li><li> 조작 판의 모서리에 테이프 조각을 막대기와 근위 끝을 나타내는 문자로 식별합니다. </li><li> 차가운 생리 식염수와 함께 중간에 두 개의 작은 유리 요리와 조작 판의 홈을 입력합니다. 얼음이 들어있는 대형 유리 접시에 놓으십시오. </li><li> 표면 보호의 모든 멸균 악기를 구성합니다. </li><li> 생리 식염수가 들어있는 유리 접시 중 하나에 꼬리를 전송합니다. </li></ol> 1C) 노는 : <ol><li> 등의 측면에서 복부 측면을 구별하는 꼬리의 근위 끝에 해부학을 준수. 복부 측면은 힘줄의 큰 번호와 부드럽게 혈액의 작은 방울을 생산하기 위해 꼬리를 당기고하여 확인할 수 혈관 있습니다. </li><li> 당신이 복부 힘줄을 (또는 지느러미 힘줄이​​ 필요하면 복부 쪽 함께) 추출하려는 경우 수술 가위를 사용하여 꼬리 지느러미의 측면을 따라 피부를 잘라. </li><li> 근위 끝에 절개를 열고 조심스럽게 꼬리 끝부분을 조작하여 포셉 또는 손가락을 사용하여 피부를 제거합니다. </li><li> 생리 식염수에 혈액과 머리를 씻어 신선한 솔루션을 포함하는 나머지 유리 접시에 시료를 전송합니다. 장갑을 변경합니다. 가벼운 현미경 아래에서 볼 횡단하는 섹션은 여섯 힘줄이 그룹을 보여줍니다. 각 그룹에서 하나의 힘줄은 각 척추골의 꼬리 끝에 연결된, 그래서 우리는자를 따​​라 새로운 힘줄을 폭로하기 위해 척추 디스크에 상처입니다. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 가벼운 현미경 아래에서 볼 쥐의 꼬리 횡단하는 섹션을 참조하십시오. </li><li> 수술 가위로 짧게 연골 2-3 척추를 통해 말초 끝부분을 잘라 버릴거야. 메스 후 즉시 솔루션에 대체를 사용하여 부드러운 조직을 잘라 도마에 꼬리를 놓습니다. </li><li> 족집게를 사용하여 말초 꼬리 끝에서 하나 힘줄이 밖으로 당기십시오. </li><li> 양쪽 끝에 부드러운하라, 개별 조작 판에 힘줄이 장소. 더 이상의 힘줄이 밖으로 조롱 수 없습니다 때까지 마지막 두 단계를 반복하고 새로운 조직이 노출해야 할 때마다 한 번 척추뼈 짧은 컷. </li></ol> 2 부 : 단면적 측정 7 조직이 기계적 특성이나 자극을 겪습 때, 그 기계적 성질은 스트레스에 힘줄 내부의 힘을 정규화에 의해 설명되어 있습니다. 이것은 우리가 단면적을 평가하는 이유입니다. 2A) 자료 : <ul><li> 광학 미크롬터 </li><li> Stereomicroscope </li><li> 디지털 카메라 </li><li> 가장자리 인식 및 프로필 재건 알고리즘 5,6 </li><li> 차가운 생리 식염수 (D - PBS) </li><li> 1 20 - 200μL 마이크로 볼륨 피펫 </li><li> 광 마이크로 미터 조정 1 헥스 키 </li><li> 이 족집게 / files/ftp_upload/2176/2176fig3.jpg &quot;고도 =&quot;그림 3 &quot;/&gt; 그림 3. 옵틱 미크롬터 </li></ul> 2B) 워크 스테이션 : <ol><li> 소프트웨어 (디지털 카메라 및 알고리즘)을 엽니다. </li><li> 장치에있는 힘줄이 로드할 충분한 공간이 있도록 광학 마이크로 미터를 놓습니다. </li><li> 악기와 손 가까이에 압축을 푼 힘​​줄을 포함하는 유리 그릇을 구성합니다. </li></ol> 2C) 노는 : <ol><li> 두 앵커 시스템이 변할 때까지 차가운 생리 식염수로 측정 구획을 입력합니다. </li><li> 족집게로 끝을 잡고하여 짐칸에 힘줄이 전송합니다. </li><li> 마이크로 피펫을 통해 볼륨 흡입을 사용하여 실리콘 튜브로 한 번에 하나의 끝단을 가져옵니다. 끝이 축 체포 초과하기 전까지 대기음. </li><li> 튜브를 압축하고 stereomicroscope 아래에있는기구를 설치하는 샤프트 체포를 조이십시오. </li><li> 주름이 더 이상 지각할 수 없을 때까지 조직을 관찰하면서 105X 확대에 힘줄을 스트레칭. 추가 0.40 %의 스트레치. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4. 전에 105x 확대하고 스트레칭 후 텐든 프로젝션. </li><li> 위치를 조정하고 180 ° 회전 위에 힘줄의 깨끗한 이미지를 유지하는 데 중점을 둡니다. </li><li> 긴장, 초점이나 위치를 수정하지 않고 모든 10 ° 회전에서 사진을 가져가라. 회전을 수행에만 로터리 축을를 사용합니다. 의 콘 모양으로 인해, 다음 단계는 힘줄 따라 서로 다른 지점에서 반복될 수 있습니다. </li><li> 당신은 등록한 데이터베이스를 분석하기 위해 가장자리의 인식 및 프로필 재건 알고리즘을 활성화합니다. </li><li> 축 체포 느슨해진 및 마이크로 볼륨 피펫을 사용하여 실리콘 튜브에 공기를 불어로 힘줄이 무료입니다. </li><li> 다시 종료하여 처리, 조작 판에 힘줄이 다시 삽입. </li><li> 얻은 프로필 재건과 단면적의 가치의 모양을 확인합니다. </li></ol> 파트 3 : Rinsing 이전 조작 중 발생했을 수 오염을 제거하려면, 조직은 biosafety 캐비닛 아래에 씻어서 있습니다. 3A) 자료 : <ul><li> 차가운 생리 식염수 (D - PBS) </li><li> 여러 홈 조작 플레이트 </li><li> 개별 조작 플레이트 </li><li> 접착제 테이프 </li><li> 이 족집게 </li><li> 1 족집게는 서 </li></ul> 3B) 워크 스테이션 : <ol><li> 사전에 biosafety 캐비닛 15 분 팬의 전원을 켜고 70 %의 에탄올과 내부 표면을 청소하십시오. </li><li> biosafety 캐비닛 내부의 모든 악기를 가져와. </li><li> 근위 끝을 확인하기 위해 각 플레이트의 모서리에 테이프의 조각 스틱. </li><li> 멸균 생리 식염수와 함께 홈을 입력합니다. </li></ol> 3C) 노는 : <ol><li> 캐비닛에서 추출한 힘줄이있는 조작 판을 소개합니다. </li><li> 족집게를 사용하여, 각 엔드에 부드러운 이해와의 판에서 힘줄을 제거하십시오. </li><li> 젖어도하고 부드럽게 가장 가까운부터 그리고 멀리 홈으로 진행, 여러 홈 조작 판의 각 구역의 생리 식염수에 힘줄이 저어. </li><li> 마지막으로, 잠수함 개별 조작 판에있는 힘줄. </li></ol> 4 부 : 생물 반응기 챔버로 로딩 추가 오염을 피하기 위해 다음과 같은 조작도 biosafety 캐비닛에 실시하고 있습니다. 4A) 자료 : <ul><li> 생물 반응기 챔버 4 </li><li> 무균 앵커 </li><li> 1 무균 배양 접시 </li><li> 콜드 세포 교양 중간 (DMEM) </li><li> Cyanoacrylate </li><li> 이 족집게 </li><li> 핀셋은 서 </li><li> 0.5 - 10μl 마이크로 피펫 볼륨 </li><li> 1 눈금자 <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig5.jpg" alt="그림 5" /> 그림 5. 생물 반응기 챔버 </li></ul> 4B) 워크 스테이션 : <ol><li> 이전 단계도 biosafety 캐비닛에 실현 이래 불필요한 도구 제거는 더 많은 작업 공간을 제공할 것입니다. </li><li> 캐비닛 안에 다른 모든 악기를 가져와. </li></ol> 4C) 노는 : <ol><li> 힘줄 말단을 통해 중심과 조직을 상처의 스풀과 스풀 주위 조작 판에 닻을 놓으십시오. </li><li> 닻을 구르고 조직이 앵커에 연결된 숙박 있도록 동안 느슨한 말단 들어요. 이후 어 회전 중지합니다. </li><li> 같은 수행다른 쪽 끝을과 단계를 반복합니다. </li><li> 그들의 센터 1 사이의 6cm가있을 때까지 동등 이상의 두 앵커를 롤. </li><li> 솔루션에 젖어하고 고정 섹션의 기계적 성질 2-3 향상을 간략하게 건조 수 있도록 힘줄이 느슨하게. </li><li> 페트리 접시에 붓고 cyanoacrylate 및 마이크로 피펫으로 볼륨 2.5μL를 그립니다. </li><li> 생리 식염수에 접착제를 포기하지 않고 상처 접속 조직 cyanoacrylate의 드롭을 적용합니다. 이 방울은 각 앵커에 적용 때까지 반복합니다. </li><li> 힘줄이 아직 완전히 포장되어로 완전히 건조 접착제 5 분 동안 기다리십시오. </li><li> 이 기간 동안 생리 식염수와 챔버 구획을 작성하십시오. </li><li> 손상을 방지하기 위해 생리 식염수 모든 조직을 Rehydrate. </li><li> 단지 앵커를 조작함으로써, 생물 반응기 챔버에 힘줄이 전송 및 전송 중에 누출 및 오염을 방지하기 위해 그것을 닫습니다. </li></ol> 제 5 부 : 대표 결과 : 프로토콜의 결과가 제대로 수행되면, 우리의 조직​​ 엄격한 격리와 준비 절차는 조직 불임, 생존과 무결성을 유지하는 것이 가능하게 보여준다. 먼저, 간단하고 반복적인 추출 방법을 사용하여, 우리는 그것이 추출 후 깨달은 H &amp; E 오염된 부분의 미세한 분석하여 관찰 할 수있는 콜라겐 네트워크를 손상하지 않고 꼬리 힘줄을 추출할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig6.jpg" alt="그림 6" /> 그림 6. 추출 후 텐든 콜라겐 네트워크 (H &amp; E 물들일 5μm 세로 섹션). 십 일 실시 불임 검사 위해 우리는 다음 교양 힘줄. 매일 우리 한천에 도금 사용 문화 솔루션과 24 시간 동안 그것을 incubated. 어떤 박테리아 성장이 관찰되지 이래, 우리는 우리 노는 오염 발생하지 않는 결론을 내렸다. 프로필 재건 알고리즘과 광 마이크로 미터로, 우리는 오류 7 2 %의 마진 내에서 단면적을 계산하실 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig7.jpg" alt="그림 7" /> 그림 7. RTT의 프로필 재건. 마지막으로, 우리는 rinsing 단계 이후 12 일 문화 기간 이후 포유류의 세포에 대한 죽은 / LIVE 생존 / 세포 독성 키트를 사용하여 가능성을 평가. 녹색 형광 라이브 세포의 대다수가 분명하고 있기 때문에, 우리는 격리 절차는 살아있는 조직을 보존 성공적으로되었는지 확인할 수 있습니다. 동일한 시험은 생물 반응기 챔버에 힘줄이 부착 후 두 시간 수행되었다. 우리는 앵커의 탈수와 접착제가 모두 앵커 사이의 조직에 전염되지했다고 확인했습니다. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig8.jpg" alt="그림 8" /> 그림 8. 앵커에서 조직 생존 (녹색 = 라이브 세포, 빨강 = 죽은 세포)

<ol>
	<li>Bennett, M. B., Ker, R., Dimery, N., Alexander, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+various+mammalian+tendons.">Mechanical properties of various mammalian tendons.</a> J. Zool. Lond. A209, 537-548 (1986).</li><li>Dupuis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> D&#233;shydratation de matrices collag&#233;niques reconstruites in vitro: effets sur les propri&#233;t&#233;s m&#233;caniques et histologiques [dissertation]. , 114-114 (1981).</li><li>Haut, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+influence+of+strain+rate+on+the+tensile+failure+of+rat+tail+tendon.">Age-dependent influence of strain rate on the tensile failure of rat tail tendon.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 105, 296-299 (1983).</li><li>Hupp&#233;, N., Lessard, J. -. L., Langelier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Bioreactor+Design+for+the+Mechanobiological+Study+of+Soft+Tissue+Damage+and+Repair+in+Conditions+that+Provide+the+Best+Approximation+of+Actual+Use.">A Bioreactor Design for the Mechanobiological Study of Soft Tissue Damage and Repair in Conditions that Provide the Best Approximation of Actual Use.</a> , (1985).</li><li>Langelier, E., Dupuis, D., Guillot, M., Goulet, F. &. a. m. p. ;. a. m. p., Rancourt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-sectional+profiles+and+volume+reconstructions+of+soft+tissues+using+laser+beam+measurements.">Cross-sectional profiles and volume reconstructions of soft tissues using laser beam measurements.</a> J Biomech Eng. 126, 796-802 (2004).</li><li>Lee, T. Q., Woo, S. L. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+determining+cross-sectional+shape+and+area+of+soft+tissues.">A new method for determining cross-sectional shape and area of soft tissues.</a> J Biomech Eng. 110, 110-114 (1988).</li><li>Parent, G., Cyr, M., Cousineau-Pelletier, P., Desbiens-Blais, F. &. a. m. p. ;. a. m. p., Langelier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Techniques+for+the+Evaluation+of+Cross-Sectional+Area+in+Rat+Tail+Tendons+Generate+Significant+Errors.">Current Techniques for the Evaluation of Cross-Sectional Area in Rat Tail Tendons Generate Significant Errors.</a> , (1985).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이러한 실험 절차를 적용하여, 우리는 조직의 종류에 체외 연구에서 다양한 수행할 수 있습니다. 예를 들어 마찬가지로, 조직 변성에 대한 연구는 십일 동안 RTTs에 밑을 자극의 응용 프로그램에 의해 실시되었다. 매일, 우리는 비파괴 응력 완화 시험에서 조직 기계적 특성을 평가했다. 끝에, 우리는 RTT 스트레스 변화를 관찰하기 때문에 기계적 성질의 진행을 분석할 수 있었다. <p class="jov...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>D-PBS </td>
<td>Reagent</td>
<td>Wisent inc.</td>
<td>311-410-CL</td>
<td>Saline solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Glucose </td>
<td>Reagent</td>
<td>Wisent inc. </td>
<td>609-037-EL </td>
<td>Saline solution
 1g/L</td>
</tr>
<tr>
<td>Antibiotics-antimycotics </td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen Corp.</td>
<td>15240-062 </td>
<td>Saline solution
 1%</td>
</tr>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen Corp.</td>
<td>12800-017</td>
<td>Culture solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium Bicarbonate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Wisent inc.</td>
<td>600-105-CG</td>
<td>Culture solution 3.7g/L</td>
</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Wisent inc.</td>
<td>090150</td>
<td>Culture solution 10%</td>
</tr>
<tr>
<td>Antibiotics-antimycotics</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen Corp.</td>
<td>15240-062</td>
<td>Culture solution 1%</td>
</tr>
<tr>
<td>Optic Micrometer</td>
<td>Tool</td>
<td>Custom-made</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Manipulation plate</td>
<td>Tool</td>
<td>Custom-made</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bioreactor chamber</td>
<td>Tool</td>
<td>Custom-made</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

preparation of rat tail tendons for biomechanical and mechanobiological studies

쥐 꼬리 힘줄 (RTTs)은 힘줄 생리학과 tendinopathy의 분야에서 체외 연구에서 실험에 사용되는 일반적인 생물 학적 모델입니다. 그 조직과 함께 일하는 것은 그들이 매우 연약하기 때문에 도전하고, 지금까지 자신의 격리에 대한 엄격한 세부 프로토콜이 없었다합니다. 이러한 도전에 직면하여, 우리는 RTTs 및 제어 조직 생존, 불임과 정직의 조작을 용이하게하는 방법과 악기를 개발했습니다. 이 문서 biomechanical 및 mechanobiological 연구 RTTs를 준비하는 데 사용되는 실험 절차를 설명합니다. 추출, 단면적 측정이 rinsing 및 생물 반응기 챔버로 로딩 : 우리 작품은 네 가지 주요 단계로 나뉘어져 있습니다. 그들이 쉽게 복제 수 있도록 각 단계에서 모든 절차, 자료 및 조작이 상세하게 제공됩니다. 또한 개발, 특정 악기 소개하는 부분이있다 : RTTs를 분리하는 데 사용되는 조작 판은 단면적 측정 및 고정 시스템 동안 조직을 위치 광학 마이크로 미터는 생물 반응기에 RTTs를 첨부합니다. 마지막으로, 우리는 방법의 유효성을 검사하기 위해 여러 검사 후 얻은 결과를 설명합니다. 생존, 불임 및 무결성 평가는 우리와 같은 절차가 쥐의 꼬리 힘줄과 같은 연약한 조직의 조작에 대해 충분히 엄격한 것을 보여줍니다.

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Preparation of Rat Tail Tendons for Biomechanical and Mechanobiological Studies

이 문서 biomechanical 및 mechanobiological 연구 쥐의 꼬리 힘줄을 준비하는 데 사용되는 실험 절차를 설명합니다. 준비의 주요 단계 몇 가지 기능은 rinsing 및 생물 반응기 챔버로 로딩, 추출, 단면적 측정으로 시작, 시연하고 있습니다.

Biomechanical 및 Mechanobiological 연구 랫 타일 힘줄의 준비

Rat tail tendons (RTTs) are a common biological model used in experimental in vitro studies in the fields of tendon physiology and tendinopathy. Working ...

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Research

JoVE Journal

Biology

16.8K 조회수.  Université de Sherbrooke. 이 문서 biomechanical 및 mechanobiological 연구 쥐의 꼬리 힘줄을 준비하는 데 사용되는 실험 절차를 설명합니다. 준비의 주요 단계 몇 가지 기능은 rinsing 및 생물 반응기 챔버로 로딩, 추출, 단면적 측정으로 시작, 시연하고 있습니다.

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Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there have been significant advances in our understanding of the functions of mitochondria other than the generation of energy. These include their role in apoptosis, acting as signalling organelles, mammalian development and ageing as well as their contribution to the coordination between cell metabolism and cell proliferation. Our understanding of biological processes modulated by mitochondria is based on robust methods for isolation and handling of intact mitochondria from tissues of the laboratory animals. Mitochondria from rat heart is one of the most common preparations for past and current studies of cellular metabolism including studies on knock-out animals.
Here we describe a detailed rapid method for isolation of intact mitochondria with a high degree of coupling. Such preparation of rat heart mitochondria is an excellent object for functional and structural research on cellular bioenergetics, transport of biomolecules, proteomic studies and analysis of mitochondrial DNA, proteins and lipids.

We describe &#1072; protocol for isolation of pure, highly coupled rat heart mitochondria for functional or structural studies of cellular bioenergetics, biophysical measurements, proteomics or mitochondrial DNA and lipids analysis.

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The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

생성중 성인 Zebrafish 테일 핀으로 Morpholinos의 생체내 Electroporation에

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

고립 된 혈액 관류 쥐 폐 준비에 단일 미세 혈관 투과성의 양을

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Preparation of Rat Serum Suitable for Mammalian Whole Embryo Culture

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.

Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.

포유류의 전체 배아 문화에 적합 쥐 혈청의 제조

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, proteins, and glucose, yet the composition of the blood is dynamically regulated and easily perturbed. One factor that can change the blood composition is the stress response triggered by the sampling procedure, which can contribute to variability in the measures of interest. Here we describe a procedure for blood sampling from the lateral tail vein in the rat. This procedure offers significant advantages over other more commonly used techniques. It permits rapid sampling with minimal pain or invasiveness, without anesthesia or analgesia. Additionally, it can be used to obtain large volume samples (upwards of 1 ml in some rats), and it may be used repeatedly across experimental days. By minimizing the stress response and pain resulting from blood sampling, measures can more accurately reflect the true basal state of the animal, with minimal influence from the sampling procedure itself.

Blood samples are useful for assessing biomarkers of physiological states or disease in vivo. Here we describe the methodology to sample blood from the lateral tail vein in the rat. This method provides rapid samples with minimal pain and invasiveness.

쥐의 측면 꼬리 정맥에서 혈액을 샘플링

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

A Two-Step Strategy that Combines Epigenetic Modification and Biomechanical Cues to Generate Mammalian Pluripotent Cells

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe a new strategy that combines the use of chemical epigenetic erasing with mechanosensing-related cues, to generate mammalian pluripotent cells. Two main steps are required. In the first step, adult mature (terminally differentiated) cells are exposed to the epigenetic eraser 5-aza-cytidine to drive them into a pluripotent state. This part of the protocol was developed, based on the increasing understanding of the epigenetic mechanisms controlling cell fate and differentiation, and involves the use of the epigenetic modifier to erase cell differentiated state and then drive into a transient high plasticity window.
In the second step, erased cells are encapsulated in polytetrafluoroethylene (PTFE) micro-bioreactors, also known as Liquid Marbles, to promote 3D cell rearrangement to extend and stably maintain the acquired high plasticity. PTFE is a non-reactive hydrophobic synthetic compound and its use permits the creation of a cellular microenvironment, which cannot be achieved in traditional 2D culture systems. This system encourages and boosts the maintenance of pluripotency though bio-mechanosensing-related cues.
The technical procedures described here are simple strategies to allow for the induction and maintenance of a high plasticity state in adult somatic cells. The protocol allowed the derivation of high plasticity cells in all mammalian species tested. Since it does not involve the use of gene transfection and is free of viral vectors, it may represent a notable technological advance for translational medicine applications. Furthermore, the micro-bioreactor system provides a notable advancement in stem cell organoid technology by in vitro re-creating a specific micro-environment that allows for the long-term culture of high plasticity cells, namely as ESCs, iPSCs, epigenetically erased cells and MSCs.

We here present a method that combines the use of chemical epigenetic erasing with mechanosensing-related cues to efficiently generate mammalian pluripotent cells, without the need of gene transfection or retroviral vectors. This strategy is, therefore, promising for translational medicine and represents a notable advancement in stem cell organoid technology.

후성유전학적 변형과 생체역학적 단서를 결합하여 포유류 다능성 세포를 생성하는 두 단계 전략

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe ...