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1. 외과 기술 <ol><li> 실험 무균 기술을 사용하여 특정 기관의 동물 사용 프로토콜에 따라 수행하여야한다. 살아있는 조직과 접촉으로 오는 악기와 자료 (솔루션, 시험 물질, 추적기, 바늘 등) 동물 복지 및 연구에 대한 잠재적인 부정적 영향에 감염하고 불리한 영향을 방지하기 위해 멸균해야합니다. </li></ol> 2. 마취 <ol><li> 쥐 한 동물 isoflurane 기화기 시스템을 사용 anaesthetized 것입니다. 0.8 L / isoflurane 가스를 기화하는 분의 비율로 의료 학년 산소를 사용하십시오. 첨부된 마취 상자에 동물을 배치하고 호흡이 둔화하고 있으며 동물이 진정 될때까지 4퍼센트의 isoflurane 농도에 전화. </li><li> 다음, stereotaxic 프레임 가스 마스크 첨부 파일에 가스 흐름을 스위치와 stereotaxic 장치에 동물을 놓으십시오. 2 % isoflurane 농도를 켜고 마취를 모니터링합니다. 큰 동물 (&gt; 300g)는 isoflurane의 높은 농도를 필요로 할 수 있습니다. 마취는 수술 중에 모니터링하고 isoflurane 복용량이 적절하게 조정해야합니다. 깊이와 호흡 속도는 지속적으로 평가해야하고, 깊은 고통의 부재에 대한 발가락 핀치 평가 (매 5 분)을 수행하여야한다. </li><li> 수술이 완료되면, isoflurane을 해제하고 stereotaxic 장치에서 제거하기 전에 몇 분 동안 호흡 산소에 동물을 허용합니다. 체온은 수술 담요 및 / 동물을 포함하거나 수술하는 동안 규제 난방 담요를 사용하여 유지 관리해야합니다. </li></ol> 3. Intraocular 주입을위한 주사 준비 <ol><li> 첫째, intraocular 주사를 수행하는 주사기 시스템을 조립. 10 μL RN Gastight 1,701 해밀턴 주사기 주입에 사용됩니다. 주사기의 끝부분에있는 모든 바늘이나 RN 너트 선물을 제거합니다. </li><li> 압축 피팅 물미 피크 컵에 PFA 물미를 삽입합니다. 그런 다음 주사기의 끝부분에 완벽한 피팅을 삽입하고 느슨하게 맨 위로 RN 너트를 나사. </li><li> RN 너트의 구멍을 통해 압축 피팅에 16분의 1 인치 피크 튜브의 한쪽 끝을 넣습니다. 피크 튜브가 완전히 장착되어 있는지 확인하십시오. 피크 튜브를 밀봉, 물미을 압축 RN 너트를 조이십시오. </li><li> 듀얼 RN 유리 커플러의 양쪽에 3.2 단계 수행합니다. RN 너트를 강화하여 이중 RN 유리 커플러의 한쪽 끝을 위해 피크 튜브의 자유로운 끝을 연결합니다. </li><li> 가져온 유리 micropipette는 분사 시스템의 바늘과 총구를 형성합니다. 유리 pipettes를 조작 1.5 mm OD 두께 벽으로 둘러싸인 유리 모세관 튜브를 사용하여 듀얼 RN 유리 커플러의 자유로운 끝에 유리 피펫을 삽입합니다. 장소에 피펫을 수정하기 위해 RN 너트를 조이십시오. </li><li> 가져온 유리 micropipettes의 벌금 끝이 intraocular 주사를 수행하기위한 일반적으로 너무 작습니다. 적절한 직경의 팁을를 생성하기 위해, 수술 현미경을 사용하여 시각적인지도 아래 유리 피펫의 팁을 휴식. 유리 슬라이드 표본의 프로스트 엔드 잘 피펫을 깰 적합합니다. 각도에서 피펫 잡고 휴식을 만들기 위해 유리 설탕을 입힘 따라 팁을 문지 르세요. 이상적으로, 최종 팁 약간 bevelled해야합니다. 좋은 팁을 생산하기 위해 몇 가지 시도 걸릴 수 있으므로 사용하기 전에 여러 pipettes를 가져옵니다. </li><li> 분사 시스템은 유압합니다. 따라서, 주사기, 피크 튜브의 링커, 듀얼 RN 유리 커플러와 유리 micropipette는 사용하기 전에 미네랄 오일로 가득해야합니다. 해밀턴 주사기 (주) (PRMKIT)에서 마중물 키트를 사용하여, 미네랄 오일 마중물 주사기를 입력하십시오. 점성 오일 쉽게 통과를 허용하는 큰 직경의 바늘을 사용합니다. 10 μL 해밀턴 주사기의 총신 내부 맞는 해밀턴 90,030 바늘로 바늘을 교체합니다. 다음, 미네랄 오일을 주입하면서 인감을 제공하기 위해, 해밀턴 90,030 바늘을 통해 고무 심장을 넣으십시오. </li><li> 분사 시스템의 10 μL 해밀턴 주사기의 통의 후면에 마중물 주사기의 해밀턴 90,030 바늘을 삽입합니다. 도장을 만들 수있는 주사기의 끝을 단단히 대한 심장을 누르십시오. </li><li> 천천히 플런저를 우울. 당신은 분사 시스템의 유리 요소를 통해 미네랄 오일 패스를보고, 마지막으로 유리 피펫을 작성합니다. 넓이 함께하는 기포를 제거하기 위해 분사 시스템을 통해 오일을 모두 밀어. 충전 주사기는 광유에서 실행하고있는 경우 지속적으로 공기 방울 형성​​을 방지하기 위해 기름을 분배하면서 천천히 바늘을 철회. 리필 마중물 주사기를 다시 주입. </li><li> 전체 시스템을 무료로 미네랄 오일과 거품으로 가득되면 10 μL 해밀턴 주사기의 원래 플런저를 삽입합니다. 시스템에서 추가적인 미네랄 오일을 제거하기 위해서는 여행이 끝날 때까지 플런저를 우울하게. 유리 micropipette 깨끗하고 70 % 에탄올로 세척 주사기의 끝을 닦아주십시오. </li><li> Withdraw 배럴에서 2 μL 표시 주사기의 플런저. 유리 micropipette의 끝 공기가 미네랄 오일 주입으로 원하는 유체 사이의 버퍼 영역을 제공하는 작성합니다. 피펫 바렐 이제 원하는 솔루션에 micropipette의 끝에 배치하고 해밀턴 주사기의 플런저를 철수 통해서하실 수 있습니다. 성인 쥐 안구에 솔루션 이상의 4-5 μL를 주입하지 마십시오. </li></ol> 4. Intraocular 사출 절차 : 전세계 망막 타겟팅 <ol><li> anesthetized과 stereotaxic 프레임 (로 제 2의 설명에)에서 보안 동물, Alcaine 아이가 몸에 붙이기도 각막을 마취하는 방울 사용합니다. 손가락과 장소 각막의 표면에 마취 솔루션 중 하나를 드롭으로 눈꺼풀을 엽니다. </li><li> 하나는 유리체 챔버에 유리 피펫을 삽입하고 피펫 위치를 유지하고, 또 원하는 솔루션을 제공 주사기의 플런저를 우울하게하는하기 : 사출은 두 사람이 필요합니다. </li><li> 수술 현미경, 그립 유리 micropipette과 손가락으로 듀얼 RN 유리 커플러에서. 사출 사이트의 맞은편에 &quot;V&quot;모양을 형성, 무료 손의 손가락으로 눈꺼풀을 전파. 눈꺼풀에 견인을 적용하여, 눈은 limbus 뒤에 사후 표면을 노출, 궤도 밖으로 상승됩니다. 사출 사이트 반대편 손가락으로 &#39;V&#39;모양을 만들어, 크래들은 주입했을 때 눈이 안정성을 제공 형성됩니다. </li><li> 부드럽게 하향 각도에서 공막엔을 통해 혈관이없는 상태 영역에서 결막을 통해 유리 micropipette의 끝부분을 삽입합니다. 피펫은 공막엔을 침투하면 작은 &#39;팝업&#39;을 생각해야합니다. 약간 아래쪽 각도에서 피펫을 삽입하면 바늘을 삽입시 렌즈를 누르 기회를 줄일 수 있습니다. </li><li> 주사기를 들고있는 사람은 이제 주사기에 2 μL 표시 플런저를 우울하여 솔루션의 4 μL를 주입해야합니다. 주사 총 약 저에게 초 정도 소요됩니다. 아주 느린 속도로 주입하는 것은&gt; 3 초 유리 챔버를 통해 솔루션의 초기 확산을 줄일 수 있습니다. 당신함으로써 절차의 성공을 확인, 현미경으로 유리체 챔버를 통해 플러싱 주입 솔루션을 볼 수 있습니다. </li><li> 약 5 초 동안 꾸준한 micropipette을 보유하고 바늘을 삽입했습니다 같은 방향으로, 철회. 결막은 scleral 소중히 밀봉하는 데 도움이 작은 오프닝을 통해 다시 펄럭 것입니다. </li><li> 복구하는 동안 각막 건조를 방지하고 복구 케이지에 동물을 반환하기 위해 안과 눈 연고 (눈물 Naturale PM)로 각막의 표면을 커버. </li><li> 포스트 - 수술 진통제는 동물 보호 기관의 지침에 따라 관리되어야하고, 동물은 신중하게 수술 후 모니터링해야합니다. </li></ol> 5. 선택 시신경 스텀프에서 망막 신경절 세포를 타겟팅 <ol><li> , 시신경 스텀프에 추적기, 약물, plasmids, siRNAs 또는 바이러스성 벡터를 적용 axotomy에 따라 직접 역행 수송을 통해 망막 신경절 세포를 대상으로합니다. 이것은 처음 &quot;시신경의 절개 프로토콜&quot;22에 따라 시신경의 절개를 수행하여 수행됩니다. </li><li> 시신경에 gelfoam을 이용하거나, 직접 분사 두이 절차를 수행하는 주요 방법이 있습니다. </li><li> 그것이 이전 axotomy에 우수한 colliculus 일주에 역행 추적기를 주사하여 사전 라벨 망막 신경절 세포에 바람직 시신경에서 실험적 치료를 제공하지만 때 gelfoam 방법은, 추적 역행하는 것과 비슷합니다. 이것은 어떤 경우에의 연결을 추적하는이 실험 물질 또는 그 반대의 역행 전송을 방해할 수 있기 때문에 세포 추적하는 것이 중요합니다. </li><li> 시신경이 절단 직후, 실험 용액에 담가 gelfoam의 작은 조각은 가로로 시신경 스텀프 이상 배치됩니다. 궤도 내용은 다음 자신의 이전 위치로 반환됩니다. 눈은 그것은 시신경의 끝에 이상 남아 있도록, 궤도 속으로 gelfoam의 조각을 밀어 집게를 사용하는 데 필요한 중립 위치로 반환하는 경우. </li><li> 사출 기술은 retrogradely axoplasmic 흐름에 의해 운반되기 위해서는 축삭의 세포질에 액세스할 수 있어야합니다 물질의 전달에 대한 더 효과적입니다. 이것은 siRNAs와 plasmids, 일부 경우에 바이러스 벡터를 포함합니다. 50-10 μL 해밀턴 주사기는 가로로 시신경에 원하는 솔루션을 주입하는 데 사용됩니다. </li><li> 좋은 팁 더몬트 포셉과 시신경의 가장자리 그립. 베벨은 더 이상 표시되지 않습니다 때까지 병렬 신경으로 시신경에 바늘의 끝을 삽입합니다. 삽입된 바늘은 신경에 의해 사방에 쌌다는 것입니다. 짧은 베벨과 바늘이 바람직합니다. </li><li> N되면eedle가 신경에 삽입, 부드럽게 잘 팁 포셉과 신경의 측면을 당기 주사기 사분의 일의 차례가 시계 방향 또는 시계 반대 방향으로 회전하면서 솔루션 중 하나 분기 주입. </li><li> 당신이 바늘의 전체 회전을 완료하고 주사기의 전체 내용을 주입 때까지 단계 5.7을 반복 계속합니다. 최상의 결과를 얻으려면 gastight 10 μL 해밀턴 주사기를 사용하여 솔루션을 10 μL의 총 주입. </li><li> 신경에서 주사기의 끝부분을 제거합니다. 이 axons의 끝을하여 이해를위한 추가적인 수영장을 형성하므로 궤도 내의 신경에서 refluxed 가지고있는 여분의 주입 유체를 남겨주세요. </li><li> 원래 위치로 궤도 내용을 반환, 상처를 닫고, 그리고 동물이 복구 수 있습니다. </li><li> 포스트 - 수술 진통제는 동물 보호 기관의 지침에 따라 관리되어야하고, 동물은 신중하게 수술 후 모니터링해야합니다. </li></ol> 6. 대표 결과 : Intraocular 주사는 세계 망막의 모든 세포를 대상으로하고, 신경절 세포가 유리 챔버에 인접한 망막의 내면의 연결 계층에 위치하고 있기 때문에 부상 RGCs에게 전달 물질에 대해 잘 작동합니다. RGCs도 직접 가로 시신경 스텀프에 물질을 전달하여 타겟팅할 수 있습니다. Fluorogold retrogradely 표시 RGCs는 그림 1에서 그림과 같이 신경 그루터기에서 펩티드, 약물, 벡터, plasmids, 또는 siRNAs를 사용하여 타겟팅할 수 있습니다. 그림 1A - C는 우수한 colliculus로 Fluorogold 주사에 의해 사전 라벨이 붙지만 RGCs의 somata에 Cy3 레이블 펩타이드의 지방화를 보여줍니다. Cy3 분류 펩티드는 즉시 axotomy 후 시신경로 주입되었고, 망막은 고정 기간 동안 조직의 밖으로 침출에서 펩티드를 방지하기 위해 살아있는 몇 군데했다. 그림 1D - F는 Cy3 표시 siRNAs와 axotomized RGCs에 Fluorogold 역행 추적의 지방화를 보여줍니다. Cy3 표시 siRNAs은 즉시 axotomy 후 시신경 스텀프에 주입되었고, 망막이 살아있는 몇 군데했습니다. <img src="/files/ftp_upload/2261/2261fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 시신경 스텀프로 분류 펩티드 또는 siRNAs 중 하나 axotomy 및 주사 후 1 일 flatmounted 망막에 RGCs의 Epifluorescence micrographs. (A) Fluorogold 역행 1 일 postaxotomy에서 axotomized RGCs의 라벨 (B) 표시 펩티드의 역행 교통, 시신경에 axotomy 및 펩타이드 주사 후 일일 다음 RGCs에 Cy3 형광. 의 (C) 중첩 (A)와 (B) Fluorogold 표시 RGCs에 Cy3 레이블 펩티드의 선택 지방화를 시연. (DF) Fluorogold 표시 RGCs (D)의 세포 기관은 또한 오버레이 (F)로 표시 24시간 이전 시신경 스텀프에 주입 Cy3 레이블 siRNAs (E), 가득합니다. AC의 스케일 바에는 50 μm의 수 있습니다. DF의 스케일 바는 20 μm의 수 있습니다.

<ol>
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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

시신경의 절개면은 성인 CNS의 신경 세포의 apoptosis의 높은 재현성 모델입니다. 이 원고에서 보여준 실험 조작은 부상 후 RGC apoptosis의 메커니즘 연구를 허용합니다. Intraocular 주사는 망막의 전세계를 타겟하는 데 유용합니다. 그것이 유리 피펫의 끝에있는 렌즈를 다치게하지 않는 것이 중요합니다 같은이 절차는 연습이 필요합니다. 렌즈 손상은 세포 생존과 재생 20, 21을</s...

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Erratum: Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Stereotaxic Frame</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stoelting, Kopf, WPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rat Gas Mask</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stoelting, Kopf, WPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anesthesia System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VetEquip</td>
<td>901806</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isoflurane (PrAErrane)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baxter Corp</td>
<td>DIN 02225875</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Surgical Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI, Zeiss, Leica</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Alcaine Eye Drops</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Alcon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tears Naturale P.M.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Alcon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fine tip Dumont forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11252-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 &mu;l Hamilton Syringe (1701RN; 26s/2&#x201D;/2)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton Syringe Co.</td>
<td>80030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1/16 inch Compression Fittings</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton Syringe Co.</td>
<td>55751-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1/16 inch OD, 0.010 inch ID, PEEK Tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Supelco, Bellefonte, PA</td>
<td>Z226661</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dual RN Glass Coupler</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton Syringe Co.</td>
<td>55752-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mineral Oil Priming Kit: includes syringe, needles, rubber septa</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton Syringe Co.</td>
<td>PRMKIT</td>
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methods for experimental manipulations after optic nerve transection in the mammalian cns

망막 신경절 세포 (RGCs)는 CNS의 뉴런되는 시신경을 통해 뇌로 망막의 출력 영상 정보. 시신경은 안구의 궤도 내에서 액세스하고 완전히 전체 인구의 RGC axons를 절단 (axotomized) 그었 수 있습니다. 시신경의 절개면은 성인 CNS 1-4에서 apoptotic 세포의 연결을 죽음의 재현성 모델입니다. 눈 유리체 챔버가 intraocular 주사를 통해 실험 조작을 허용, 망막에 약물 전달 캡슐 역할을하기 때문에이 모델은 특히 매력적입니다. 유리 체액을 통해 화학 물질의 확산들은 전체 인구 RGC에 따라 행동을 보장합니다. 바이러스성 벡터, plasmids 또는 짧은 방해 RNAS는 (siRNAs)도 5-12를 망막 세포를 감염 또는 transfect하기 위해 유리 챔버로 전달하실 수 있습니다. Adeno - 관련 바이러스 (AAV) 벡터의 높은 tropism은 주사 사이트 6, 7, 13-15 가까운 세포의 90 %를 접근 감염 속도와 대상 RGCs에 유용합니다. 또한, RGCs은 선택적으로 그들의 목표 우수한 colliculus 10으로 시신경 16-19 또는 주입 벡터의 컷 끝까지 siRNAs, plasmids, 또는 바이러스성 벡터를 적용하여 transfected 수 있습니다. 이것은 연구자들이 다른 방관자의 뉴런이나 주변 glia에 혼란함을 주죠 효과없이 부상의 연결 인구 apoptotic 메커니즘을 공부하실 수 있습니다. RGC apoptosis는 세포 죽음은 세포가 빠르게 타락한 이후 3~4일의 postaxotomy을 지연 의하여 시간 코스 특성이 있습니다. 이것은 apoptosis에 관련된 경로에 대한 이동 실험 조작에 창을 제공합니다. 직접 가로 시신경 스텀프에서 RGCs를 대상으로 노는 즉시 신경을 절단 후, axotomy의 시간에 수행됩니다. 대조적으로, 물질 intraocular 경로를 통해 전달하는 경우, 그들은 axotomized RGCs에서 apoptosis의 개시를 이전, 이전에 수술이나 수술 후 첫 3 일 이내에 주입 수 있습니다. 현재 기사에서 우리는 시신경의 절개 후 실험 조작을위한 여러 가지 방법을 보여줍니다.

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Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

시신경의 절개면은 성인 CNS 손상의 널리 사용되는 모델입니다. 이 모델은 전 세계적으로 망막을 대상에 직접 망막 신경절 세포의 부상의 연결 인구를 대상으로 실험 조작의 번호를 수행하는 데 이상적입니다.

포유류의 CNS에서 시신경의 절개 후 실험에 대한 노는 방법

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.4K 조회수.  University of Toronto. 시신경의 절개면은 성인 CNS 손상의 널리 사용되는 모델입니다. 이 모델은 전 세계적으로 망막을 대상에 직접 망막 신경절 세포의 부상의 연결 인구를 대상으로 실험 조작의 번호를 수행하는 데 이상적입니다.

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Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve 
transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous
 chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals 
through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying short interfering RNAs 
(siRNAs), plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 5-7 or injecting vectors into their target, the superior colliculus 8. 
This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the desired neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. 
An additional benefit is the ease and accuracy with which cell survival can be quantified after injury. The retina is a flat, layered tissue and RGCs are localized in 
the innermost layer, the ganglion cell layer. The survival of RGCs can be tracked over time by applying a fluorescent tracer (3% Fluorogold) to the cut end of the 
optic nerve at the time of axotomy, or by injecting the tracer into the superior colliculus (RGC target) one week prior to axotomy. The tracer is retrogradely transported, labeling 
the entire RGC population. Because the ganglion cell layer is a monolayer (one cell thick), RGC densities can be quantified in flat-mounted tissue, without the need 
for stereology. Optic nerve transection leads to the apoptotic death of 90% of injured RGCs within 14 days postaxotomy 9-11. RGC apoptosis has a 
characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a time window for 
experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. Ninety percent of retinal ganglion cells (RGCs) whose axons are completely transected (axotomy) die within 14 days after axotomy. This model is easily amenable to experimental manipulations and highly reproducible.

시신경의 절개 : 중추 신경계에서 신경 세포의 Apoptosis 성인의 모델

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

연구

신경과학

An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible vision loss. Examples of such diseases in human include traumatic optic neuropathy and optic nerve degeneration in glaucoma. It is characterized by typical changes in the optic nerve head, progressive optic nerve degeneration, and loss of retinal ganglion cells, if uncontrolled, leading to vision loss and blindness.
The optic nerve crush (ONC) injury mouse model is an important experimental disease model for traumatic optic neuropathy, glaucoma, etc. In this model, the crush injury to the optic nerve leads to gradual retinal ganglion cells apoptosis. This disease model can be used to study the general processes and mechanisms of neuronal death and survival, which is essential for the development of therapeutic measures. In addition, pharmacological and molecular approaches can be used in this model to identify and test potential therapeutic reagents to treat different types of optic neuropathy.
Here, we provide a step by step demonstration of (I) Baseline retrograde labeling of retinal ganglion cells (RGCs) at day 1, (II) Optic nerve crush injury at day 4, (III) Harvest the retinae and analyze RGC survival at day 11, and (IV) Representative result.

This protocol shows how to retrogradely label retinal ganglion cells, and how to subsequently make an optic nerve crush injury in order to analyze retinal ganglion cell survival and apoptosis. It is an experimental disease model for different types of optic neuropathy, including glaucoma.

망막 신경절 세포의 생존을 공부 시신경의 호감 상해 Murine 모델

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible ...

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory system is characterized by its ability to give rise to new neurons even in adult animals. This particular ability is partly due to the presence of OECs which create a favorable microenvironment for neurogenesis. This property of OECs has been used for cellular transplantation such as in spinal cord injury models. Although the peripheral nervous system has a greater capacity to regenerate after nerve injury than the central nervous system, complete sections induce misrouting during axonal regrowth in particular after facial of laryngeal nerve transection. Specifically, full sectioning of the recurrent laryngeal nerve (RLN) induces aberrant axonal regrowth resulting in synkinesis of the vocal cords. In this specific model, we showed that OECs transplantation efficiently increases axonal regrowth.
OECs are constituted of several subpopulations present in both the olfactory mucosa (OM-OECs) and the olfactory bulbs (OB-OECs). We present here a model of cellular transplantation based on the use of these different subpopulations of OECs in a RLN injury model. Using this paradigm, primary cultures of OB-OECs and OM-OECs were transplanted in Matrigel after section and anastomosis of the RLN. Two months after surgery, we evaluated transplanted animals by complementary analyses based on videolaryngoscopy, electromyography (EMG), and histological studies. First, videolaryngoscopy allowed us to evaluate laryngeal functions, in particular muscular cocontractions phenomena. Then, EMG analyses demonstrated richness and synchronization of muscular activities. Finally, histological studies based on toluidine blue staining allowed the quantification of the number and profile of myelinated fibers.
All together, we describe here how to isolate, culture, identify and transplant OECs from OM and OB after RLN section-anastomosis and how to evaluate and analyze the efficiency of these transplanted cells on axonal regrowth and laryngeal functions.

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth of the primary olfactory neurons. This specific property can be used for cellular transplantation. We present here a model of cellular transplantation based on the use of OECs in a laryngeal nerve injury model.

말초 신경 손상 후 기능 회복을 평가하기 위해 후각 Ensheathing 세포의 이식

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

The nervous system is often described as a hard-wired component of the body even though it is a considerably fluid organ system that reacts to external stimuli in a consistent, stereotyped manner, while maintaining incredible flexibility and plasticity. Unlike the central nervous system (CNS), the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair, but we have only just begun to understand the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using zebrafish as a model system, we have the unprecedented opportunity to couple regenerative studies with in vivo imaging and genetic manipulation. Peripheral nerves are composed of axons surrounded by layers of glia and connective tissue. Axons are ensheathed by myelinating or non-myelinating Schwann cells, which are in turn wrapped into a fascicle by a cellular sheath called the perineurium. Following an injury, adult peripheral nerves have the remarkable capacity to remove damaged axonal debris and re-innervate targets. To investigate the roles of all peripheral glia in PNS regeneration, we describe here an axon transection assay that uses a commercially available nitrogen-pumped dye laser to axotomize motor nerves in live transgenic zebrafish. We further describe the methods to couple these experiments to time-lapse imaging of injured and control nerves. This experimental paradigm can be used to not only assess the role that glia play in nerve regeneration, but can also be the platform for elucidating the molecular mechanisms that govern nervous system repair.

Although the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair after injury, little is known about the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using live, transgenic zebrafish and a reproducible nerve transection assay, we can study dynamic glial cell behaviors during nerve degeneration and regeneration.

모터 신경 절개와 라이브 제브라 피쉬의 아교 세포 행동의 시간 경과 영상

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

글루타민산 염과 GABA의 빠른 마이크로 이온 도입 : 시냅틱 통합을 조사하는 유용한 도구

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

The rodent visual system encompasses retinal ganglion cells and their axons that form the optic nerve to enter thalamic and midbrain centers, and postsynaptic projections to the visual cortex. Based on its distinct anatomical structure and convenient accessibility, it has become the favored structure for studies on neuronal survival, axonal regeneration, and synaptic plasticity. Recent advancements in MR imaging have enabled the in vivo visualization of the retino-tectal part of this projection using manganese mediated contrast enhancement (MEMRI). Here, we present a MEMRI protocol for illustration of the visual projection in mice, by which resolutions of (200 &#181;m)3 can be achieved using common 3 Tesla scanners. We demonstrate how intravitreal injection of a single dosage of 15 nmol MnCl2 leads to a saturated enhancement of the intact projection within 24 hr. With exception of the retina, changes in signal intensity are independent of coincided visual stimulation or physiological aging. We further apply this technique to longitudinally monitor axonal degeneration in response to acute optic nerve injury, a paradigm by which Mn2+ transport completely arrests at the lesion site. Conversely, active Mn2+ transport is quantitatively proportionate to the viability, number, and electrical activity of axon fibers. For such an analysis, we exemplify Mn2+ transport kinetics along the visual path in a transgenic mouse model (NF-&#954;B p50KO) displaying spontaneous atrophy of sensory, including visual, projections. In these mice, MEMRI indicates reduced but not delayed Mn2+ transport as compared to wild type mice, thus revealing signs of structural and/or functional impairments by NF-&#954;B mutations.
In summary, MEMRI conveniently bridges in vivo assays and post mortem histology for the characterization of nerve fiber integrity and activity. It is highly useful for longitudinal studies on axonal degeneration and regeneration, and investigations of mutant mice for genuine or inducible phenotypes.

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

This video illustrates a method, using a clinical 3 T scanner, for contrast-enhanced MR imaging of the na&#239;ve mouse visual projection and for repetitive and longitudinal in vivo studies of optic nerve degeneration associated with acute optic nerve crush injury and chronic optic nerve degeneration in knock-out mice (p50KO).

마우스의 조영 증강 MRI에 의한 시신경 섬유 무결성의 생체 내 이미징

The rodent visual system encompasses retinal ganglion cells and their axons that form the optic nerve to enter thalamic and midbrain centers, and ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

애벌레 Zebrafish의 척수 절개

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

Minimally-invasive Technique for Injection into Rat Optic Nerve

The rat optic nerve is a useful model for stem cell regeneration research. Direct injection into the rat optic nerve allows delivery into the central nervous system in a minimally-invasive surgery without bone removal. This technique describes an approach to visualization and direct injection of the optic nerve following minor fascial dissection from the orbital ridge, using a conjunctival traction suture to gently pull the eye down and out. Representative examples of an injected optic nerve show successful injection of dyed beads.

Direct injection into the rat optic nerve is useful for regenerative research. We demonstrate a minimally-invasive technique for direct injection into a rat optic nerve that does not involve opening the skull. Using this method, surgical complications are minimized and recovery is more rapid.

쥐 시신경에 주입을위한 최소 침습 기술

The rat optic nerve is a useful model for stem cell regeneration research. Direct injection into the rat optic nerve allows delivery into the central ...

Visual Evoked Potential Recording in a Rat Model of Experimental Optic Nerve Demyelination

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to monitor the disease course in the follow-up period. Changes in the VEP parameters closely correlate with pathological damage in the optic nerve. This protocol provides a detailed description about the rodent model of optic nerve microinjection, in which a partial demyelination lesion is produced in the optic nerve. VEP recording techniques are also discussed. Using skull implanted electrodes, we are able to acquire reproducible intra-session and between-session VEP traces. VEPs can be recorded on individual animals over a period of time to assess the functional changes in the optic nerve longitudinally. The optic nerve demyelination model, in conjunction with the VEP recording protocol, provides a tool to investigate the disease processes associated with demyelination and remyelination, and can potentially be employed to evaluate the effects of new remyelinating drugs or neuroprotective therapies.

Focal demyelination is induced in the optic nerve using lysolecithin microinjection. Visual evoked potentials are recorded via skull electrodes implanted over the visual cortex to examine the signal conduction along the visual pathway in vivo. This protocol details the surgical procedures underlying electrode implantation and optic nerve microinjection.

실험 시신경의 탈수 초화의 쥐 모델에서 시각 유발 전위 기록

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to ...

Exposure of the Pig CNS for Histological Analysis: A Manual for Decapitation, Skull Opening, and Brain Removal

Pigs have become increasingly popular in large-animal translational neuroscience research as an economically and ethically feasible substitute to non-human primates. The large brain size of the pig allows the use of conventional clinical brain imagers and the direct use and testing of neurosurgical procedures and equipment from the human clinic. Further macroscopic and histological analysis, however, requires postmortem exposure of the pig central nervous system (CNS) and subsequent brain removal. This is not an easy task, as the pig CNS is encapsulated by a thick, bony skull and spinal column. The goal of this paper and instructional video is to describe how to expose and remove the postmortem pig brain and the pituitary gland in an intact state, suitable for subsequent macroscopic and histological analysis.

The goal of this paper and instructional video is to describe how to expose and remove the postmortem pig brain and pituitary gland in an intact state, suitable for subsequent macroscopic and histological analysis.