연구는 자연 과학 및 캐나다의 공학 연구위원회에 의해 지원.

1. 소개 <ol><li> 매킨토시 연구소는 몇 년 동안 중간 gastrocnemius 근육 준비를 사용하여, 그 전에 전체 gastrocnemius 근육 준비 등 닥터 필 가디너와 함께 개발되었습니다. 1 </li></ol> 2. 마취 <ol><li> 성인 Sprague-Dawley 쥐 (200-300그램)은 일반적으로 현장에서 수축 특성에 관한 연구를 위해 우리 실험실에 사용됩니다. 쥐가 상업적으로 이용 가능한, 또는 수건으로 덮고 있으며, 잡고, 플렉시 글라스 장치에서 제한 할 수 있습니다. </li><li> 우리는 85:15에 혼합 (100 MG · ML -1, 각), xylazine / 케타민 사용하고, intramuscularly 2,3 쥐 무게 100g 당 0.1 ML를 관리 할 수 있습니다. pentobarbital (50-60 MG · kg -1, intraperiteneal) 또는 isoflurane 나트륨 (2-3.5 %, 흡입)은 4도 사용할 수 있습니다. </li><li> 마취가 적용하고있다 있지만, 정확한 무게는 획득 후 왼쪽 뒷다리 - 다리는 면도 할 수 있습니다. 이것은 또한 좋은 팀입니다전자 모​​든 전자가 켜져 있으며 준비가되어 있는지 확인해야합니다. 이 컴퓨터, 스트레인 게이지 증폭기, 오일 히터 등이 포함되어 있습니다. </li><li> 반사 반응 주기적으로 반환 확인 및 (100g 당 0.05-0.1 ml) 쇼핑은 필요에 따라 마취를 보완. </li></ol> 3. 수술을 시작 <ol><li> 우리는 수술 쥐를 고정하는 방법에 대한 플렉시 글라스 플랫폼을 사용합니다. 간단한 마스킹 테이프 작업을 수행합니다. 동물이 오른쪽 forelimb에 왼쪽 hindlimb까지 뻗어 있는지 확인합니다. 눈 윤활유 한 방울을 추가합니다. 우리는 파라핀 오일을 사용합니다. 그렇지 않으면 눈이 케타민 마취와 함께 건조합니다. </li><li> 작은 외과 빛이 유용합니다. 이 사람은 동물이 따뜻하고 유지할 수 있도록 충분한 열을 방출. 또는 물 난방 담요 사용할 수 있습니다. 하기 전에 각막이나 발가락 - 핀치 반사가없는 아르되었는지 확인하십시오. 이 절차는 급성이기 때문에 살균 기술은 필요하지 않습니다. 동물 마취에서 회복되지 않습니다. 우리는 마취와 쥐를 안락사시켜야모든 절차가 완료 과다 복용 (0.2 ML, intracardiac). </li><li> 첫 번째 절개은 뒤꿈치에서 척추 컬럼에 피부입니다. 컷의 깊이를 제어 할 수 있으며, 가위는 기본 조직에서 피부를 분리하는 데 사용되기 때문에 우리는 가위를 사용합니다. 쥐, 너무 오래 큰 혈관을 피하기로 출혈이 제한됩니다 우수한 haemostasis 있습니다. 등장 식염수 - 불린 거즈로 덮여 노출 표면, 가능한 한 유지. </li><li> 피부가 기본 결합 조직에서 분리 된 후, 표면 근육 층은 절단됩니다. 너무 깊이하지 않도록주의하십시오, 당신은 좌골 신경이나 혈관, 또는 관심있는 근육을 손상하지 않습니다. gastrocnemius 근육을 통해 시작하고 proximally 컷, 피부 절개와 같은 라인을 따라. 픽을 아래에이 좌골 신경을 찾아 방지합니다. 일단 신경을 참조하십시오, 당신은 절개와의 경로를 따라하지만, 잘 신경 이상 투숙 할 수 있습니다. 뮤스 사이에 명확한 경계선이 있습니다cles. 이를 찾아 무릎에 대한 그 경계선 따라 절개 해. 에 대한 감상과 혈관을 피할 수 있습니다. </li></ol> 4. 뼈 핀에 대퇴부에 파일럿 구멍을 준비 <ol><li> 맨 뼈를 노출 대퇴골의 꼬리 부분 이상 근육의 얇은 층을 잘라 버릴거야. 휴대용 회전 도구, 드릴, 또는 핀 부사장, (0.9 mm 탄소강 버)를 사용하여 피질을 통해 작은 파일럿 구멍을, 그리고 골수에. 너무 깊이 드릴하지 마십시오, 또는 과도한 출혈이 발생할 수 있습니다. 이 구멍은 myograph베이스에 대퇴골을 고정하기 위해 뼈 핀을 배치 나중에 사용됩니다. </li></ol> 5. 중간 gastrocnemius 근육의 innervation을 분리 <ol><li> 다음 단계는 해부 현미경이 필요합니다. 오금 신경의 안쪽 gastrocnemius 근육 뒤에 사라 장소를 찾습니다. 부드럽게 다양한 가지를 확산하고, 안쪽 gastrocnemius 근육 신경을 분포시키다하지 않는 모든 상처를 냈어. Innervation는 microstimulation에 의해 결정될 수있다. 생에서S 단계는 또한 좌골 신경의 피상적 가지가 절단되어 있는지 확인하십시오. </li><li> 이제 좌골 신경에서 떨어져 결합 조직을 취소 있으므로이 신경 즉석 (나중에)로 미끄러 할 수 있습니다. 부드럽게 신경 치료를해야합니다. 신경의 스트레칭은 inexcitability로 연결하고, 조기에 실험을 중단 할 수 있습니다. </li></ol> 6. 아킬레스의 힘줄과 gastrocnemius 근육을 분리 <ol><li> 가위에서 가끔 도움으로 무딘 절개은, 다른 조직에서 gastrocnemius 근육을 분리하는 데 사용할 수 있습니다. plantaris의 힘줄은 아킬레스의 힘줄 아래에서 꺼내 묶고 절단 할 수 있습니다. 넥타이 단지 힘줄을 보유하는 데 사용되며 힘줄이 절단되고 plantaris가 상당한 길이에 대한 gastrocnemius 근육에서 분리되어 직후 버려야 할 수 있습니다. 광장 매듭에서 # 1 실크 아킬레스의 힘줄이 주변 봉합사, 그리고 넥타이를 놓으십시오. 너무 단단히 당기지 마, 또는 힘줄이 손상됩니다. 우리는 calcan을 잘라 뼈 rongeurs를 사용하여<html> 여전히 아킬레스의 힘줄에 부착 된 뼈의 작은 조각을 남겨 eus. 뼈가 바로 힘줄,하지 절단 있는지 확인하기 수평 절단 표면을 유지. 이 아킬레스 힘줄의가 나중에 myograph에 부착 할 수 있도록합니다. </li><li> gastrocnemius의 아래쪽 함께, soleus를 볼 수 있습니다. 다시 말하지만, 무딘 절개는 gastrocnemius 근육에서 soleus 근육을 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 안쪽 gastrocnemius를 분리하고 싶은, 그래서 여전히 아킬레스의 힘줄에 연결된 유일한 근육이다. 말단부 가까이에 soleus 힘줄을 잘라 요. 그런 다음 안쪽과 측면 gastrocnemius 근육을 분리하고, 아킬레스의 힘줄에 부착 된 단지 안쪽 gastrocnemius 근육을 떠날, 측 방향 힘줄을 잘라 수 있습니다. 길이의 50 % 정도를 따라 도보로 안쪽에서 외측 gastrocnemius 근육을 당겨. 이 길이 외에도 섬유는 교차하고 손상이 더 당기는 될 것이다. 근육이 결합 조직은 무료입니다되었는지 확인하십시오. </li></ol>전자 &quot;&gt; 7. 발목 부분의 경골 잘라 <ol><li> 단지 중간 지점 위에 생크 주위에 끈을 놓으십시오. 이것은 조직으로 절단하지 않고, 꼭 있어야합니다. 매는 전에 두 번째 루프는 미끄러지는 것을 방지 할 수 있습니다. 다시 확보하기 위해 광장 매듭을 사용합니다. </li><li> 작은 톱을 사용하여, 거리에 낮은 다리를 잘라. 이 상처 발목 부분의 경골을 따라 중간에 대해해야합니다. </li><li> 발목 부분의 경골의 골수에 날카로운 탐침을 삽입합니다. 이 프로브는 myograph베이스의 발목 부분의 경골을 고정하는 데 사용됩니다. </li><li> 미셸 클립을 사용하여 피부에 두 elastics을 첨부합니다. 이러한 및 추가 elastics이 따뜻해 파라핀 오일로 가득 될 컨테이너를 형성하는 근육 주변의 피부를 개최하는 데 사용됩니다. </li></ol> [선택 사항] 8. sonometric 결정 (선택 사항 단계) 5를 삽입 <ol><li> 낮은 설정에서 가열 패드에 동물을 놓으십시오. 직장 프로브는 이미 삽입하지 않을 경우이 시간에 삽입 할 수 있습니다. 윤활하는 파라핀 오일의 작은 방울을 사용합니다. </li><li>microstimulation 사용하여 근육 내에 다발의 끝 부분을 식별합니다. 근육의 기원과 삽입 모두의 사이트에 21 게이지 바늘을 찔러. </li><li> 바늘 및 다한 채권 수술 접착제와 인감에 의해 만들어진 구멍에 sonometric 크리스탈을 밀어 넣습니다. 접착제의 매우 작은 방울을 사용하여,이 결정으로 바로 배치되어 있는지 확인하고. 예각으로 종이에 베인의 한 부분에 접착제를 적용하면 정확하게 접착제를 적용에 도움이됩니다. 우리는 microstimulation에 의해 식별 된 다발의 삽입에 하나의 추가 수정을 배치하고 있습니다. </li></ol> [계속] 9. (그림 1 참조) 장치에 마운트 <ol><li> 레버 방향으로 지향 정강 프로브와 함께 myograph베이스에 쥐를 배치합니다. 다리를 고정하는 홀더에 프로브를 삽입합니다. </li><li> 용기를 형성하고 elastics과 보호를 위해, 옆에 피부를 당겨. </li><li> 파일럿을 사용하여 넙 다리 뼈에 드릴 비트 (1 / 16 일 인치)를 설정수술 준비하는 동안 생성 된 구멍. 당신은 대퇴골의 파손으로 드릴 비트를 (핀 부사장)을 배치대로 앞 부분에있는 대퇴골을 지원 확인이 성급하게 실험을 종료, 발생할 수 있습니다. 대퇴골을 고정 할 수있는 크로스 바에 부착이 핀 바이스. </li><li> 근육의 기원으로 돌아 가까운 신경 자극 즉석 (음극 근육에 대한)와 턱을 통해 좌골 신경의 말초 그루터기를 놓습니다. 이 와이어에 stimulator를 연결합니다. </li><li> 거기에 스트레인 게이지 센서가있는 레버에 아킬레스의 힘줄 연결합니다. snuggly 묶어하지만, 나중에 조정을위한 공간을 두십시오. 근육의 정렬이 레버를 수직해야합니다. </li><li> 따뜻해 파라핀 오일로 피부에 의해 형성된 용기를 채우십시오. </li><li> 열 램프와 동물의 머리 위로 아연 도금을하다 만든 위치 보호막, 그리고 힘 변환기를 켭니다. 추가 호일 보호막이 동물의 핵심 온도가 exce하지 않도록 할 필요가있을 수 있습니다에드 38 ° C. 문자열의 여유가 안쪽 gastrocnemius과 힘 변환기 사이의 연결에서 제거 될 때까지 근육의 길이를 조정할 수 있습니다. </li></ol> 10. 최대 전압 및 참조 길이를 설정 <ol><li> 근육이 데워되는 동안 stimulator를 설정하고 자극 전압을 테스트합니다. 그것은 자극을 매우 짧은 펄스 기간에 설정되어 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 우리는 50 μs를 사용합니다. 최대 전압은 1보다 V. 0.5 V에서 시작이 될 트 진폭이 증가하지 않습니다 때까지 전압을 증가해야합니다. 최대 전압은 모든 모터 장치를 활성화 낮은 전압이다. 우리는 일반적으로 두 번 최대 전압에서 자극, 또는 높은 중 3 V. </li><li> 일반적으로 실험에서 가장 큰 트의 수축을 제공하는 길이의 근육을 시작합니다. 트은 하나의 자극 펄스를 얻을 수 있습니다. 근육의 길이가 다른 트에 대한 약 1mm 증가하고 있습니다. 이것은 트 진폭만큼 반복됩니다증가하고있다. 일단 진폭 감소를, 트의 길이는 최대 진폭 트를 준 사람에게 반환됩니다. </li><li> 길이의 초기 설정 후, 우리는 &quot;컨디셔닝 파상풍의 수축&quot;로 참조 무​​엇으로 시스템을 테스트합니다. stimulator 500 밀리에 대해 200 Hz에서 펄스를 제공하도록 설정되어 있습니다. 이 자극의 전달은 완전히 융합 파상풍의 수축을 야기 할 것이다. 근육에 의해 생성 된 힘은 근육에서 노트를 포함한 모든 연결을 강화합니다. potentiation 4 분산에 적합한 휴식 후, 근육의 기준 길이는 (일부 9.2 참조) 재설정됩니다. 보통, 컨디셔닝 파상풍의 수축 일부 다발 길이 단축을 허용 한 것 때문에 근육이 가장 큰 진폭 트의 수축을 제공하는 길이로 돌아 가기 위해 조금 늘어해야합니다. </li></ol> 11. 실험을 시작 <ol><li> 전형적인 실험은 길이 adjustm이 포함됩니다다닐 및 / 또는 자극의 패턴의 다양한 자극. 데이터 컬렉션은 길이, 다발 길이 electromyogram과 단지 힘, 또는 힘을 포함 할 수 있습니다. </li></ol> [선택 사항] 12. 강제 주파수 관계 2 <ol><li> 충분히 관심의 주파수에서 힘의 고원에 도달 할 수있는 열차 시간을 설정합니다. 최대 isometric 힘은 200 Hz에서 중간 gastrocnemius 근육에 달성된다. 기차 기간은 최소한 200 밀리 초 여야합니다 이상 낮은 주파수를위한보다 나은이지만, 몇 가지 수축이 힘 주파수의 관계의 전체 범위를 결정하는 데 사용하는 경우 일부 피로하게됩니다. 우리는 일반적으로 0, 20, 40, 60, 80, 100, 200 Hz에서 수축을 사용합니다. 주파수의 범위는 힘 주파수의 관계의 전체 범위가 설명 할 수 있습니다. 수축 사이의 적절한 나머지는 (1-10 분) 피로 방지 할 수 있도록 허용하여야합니다. </li></ol> 13. 강제 길이 relationshIP 6 <ol><li> 예상 최적의 길이가 이전에 설정을 통해 강제 길이 관계는 체계적으로 서보 모터 장치를 사용하여 4mm에 -4 mm에서 근육의 길이를 조정하여 결정 할 수 있습니다. 이것은 최대 자극 (200 Hz에서)를 사용하여 수행해야하지만 우리는 매우 간단한 수축이 같은 사실이 최적의 길이 7 얻을 것을 발견했습니다. Submaximal 수축이 꿈틀처럼 사용할 수 있지만이 힘을 8 길이-의존도 다른를 얻을 수 있습니다. </li><li> 힘 길이 관계의 결정의 중요한 점은 측정 힘이 발생되는 다발 길이에 수동 힘을 추정 할 필요가있다. 활성 힘이 총 힘하고 적절한 수동 힘의 차이로 계산됩니다. 병렬 탄성 구조는 수동 힘을 부담하고 이러한 일련의 탄성 구조와 시리즈에 있기 때문에, 총 힘에 수동적 힘 기여는 일련의 ELA로 감소합니다stic 구조가 수축 3에서 뻗어 있습니다. 수동 힘이 모든 관련 근육 길이가 알려져되면, 해당 패시브 힘이, 또는 측정 시스템의 규정 준수 및 근육 힘줄 단위의에서 시리즈 구조를 추정하여 sonomicrometry를 사용하여 다발 길이의 연속 측정을 추정 할 수 있습니다. 이 작업을 수행하지 않은 경우 준비와 피크 힘의 최적 길이는 과소 평가되어 있습니다. </li></ol> 14. 강제 속도의 관계 9 <ol><li> 당신은 힘 - 속도 관계를 결정하려는 경우, 당신은 길이 변화의 부하 또는 속도 중 하나를 제어 할 수있는 시스템에 힘 트랜스 듀서를 장착해야합니다. 가장 쉽고 가장 비용 효과적인 방법은 제어 부하 단축을 제한 할 공기 압력을 사용하는 것입니다. 우리의 시스템에서 근육이 지점의 한쪽면에있는 레버에 부착되어 있고 공기 압력은 반대편에 길이 변경을 막는. 길이 센서 NEEDS는 사용자가 등장 수축하는 동안 근육 길이의 변화를 감지 할 수 있습니다 있도록 사용될 수 있습니다. 이 배열은 공기 저항과 afterloaded 수축을 할 수 있습니다. 듀얼 탱크는 등장 하중에 릴리스 isometric 수축을 허용 할 수 있습니다. 15-20 수축의 총은 거의 무부하에서 최대 isometric 힘에 이르기까지로드와 함께 얻을 수 있습니다. 방정식에 데이터를 맞는 경우, isometric의 90 % 이상로드 9 사용할 수 없습니다. </li></ol> 15. 대표 결과 : 샘플 수축은 그림 2에 표시됩니다. 이러한 수축은 힘 주파수 관계를 설명하기 위해 취득했다. 이 수축의 정상 활성 힘을 계산, 주파수에 대한 활성 힘을 음모를 꾸미고, 생산량은 3 그림, 힘 주파수의 관계. 그림 2에 제시되는 데이터는 방정식에 맞게 할 수 있습니다 AF = C / (1 + E ((F) / B) + D), AF가 활성화 힘이고, F는 주파수이며,<html> B, C와 D는 상수입니다. 쥐 안쪽 gastrocnemius 근육의 경우 자극의 반 최대 주파수는 일반적으로 비 피로 근육 2 50-60 Hz에서입니다. 결과는 위의 방정식에 의해 설명 된 라인에 밀접하게 맞습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3167/3167fig1.jpg" /> 그림 1 장치 및 근육 설정 :. 공압 설정이 오른쪽에 isometric, 왼쪽에 표시됩니다. 동적 수축이 (13에서 적응) 원하는 때 왼쪽에 표시 레버 시스템은 번역 테이블에 부착되어 있습니다. 스테퍼 모터는 컴퓨터 (14에서 적응)에 의해 제어됩니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3167/3167fig2.jpg" /> . 그림 2 겹쳐 isometric 수축 : 20, 40, 60, 80, 100, 200 Hz에서. 200 Hz에서의 수축의 진폭은 8.13 N.입니다 les/ftp_upload/3167/3167fig3.jpg &quot;/&gt; . 그림 3 강제 주파수의 관계 : 그림 2의 수축의 Active 힘이 해본와 줄 가장 적합한의 선을 나타냅니다 있습니다.

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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

좋은 품질의 수축성 결과가 수술 준비에주의 획득 할 수 장치 및 좋은 품질 전자 제품에 장착 고정합니다. 학생이 수술을 학습하는 경우, 몇 가지 일반적인 전표는 다음과 같습니다 : 좌골 신경에 이르는 혈액의 흐름을 방해하고, 과도한 출혈. 신경은 손상을 방지하기 위해주의해서 취급해야합니다. 당신은 최적의 길이에서 최대 파상풍의 힘 그림 3, 또는 maximally 모든 모터 단위를 활성화하는 데 필요한 자극 전압이 5 볼트보다 큰 경우 표시보다 실질적으로 적은 경우 신경을 손상시킨 알 수 있습니다. 이 수술 중에이 근육을 제공하는 혈관을 피하기 위해 상대적으로 쉽습니다. 이러한 선박에 방해가 드릴 비트가 대퇴골의 꼬리 표면에 배치 될 때 발생할 수 있습니다. 파일럿 구멍 대퇴골의 평면 표면에없는 경우 드릴이 미끄러지 수 있습니다. 이 경우, 오금 혈관이 중단받을 가능성이 있습니다. 면혈액 수영장 근육 주변에 설정 한 후, 당신이 혈관을 중단 한 기호입니다. 큰 정맥을 잘라 연결되어 있지 않은 경우 과도한 출혈도 발생할 수 있습니다. 을 돌볼 수있는 기회 대형 정맥은 발목 주위의 사람들입니다. 현장 근육 준비의 근육 수축 특성에 관한 연구에 귀중한 접근 방법입니다. 개인 모터 단위는 10을 활성화 할 수 있지만, 일반적으로 모든 모터 단위는 동 기적으로 활성화됩니다. 이 자발적으로 모터 단위 모집에 의해 발생하는 일반적인 비동기 활성화에 상대적으로 불리한이기 때문에,이 한계를 나타냅니다. 그러나, 긍정적 인 측면에, 동기 활성화는 모든 모터 단위의 평균 응답의 정량화 할 수 있습니다. 동기 활성화를 방지하기 위해 사용 된 두 가지 방법이 있습니다. 하나는 자극 전선의 여러 쌍에 전극 커프를 사용하는 것입니다. 이 각 쌍의 모터 단위의 일부가 작동 할 수 있습니다그리고 자극이 비동기 활성화를 달성 할 수 있도록 쌍으로 회전 할 수 있습니다. 정품 인증이 방법은 크기의 원리 (12)에 따라 적절한 순서대로 모터 단위를 활성화하기 위해 시도 할 anodal 블록 11과 함께 사용할 수 있습니다. 이 방법에서는 모든 모터 단위는 전극의 인접 쌍 활성화되며, 블록은 직류 자극과 함께 부과됩니다. 블록 자극의 진폭은 정품 인증이 원하는되지 않은 모터 단위를 억제하는 조절 할 수 있습니다. 분명히 블록은 낮은 전압에서 큰 axons에 영향을, 그리고 점차적으로 더 작은 단위에 영향을 미칩니다. 현장 쥐 gastrocnemius 근육 준비의 건강과 질병의 골격 근육 수축과 생화학 특성 연구에 귀중한 생리적 접근 방법입니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 장비의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 코멘트 (선택 사항) </th></tr><tr><td> 가위 </td><td></td><td></td><td> 좋은 품질 애완 동물 가위 </td></tr><tr><td> 외과 램프 </td><td> 다이나 - Lume </td><td></td><td> 몇 중 하나를 수행합니다 </td></tr><tr><td> Myograph </td><td></td><td></td><td> 맞춤 제작 </td></tr><tr><td> Stimulator </td><td> 풀 </td><td> S-88 </td><td> 몇 중 하나를 수행합니다 </td></tr><tr><td> 게이지 증폭기 스트레인 </td><td> CWE </td><td> PM-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Telethermometer </td><td> 어떡하지 </td><td> 어떡-400 </td><td></td></tr><tr><td> 로봇 플랫폼 </td><td> Arrick 로봇 </td><td> MD-2 </td><td></td></tr><tr><td> Sonometric 증폭기 </td><td> Sonometrics </td><td> Sonolab </td><td></td></tr><tr><td> 컴퓨터 및 데이터 수집 </td><td> NI 보아와 PCRD </td><td></td><td> 사용자 정의 소프트웨어 (labview) </td></tr><tr><td> 블록 히터 </td><td> 랩 라인 </td><td> 멀티 블록 </td><td></td></tr><tr><td> 신경 커프 </td><td></td><td></td><td> 사용자가 만든 </td></tr><tr><td> Microstimulator </td><td></td><td></td><td> 사용자가 만든 </td></tr></tbody></table>

procedures for rat in situ skeletal muscle contractile properties

몸의 온도에서 정상적인 유통, 그대로 전체 근육 : 그 생리적 상황 골격근의 수축 반응을 얻는 것이 바람직 곳 많은 경우가 있습니다. 이 posttetanic potentiation, 계단과 피로 등의 수축성 응답의 연구를 포함한다. 또한, 질병, 쓰지 않음, 상해, 교육 및 약물 치료의 결과는 관심이 될 수 있습니다. 이 동영상은이 귀중한 근육 준비를 설정 및 사용하기 위해 적절한 절차를 보여줍니다. 이 준비를 설정하려면 동물은 anesthetized해야하며, 중간 gastrocnemius 근육은 수술 격리되어 기원은 그대로 갖추고 있습니다. 케어는 혈액과 신경 공급을 유지하기 위해주의해야합니다. 좌골 신경의 긴 섹션은 결합 조직의 삭제, 및 proximally 절단됩니다. 중간 gastrocnemius 근육 신경을 분포시키다하지 않는 말초 그루터기의 모든 지점이 절단됩니다. 말초 신경 등 걸이 inser입니다스테인레스 스틸 와이어 자극 늘어서 커프에 테드. calcaneus은 여전히​​ 아킬레스의 힘줄에 부착 된 뼈의 작은 조각을 남겨두고 절단됩니다. electromyography에 대한 Sonometric 결정 및 / 또는 전극이 삽입 될 수 있습니다. 금속 대퇴골의 프로브와 경골의 고정은 근육 기원의 움직임을 방지합니다. 아킬레스의 힘줄은 힘 변환기에 부착되고 느슨하게 피부 따뜻해 파라핀 오일로 가득 컨테이너를 형성하기 위해 옆에 체포되어 있습니다. 오일은 균일하게 열을 배포하고 증발 열 손실을 최소화합니다. 열 램프가 근육에 지시되며, 근육과 쥐가 37 ° C.까지 따뜻하게 사용할 수 있습니다 이 데워되는 동안 최대 전압과 최적의 길이를 결정 할 수 있습니다. 이러한 손상 전체 근육에 대한 실험을위한 중요한 초기 조건입니다. 실험은 힘 주파수 관계, 힘 길이 관계, 그리고 힘 - 속도 관계와 같은 표준 수축성 속성의 결정을 포함 할 수 있습니다. </P&gt; 수술 격리 치료로 근육 힘줄의 힘 변환기와 단위 및 적절한 데이터 분석의 근육 및 정렬의 기원 고정은 고품질의 측정이 근육 준비를 구할 수 있습니다.

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Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

이 동영상은 수술 준비와 쥐 안쪽 gastrocnemius 근육 준비의 수축 반응을 연구하는 데 필요한 절차를 보여줍니다<em&gt; 현장에서</em&gt;. 이 준비 생리적 조건 하에서 골격근 수축 특성의 측정을 할 수 있습니다. 동물은 anesthetized이며, 근육은 그 말단부에 조직을 둘러싼에서 분리됩니다. 아킬레스의 힘줄이 손상 순환을 37 도로 C에서 근육의 수축 반응의 측정을 수 있도록 힘 변환기에 부착되어 있습니다.

쥐 절차<em&gt; 현장에서</em&gt; 골격근 수축 등록

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

28.6K 조회수.  University of Calgary. 이 동영상은 수술 준비와 쥐 안쪽 gastrocnemius 근육 준비의 수축 반응을 연구하는 데 필요한 절차를 보여줍니다 현장에서. 이 준비 생리적 조건 하에서 골격근 수축 특성의 측정을 할 수 있습니다. 동물은 anesthetized이며, 근육은 그 말단부에 조직을 둘러싼에서 분리됩니다. 아킬레스의 힘줄이 손상 순환을 37 도로 C에서 근육의 수축 반응의 측정을 수 ?...

비디오: Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of imaging had invented. While many macroscopic parameters of blood flow reflect flow velocity, changes in blood flow velocity and red blood cell (RBC) flux does not hold linear relationship in the microscopic observations. There are reports of discrepancy between RBC velocity and RBC flux, RBC flux and plasma flow volume, and of spatial and temporal heterogeneity of flow regulation in the peripheral tissues in microscopic observations, a scientific basis for the requirement of more detailed studies in microcirculatory regulation using intravital microscopy. METHODS: We modified Jeff Lichtman's method of in vivo microscopic observation of mouse sternomastoid muscles. Mice are anesthetized,
ventilated, and injected with PKH26L-fluorescently labeled RBCs for microscopic observation.RESULT &amp; CONCLUSIONS: Fluorescently labeled RBCs are detected and distinguished well by a wide-field microscope. Muscle contraction evoked by electrical stimulation induced increase in RBC flux. Quantification of other parameters including RBC velocity and capillary density were feasible. Mice tolerated well the surgery, injection of stained RBCs, microscopic observation, and electrical stimulation. No muscle or blood vessel damage was observed, suggesting that our method is relatively less invasive and suited for long-term observations.

A new versatile method for observation of microcirculation is presented. It is considered suitable for long-term observation, and for combination with pharmacophysiological or molecular biological interventions.

내부 핵심 현미경에 의해 골격근의 생체내 미세 순환 측정

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

연구

생물학

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

성인 및 배아 골격근의 Microexplant 문화 및 골격 근육 줄기 세포의 분리

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and regulate a number of signaling cascades2,3. Past and current researchers have isolated mitochondria from rat and mice tissues such as liver, brain and heart4,5. In recent years, many researchers have focused on studying mitochondrial function from skeletal muscles.
Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of mitochondria from skeletal muscles 6. Our procedure requires that all buffers and reagents are made fresh and need about 250-500 mg of skeletal muscle. We studied mitochondria isolated from rat and mouse gastrocnemius and diaphragm, and rat extraocular muscles. Mitochondrial protein concentration is measured with the Bradford assay. It is important that mitochondrial samples be kept ice-cold during preparation and that functional studies be performed within a relatively short time (~1 hr). Mitochondrial respiration is measured using polarography with a Clark-type electrode (Oxygraph system) at 37&deg;C7. Calibration of the oxygen electrode is a key step in this protocol and it must be performed daily. Isolated mitochondria (150 &mu;g) are added to 0.5 ml of experimental buffer (EB). State 2 respiration starts with addition of glutamate (5mM) and malate (2.5 mM). Then, adenosine diphosphate (ADP) (150 &mu;M) is added to start state 3. Oligomycin (1 &mu;M), an ATPase synthase blocker, is used to estimate state 4. Lastly, carbonyl cyanide p-[trifluoromethoxy]-phenyl-hydrazone (FCCP, 0.2 &mu;M) is added to measurestate 5, or uncoupled respiration 6. The respiratory control ratio (RCR), the ratio of state 3 to state 4, is calculated after each experiment. An RCR &ge;4 is considered as evidence of a viable mitochondria preparation.
In summary, we present a method for the isolation of viable mitochondria from skeletal muscles that can be used in biochemical (e.g., enzyme activity, immunodetection, proteomics) and functional studies (mitochondrial respiration).

This protocol describes a procedure to study the respiration of mitochondria isolated from skeletal muscles. This method was adapted from Scorrano et al. (2007). The mitochondrial isolation procedure requires about 2 hours. The mitochondrial respiration can be completed in about 1 hour.

골격근에서 Mitochondrial 절연

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing in a "satellite cell position" between the myofiber plasma membrane and the laminin-rich basement membrane that ensheaths it, are self-renewing cells that are solely committed to the myogenic lineage1,2. We have recently described a second class of vessel associated progenitors that can generate myofibroblasts and white adipocytes, which responds to damage by efficiently entering proliferation and provides trophic support to myogenic cells during tissue regeneration3,4. One of the most trusted assays to determine the developmental and regenerative potential of a given cell population relies on their isolation and transplantation5-7. To this end we have optimized protocols for their purification by flow cytometry from enzymatically dissociated muscle, which we will outline in this article. The populations obtained using this method will contain either myogenic or fibro/adipogenic colony forming cells: no other cell types are capable of expanding in vitro or surviving in vivo delivery. However, when these populations are used immediately after the sort for molecular analysis (e.g qRT-PCR) one must keep in mind that the freshly sorted subsets may contain other contaminant cells that lack the ability of forming colonies or engrafting recipients.

Method for the enzymatic dissociation, surface labeling and purification by flow cytometry of fibro/adipogenic and myogenic progenitors from murine skeletal muscle.

골격근에서 Progenitors의 정화

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections (bupivacaine, cardiotoxin or notexin), muscle transplantations (denervation-devascularization induced regeneration), intensive exercise, but also murine muscular dystrophy models such as the mdx mouse (for a review of these approaches see 1). In zebrafish, genetic approaches include mutants that exhibit muscular dystrophy phenotypes (such as runzel2 or sapje3) and antisense oligonucleotide morpholinos that block the expression of dystrophy-associated genes4. Besides, chemical approaches are also possible, e.g. with Galanthamine, a chemical compound inhibiting acetylcholinesterase, thereby resulting in hypercontraction, which eventually leads to muscular dystrophy5. However, genetic and pharmacological approaches generally affect all muscles within an individual, whereas the extent of physically inflicted injuries are more easily controlled spatially and temporally1. Localized physical injury allows the assessment of contralateral muscle as an internal control. Indeed, we recently used laser-mediated cell ablation to study skeletal muscle regeneration in the zebrafish embryo6, while another group recently reported the use of a two-photon laser (822 nm) to damage very locally the plasma membrane of individual embryonic zebrafish muscle cells7.
Here, we report a method for using the micropoint laser (Andor Technology) for skeletal muscle cell injury in the zebrafish embryo. The micropoint laser is a high energy laser which is suitable for targeted cell ablation at a wavelength of 435 nm. The laser is connected to a microscope (in our setup, an optical microscope from Zeiss) in such a way that the microscope can be used at the same time for focusing the laser light onto the sample and for visualizing the effects of the wounding (brightfield or fluorescence). The parameters for controlling laser pulses include wavelength, intensity, and number of pulses.
Due to its transparency and external embryonic development, the zebrafish embryo is highly amenable for both laser-induced injury and for studying the subsequent recovery. Between 1 and 2 days post-fertilization, somitic skeletal muscle cells progressively undergo maturation from anterior to posterior due to the progression of somitogenesis from the trunk to the tail8, 9. At these stages, embryos spontaneously twitch and initiate swimming. The zebrafish has recently been recognized as an important vertebrate model organism for the study of tissue regeneration, as many types of tissues (cardiac, neuronal, vascular etc.) can be regenerated after injury in the adult zebrafish10, 11.

The method presented here comprises the precise injury of live zebrafish embryos with high-energy laser pulses and the subsequent analysis of these injuries and their recovery with time. We also show how genetically labeled single or groups of skeletal muscle cells can be tracked during and after laser light induced damage.

Zebrafish 배아 골격근의 레이저 쏜 부상

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

칼슘의 평가는 그대로 골격 근육 섬유에서 불꽃

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal results from functional, cellular, molecular, and pathological evaluations. Due to the subtlety of some pathological abnormalities seen in congenital muscle disorders and the potential for fixation to interfere with the recognition of these features, pathological evaluation of frozen muscle is preferable to fixed muscle when evaluating skeletal muscle for congenital muscle disease. Additionally, the potential to produce severe freezing artifacts in muscle requires specific precautions when freezing skeletal muscle for histological examination that are not commonly used when freezing other tissues. This manuscript describes a protocol for rapid freezing of skeletal muscle using isopentane (2-methylbutane) cooled with liquid nitrogen to preserve optimal skeletal muscle morphology. This procedure is also effective for freezing tissue intended for genetic or protein expression studies. Furthermore, we have integrated our freezing protocol into a broader procedure that also describes preferred methods for the short term triage of tissue for (1) single fiber functional studies and (2) myoblast cell culture, with a focus on the minimum effort necessary to collect tissue and transport it to specialized research or reference labs to complete these studies. Overall, this manuscript provides an outline of how fresh tissue can be effectively distributed for a variety of phenotypic studies and thereby provides standard operating procedures (SOPs) for pathological studies related to congenital muscle disease.

The analysis of skeletal muscle tissues to determine structural, functional, and biochemical properties is greatly facilitated by appropriate preparation. This protocol describes appropriate methods to prepare skeletal muscle tissue for a broad range of phenotyping studies.

조직의 우선 순위 구분과 골격근 질환 모델에 대한 동결

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

마우스 골격근에있는 검색, 탐지 DNA 손상 분석<em&gt; 현장에서</em&gt; TUNEL 방법을 사용하여

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of serially linked sarcomeres, the smallest contractile units in muscle. Sarcomeric dysfunction contributes to muscle weakness in patients with mutations in genes encoding for sarcomeric proteins. The study of myofibril mechanics allows for the assessment of actin-myosin interactions without potential confounding effects of damaged, adjacent myofibrils when measuring the contractility of single muscle fibers. Ultrastructural damage and misalignment of myofibrils might contribute to impaired contractility. If structural damage is present in the myofibrils, they likely break during the isolation procedure or during the experiment. Furthermore, studies in myofibrils provide the assessment of actin-myosin interactions in the presence of the geometrical constraints of the sarcomeres. For instance, measurements in myofibrils can elucidate whether myofibrillar dysfunction is the primary effect of a mutation in a sarcomeric protein. In addition, perfusion with calcium solutions or compounds is almost instant due to the small diameter of the myofibril. This makes myofibrils eminently suitable to measure the rates of activation and relaxation during force production. The protocol described in this paper employs an optical force probe based on the principle of a Fabry-P&#233;rot interferometer capable of measuring forces in the nano-Newton range, coupled to a piezo length motor and a fast-step perfusion system. This setup enables the study of myofibril mechanics with high resolution force measurements.

Presented here is a protocol to assess the contractile properties of striated muscle myofibrils with nano-Newton resolution. The protocol employs a setup with an interferometry-based, optical force probe. This setup generates data with a high signal-to-noise ratio and enables the assessment of the contractile kinetics of myofibrils.

골격 근육 생검에서 Myofibrils를 분리하고 나노 뉴턴 해상도 포스 트랜스듀서로 수축 기능을 결정합니다.

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of ...

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in muscle homeostasis, injury, and repair. Current protocols for FAPs identification and isolation use flow cytometry/fluorescence-activated cell sorting (FACS) and studies evaluating their function in vivo to date have been undertaken exclusively in mice. The larger inherent size of the rat allows for a more comprehensive analysis of FAPs in skeletal muscle injury models, especially in severely atrophic muscle or when investigators require substantial tissue mass to conduct multiple downstream assays. The rat additionally provides a larger selection of muscle functional assays that do not require animal sedation or sacrifice, thus minimizing morbidity and animal use by enabling serial assessments. The flow cytometry/FACS protocols optimized for mice are species specific, notably restricted by the characteristics of commercially available antibodies. They have not been optimized for separating FAPs from rat or highly fibrotic muscle. A flow cytometry/FACS protocol for the identification and isolation of FAPs and MPs from both healthy and denervated rat skeletal muscle was developed, relying on the differential expression of surface markers CD31, CD45, Sca-1, and VCAM-1. As rat-specific, flow cytometry-validated primary antibodies are severely limited, in-house conjugation of the antibody targeting Sca-1 was performed. Using this protocol, successful Sca-1 conjugation was confirmed, and flow cytometric identification of FAPs and MPs was validated by cell culture and immunostaining of FACS-isolated FAPs and MPs. Finally, we report a novel FAPs time-course in a prolonged (14 week) rat denervation model. This method provides the investigators the ability to study FAPs in a novel animal model.

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat

This protocol outlines a method to isolate Fibro-adipogenic progenitors (FAPs) and myogenic progenitors (MPs) from rat skeletal muscle. Utilization of the rat in muscle injury models provides increased tissue availability from atrophic muscle for the analysis and a larger repertoire of validated methods to assess muscle strength and gait in free-moving animals.

쥐의 골격 근육에서 섬유 선화 (FAP) 및 근생 전구자 (의원)의 식별, 격리 및 특성화

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in ...

쥐 절차

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