PDK es apoyado por una subvención de funcionamiento CIHR (MOP 86523)

1. Técnica quirúrgica <ol><li> Los experimentos deben llevarse a cabo utilizando una técnica aséptica y siguiendo los protocolos de uso de los animales de su institución específica. Instrumentos y materiales (soluciones, las sustancias químicas, marcadores, agujas, etc) que entran en contacto con el tejido vivo debe ser estéril para prevenir la infección y los efectos negativos sobre el bienestar animal y los posibles impactos negativos en el estudio. </li></ol> 2. Anestesia <ol><li> Las ratas se anestesiaron con un sistema veterinario vaporizador isoflurano. El uso de oxígeno de uso médico a un ritmo de 0,8 L / min para vaporizar el gas isoflurano. Colocar el animal en el cuadro adjunto de anestesia y marcar en una concentración de isoflurano del 4% hasta que la respiración se ha desacelerado y el animal está tranquilo. </li><li> A continuación, cambiar el flujo de gas a la unión máscara de gas para el marco estereotáxico y el lugar del animal en el aparato estereotáxico. A su vez la concentración de isoflurano al 2% y el monitor de anestesia. Los animales más grandes (&gt; 300 g) pueden requerir una mayor concentración de isoflurano. Anestesia deben ser controlados durante la cirugía y la dosis de isoflurano ajustarse en consecuencia. Profundidad y la velocidad de la respiración debe ser constantemente evaluados, y la evaluación de los pies de presión (cada 5 minutos) por la ausencia de dolor profundo se debe realizar. </li><li> Una vez terminada la cirugía, apague el isoflurano y permitir que el animal oxígeno respiración durante varios minutos antes de la remoción del dispositivo estereotáxico. La temperatura del cuerpo se debe mantener al cubrir al animal con una manta quirúrgico y / o el uso de una manta de calefacción regulada durante la cirugía. </li></ol> 3. Preparación para la jeringa inyecciones intraoculares <ol><li> En primer lugar, montar el sistema de jeringa para la realización de las inyecciones intraoculares. A 10 l RN hermética 1701 Jeringa Hamilton se utiliza para la inyección. Eliminar cualquier aguja o presente RN tuerca en el extremo de la jeringa. </li><li> Inserte el casquillo PFA en la taza PEEK casquillo de la conexión de compresión. A continuación, inserte la instalación completa en el extremo de la jeringa y sin apretar la tuerca de tornillo de RN sobre la parte superior. </li><li> Inserte un extremo del tubo de PEEK 1 / 16 pulgadas en la conexión de compresión, a través de la apertura de la tuerca de RN. Asegúrese de que el tubo de PEEK está totalmente asentado. Apretar la tuerca de RN para comprimir el manguito, el sellado de la tubería de PEEK. </li><li> Realice el paso 3.2 en ambos extremos del acoplador de vidrio de doble RN. Conecte el extremo libre del tubo PEEK a un extremo del acoplador de vidrio de doble RN apretando la tuerca de RN. </li><li> Una micropipeta de vidrio tirado a la forma de la aguja y el barril para el sistema de inyección. El uso de 1,5 mm de espesor OD tubo capilar de vidrio de paredes para la fabricación de las pipetas de vidrio, e insertar la pipeta de vidrio en el extremo libre del acoplador de vidrio de doble RN. Apretar la tuerca de RN para fijar la pipeta en el lugar. </li><li> La fina punta de pipetas de vidrio tirado suele ser demasiado pequeña para la realización de inyecciones intraoculares. Con el fin de crear una punta de diámetro apropiado, romper la punta de la pipeta de vidrio bajo la guía visual, utilizando un microscopio quirúrgico. El extremo esmerilado de un portaobjetos de vidrio muestra es muy adecuado para romper la pipeta. Mantener la pipeta en un ángulo y frote la punta a lo largo de la escarcha de cristal para crear un salto. Idealmente, la punta final debe ser ligeramente biselados. Puede tomar varios intentos para producir un buen consejo, así que tire pipetas múltiples antes de su uso. </li><li> El sistema de inyección es hidráulico. Por lo tanto, la jeringa, tubo conector PEEK, doble enganche RN de vidrio y la micropipeta de vidrio debe ser llenado con aceite mineral antes de su uso. Utilizando el kit de cebado de Hamilton jeringa Co. (PRMKIT), llenar la jeringa imprimación con aceite mineral. Use una aguja de gran diámetro para permitir el paso de la aceite viscoso. Vuelva a colocar la aguja con el Hamilton 90030 aguja que encaja dentro del cuerpo de la jeringa de 10 l Hamilton. A continuación, coloque un tapón de goma sobre el Hamilton 90030 aguja, con el fin de proporcionar un sellado mientras se inyecta el aceite mineral. </li><li> Inserte el Hamilton 90030 aguja de la jeringa de cebado en la parte posterior del barril de la jeringa de 10 l Hamilton del sistema de inyección. Pulse el tabique firmemente contra el extremo de la jeringa para crear un sello. </li><li> Lentamente el émbolo. Usted verá el paso de aceite mineral a través de los elementos de cristal del sistema de inyección y, finalmente, llenar la pipeta de vidrio. Expulsar todo el aceite a través del sistema de inyección con el fin de eliminar cualquier burbuja de aire a lo largo de las vías. Si la jeringa de llenado se está quedando sin aceite mineral, extraiga lentamente la aguja mientras que constantemente distribución de aceite para evitar la formación de burbujas de aire. Vuelva a llenar la jeringa de cebado y se inyecta de nuevo. </li><li> Cuando el sistema está lleno de aceite mineral y sin burbujas, inserte el émbolo de la jeringa original de 10 l Hamilton. El émbolo hasta el final de su recorrido con el fin de eliminar el aceite mineral adicional del sistema. Limpie el cristal micropipeta limpio y el final de la jeringa limpia con etanol al 70%. </li><li> Las retiradasw el émbolo de la jeringa hasta la marca de 2 l en el barril. El final de la micropipeta de vidrio se llenan de aire que proporciona una zona de amortiguación entre el aceite mineral y el fluido que se desea inyectar. El barril de pipeta de ahora puede ser llenado por la colocación de la final de la micropipeta en la solución deseada y retirar el émbolo de la jeringa Hamilton. No inyecte más de 5.4 L de solución en un ojo de la rata adulta. </li></ol> 4. Procedimiento de inyección intraocular: Orientación de la Retina A nivel mundial <ol><li> Con el animal anestesiado y asegurado en el marco estereotáxico (como se describe en la Sección 2), use los ojos Alcaine gotas para anestesiar tópicamente la córnea. Abra los párpados con los dedos y coloque una gota de la solución anestésica en la superficie de la córnea. </li><li> Inyección se necesitan dos personas: una para insertar la pipeta de vidrio en la cámara vítrea y mantener la posición de la pipeta, y otro para el émbolo de la jeringa que ofrece la solución deseada. </li><li> Bajo un microscopio quirúrgico agarre, el vidrio micropipeta y el acoplador de doble vidrio RN con los dedos. Difusión de los párpados con los dedos de su mano libre, formando una &quot;V&quot; frente al sitio de la inyección. Mediante la aplicación de la tracción para los párpados, el ojo se eleva fuera de la órbita, la exposición de la superficie posterior detrás del limbo. Mediante la creación de una &quot;V&quot; con los dedos frente al sitio de la inyección, una cuna está formado por el ojo que proporciona estabilidad al inyectarse. </li><li> Introduzca suavemente la punta de la micropipeta de vidrio a través de la conjuntiva, en una zona desprovista de vasos sanguíneos, ya través de la esclerótica, en un ángulo hacia abajo. Usted debe sentir un pequeño &quot;pop&quot; cuando la pipeta atraviesa la esclerótica. Inserción de la pipeta en un ángulo ligeramente hacia abajo, reduce la posibilidad de alcanzar el objetivo al insertar la aguja. </li><li> La persona que sostiene la jeringa ahora debe inyectar el l 4 de solución al presionar el émbolo hasta la marca de los 2 l de la jeringa. La inyección debe tener aproximadamente entre uno y dos segundos en total. La inyección a un ritmo muy lento&gt; 3 segundos reduce la propagación inicial de la solución a través de la cámara vítrea. Usted será capaz de ver la solución que se inyecta a través de la limpieza de la cámara vítrea bajo el microscopio, por lo tanto verificar el éxito del procedimiento. </li><li> Mantener la micropipeta constante durante unos 5 segundos y luego se retiran, en la misma dirección que la aguja se inserta. La conjuntiva se solapa en la pequeña abertura, lo que ayuda a sellar la perforación escleral. </li><li> Cubra la superficie de la córnea del ojo con el ungüento oftálmico (Tears Naturale PM) con el fin de evitar que se seque la córnea durante la recuperación, y devolver el animal a una jaula de recuperación. </li><li> Post-quirúrgica analgésicos deben ser administrados de acuerdo a las directrices de las autoridades de su cuidado de los animales y los animales deben ser controlados cuidadosamente después de la cirugía. </li></ol> 5. Selectivamente en las células ganglionares de la retina del tronco del nervio óptico <ol><li> La aplicación de los marcadores, las drogas, los plásmidos, siRNAs o vectores virales para muñón del nervio óptico, después de axotomía, apunta directamente a las células ganglionares de la retina a través del transporte retrógrado. Esto se logra, en primer lugar la realización de una transección del nervio óptico de acuerdo con el &quot;Protocolo de transección del nervio óptico&quot; 22. </li><li> Hay dos métodos principales para llevar a cabo este procedimiento: el uso de espuma de gel o de inyección directa en el nervio óptico. </li><li> El método es similar a la espuma de gel retrógrada localización, sin embargo, cuando la entrega de los tratamientos experimentales en el nervio óptico que es conveniente que las células ganglionares de la retina antes de la etiqueta mediante la inyección de trazadores retrógrados en el colículo superior 1 semana antes de axotomía. Esto es importante para la célula de seguimiento, ya que, en algunos casos, los marcadores neuronales pueden interferir con el transporte retrógrado de sustancias experimentales o viceversa. </li><li> Inmediatamente después de que el nervio óptico se corta, un pequeño pedazo de espuma de gel empapada en la solución experimental se coloca sobre el muñón del nervio óptico seccionado. El contenido de la órbita se devuelven a su ubicación anterior. Cuando el ojo se devuelve a una posición neutral, es necesario el uso de fórceps para empujar la pieza de espuma de gel hacia abajo en la órbita, asegurando que ésta permanezca por encima del extremo del nervio óptico. </li><li> La técnica de inyección es más eficaz para la entrega de las sustancias que deben tener acceso al citoplasma del axón para ser transportados por vía retrógrada flujo de axoplasma. Esto incluye siRNAs y plásmidos, y en algunos casos, los vectores virales. Una jeringa de 5-10 l Hamilton se utiliza para inyectar la solución deseada en el nervio óptico seccionado. </li><li> Agarre el borde del nervio óptico con punta fina pinza de Dumont. Inserte el extremo de la aguja en el nervio óptico, en paralelo con el nervio, hasta que el bisel ya no es visible. La aguja que se inserta a ser encerrado por todos lados por el nervio. Una aguja con un bisel corto es deseable. </li><li> Una vez que el nEedle se inserta en el nervio, apriete suavemente los lados de los nervios con las pinzas de punta fina y se inyecta una cuarta parte de la solución mientras se gira la jeringa un cuarto de vuelta en sentido horario o antihorario. </li><li> Seguir repitiendo el paso 5.7 hasta que haya completado una rotación completa de la aguja y se inyecta todo el contenido de la jeringa. Para obtener los mejores resultados de inyectar un total de 10 l de la solución mediante un hermético 10 l jeringa Hamilton. </li><li> Retire la punta de la jeringa del nervio. Deje el exceso de líquido por vía parenteral que tiene reflujo de los nervios dentro de la órbita, ya que esto forma una reserva adicional para su absorción por los extremos de los axones. </li><li> Devolver el contenido de la órbita a su posición original, cerca de la herida, y permitir que el animal pueda recuperarse. </li><li> Post-quirúrgica analgésicos deben ser administrados de acuerdo a las directrices de las autoridades de su cuidado de los animales y los animales deben ser controlados cuidadosamente después de la cirugía. </li></ol> 6. Los resultados representativos: Inyecciones intraoculares objetivo de todas las células de la retina a nivel mundial, y funcionan bien para las sustancias de entrega de CGR heridos desde las células ganglionares se encuentran en la capa más interna neuronal de la retina, adyacente a la cámara vítrea. CGR también pueden ser blanco directo de la entrega de las sustancias en el muñón del nervio óptico seccionado. CGR Fluorogold retrógrada etiquetado puede ser objetivo con los péptidos, las drogas, los vectores, plásmidos o siRNAs del tronco del nervio, como se ilustra en la Figura 1. Figura 1A-C muestra la localización de un péptido marcado Cy3 en el somata de la CGR que se pre-etiquetados mediante la inyección de Fluorogold en el colículo superior. Cy3 péptidos marcados fueron inyectados en el nervio óptico inmediatamente después de axotomía, y la retina fue fotografiado con vida con el fin de evitar que los péptidos de la lixiviación de los tejidos durante la fijación. Figura 1D-F demuestra la localización de Cy3 siRNAs etiquetado y el trazador retrógrado Fluorogold en CGR axotomized. Cy3 etiquetados siRNAs fueron inyectadas en el tronco del nervio óptico inmediatamente después de axotomía, y la retina fue fotografiado con vida. <img src="/files/ftp_upload/2261/2261fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Micrografías epifluorescencia de la CGR en las retinas de flatmounted menos 1 día después de axotomía y la inyección de cualquiera de los péptidos etiquetados o siRNAs en el tronco del nervio óptico. (A) Fluorogold retrógrada etiquetado en CGR axotomized menos 1 día postaxotomy (B) Cy3 fluorescencia en CGR siguiente transporte retrógrado de péptidos marcados, un día después de axotomía y la inyección de péptido en el nervio óptico. (C) Superposición de (A) y (B) que demuestra la localización selectiva de Cy3 péptidos marcados en CGR Fluorogold etiquetados. (DF) Los cuerpos celulares de Fluorogold CGR etiqueta (D) también están llenos de Cy3 etiquetados siRNAs (E) inyecta en el tronco del nervio óptico 24 horas antes, como se muestra en la plantilla (F). Barra de escala en la AC es de 50 micras. Barra de escala en el DF es de 20 micras.

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Transección del nervio óptico es un modelo altamente reproducible de la apoptosis de las neuronas del SNC adulto. Las manipulaciones experimentales demostraron en este manuscrito permite el estudio de los mecanismos de apoptosis RGC después de la lesión. Inyecciones intraoculares son útiles para la orientación global de la retina. Este procedimiento requiere una cierta práctica, ya que es fundamental para no dañar la lente con la punta de la pipeta de vidrio. Daños en el objetivo ha...

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Erratum: Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

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		<div>
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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Stereotaxic Frame</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stoelting, Kopf, WPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rat Gas Mask</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stoelting, Kopf, WPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anesthesia System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VetEquip</td>
<td>901806</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isoflurane (PrAErrane)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baxter Corp</td>
<td>DIN 02225875</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Surgical Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI, Zeiss, Leica</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Alcaine Eye Drops</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Alcon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tears Naturale P.M.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Alcon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fine tip Dumont forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11252-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 &mu;l Hamilton Syringe (1701RN; 26s/2&#x201D;/2)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton Syringe Co.</td>
<td>80030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1/16 inch Compression Fittings</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton Syringe Co.</td>
<td>55751-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1/16 inch OD, 0.010 inch ID, PEEK Tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Supelco, Bellefonte, PA</td>
<td>Z226661</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dual RN Glass Coupler</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton Syringe Co.</td>
<td>55752-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mineral Oil Priming Kit: includes syringe, needles, rubber septa</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton Syringe Co.</td>
<td>PRMKIT</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
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methods for experimental manipulations after optic nerve transection in the mammalian cns

Las células ganglionares de la retina (CGR) son las neuronas del SNC que la producción de información visual desde la retina hasta el cerebro, a través del nervio óptico. El nervio óptico se puede acceder dentro de la órbita del ojo y completamente seccionado (axotomized), el corte de los axones de la población RGC todo. Transección del nervio óptico es un modelo reproducible de la muerte apoptótica de las células neuronales en el SNC adulto 1-4. Este modelo es particularmente atractivo debido a que la cámara vítrea del ojo actúa como una cápsula para administración de fármacos a la retina, lo que permite manipulaciones experimentales a través de inyecciones intraoculares. La difusión de los productos químicos a través del humor vítreo se asegura de que actúan sobre la población RGC todo. Vectores virales, los plásmidos o corto RNAs de interferencia (siRNA) también puede ser entregado a la cámara vítrea para infectar o transfectar células de la retina 05.12. El tropismo de alta de virus adeno-asociado (AAV) vectores es beneficioso para la CGR de destino, con una tasa de infección cercana al 90% de las células cerca del sitio de la inyección 6, 7, 13-15. Por otra parte, la CGR puede ser selectiva transfectadas mediante la aplicación de siRNAs, plásmidos o vectores virales para el extremo del corte del nervio óptico o vectores 16-19 inyectar en su objetivo el colículo superior 10. Esto permite a los investigadores a estudiar los mecanismos de apoptosis en la población de neuronas lesionadas, sin factores de confusión en las neuronas o glía espectador otras circundantes. RGC apoptosis tiene una característica de tiempo-por supuesto por el que se retrasa la muerte celular postaxotomy 3-4 días, después de que las células degeneran rápidamente. Esto proporciona una ventana para la manipulación experimental dirigida contra los involucrados en la apoptosis. Manipulaciones que afectan directamente a la CGR del tronco del nervio óptico seccionado se llevan a cabo en el momento de axotomía, inmediatamente después de cortar el nervio. Por el contrario, cuando las sustancias son entregados a través de una vía intraocular, que puede ser inyectada antes de la cirugía o durante los primeros 3 días después de la cirugía, antes de la iniciación de la apoptosis en CGR axotomized. En el presente artículo, demostramos varios métodos para la manipulación experimental después de la transección del nervio óptico.

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Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

Transección del nervio óptico es un modelo ampliamente utilizado de la lesión en el SNC adulto. Este modelo es ideal para llevar a cabo una serie de manipulaciones experimentales que se dirigen a la retina a nivel mundial o directamente dirigidos a la población heridos neuronal de las células ganglionares de la retina.

Los métodos para la manipulación experimental después de la transección del nervio óptico en el SNC de los mamíferos

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.3K vistas.  University of Toronto. Transección del nervio óptico es un modelo ampliamente utilizado de la lesión en el SNC adulto. Este modelo es ideal para llevar a cabo una serie de manipulaciones experimentales que se dirigen a la retina a nivel mundial o directamente dirigidos a la población heridos neuronal de las células ganglionares de la retina.

Video: Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve 
transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous
 chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals 
through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying short interfering RNAs 
(siRNAs), plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 5-7 or injecting vectors into their target, the superior colliculus 8. 
This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the desired neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. 
An additional benefit is the ease and accuracy with which cell survival can be quantified after injury. The retina is a flat, layered tissue and RGCs are localized in 
the innermost layer, the ganglion cell layer. The survival of RGCs can be tracked over time by applying a fluorescent tracer (3% Fluorogold) to the cut end of the 
optic nerve at the time of axotomy, or by injecting the tracer into the superior colliculus (RGC target) one week prior to axotomy. The tracer is retrogradely transported, labeling 
the entire RGC population. Because the ganglion cell layer is a monolayer (one cell thick), RGC densities can be quantified in flat-mounted tissue, without the need 
for stereology. Optic nerve transection leads to the apoptotic death of 90% of injured RGCs within 14 days postaxotomy 9-11. RGC apoptosis has a 
characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a time window for 
experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. Ninety percent of retinal ganglion cells (RGCs) whose axons are completely transected (axotomy) die within 14 days after axotomy. This model is easily amenable to experimental manipulations and highly reproducible.

La transección del nervio óptico: un modelo de apoptosis neuronal de adultos en el sistema nervioso central

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

Investigación

Neurociencias

An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible vision loss. Examples of such diseases in human include traumatic optic neuropathy and optic nerve degeneration in glaucoma. It is characterized by typical changes in the optic nerve head, progressive optic nerve degeneration, and loss of retinal ganglion cells, if uncontrolled, leading to vision loss and blindness.
The optic nerve crush (ONC) injury mouse model is an important experimental disease model for traumatic optic neuropathy, glaucoma, etc. In this model, the crush injury to the optic nerve leads to gradual retinal ganglion cells apoptosis. This disease model can be used to study the general processes and mechanisms of neuronal death and survival, which is essential for the development of therapeutic measures. In addition, pharmacological and molecular approaches can be used in this model to identify and test potential therapeutic reagents to treat different types of optic neuropathy.
Here, we provide a step by step demonstration of (I) Baseline retrograde labeling of retinal ganglion cells (RGCs) at day 1, (II) Optic nerve crush injury at day 4, (III) Harvest the retinae and analyze RGC survival at day 11, and (IV) Representative result.

This protocol shows how to retrogradely label retinal ganglion cells, and how to subsequently make an optic nerve crush injury in order to analyze retinal ganglion cell survival and apoptosis. It is an experimental disease model for different types of optic neuropathy, including glaucoma.

Un aplastamiento del nervio óptico Lesiones modelo murino para estudiar la supervivencia de células ganglionares retinianas

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible ...

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory system is characterized by its ability to give rise to new neurons even in adult animals. This particular ability is partly due to the presence of OECs which create a favorable microenvironment for neurogenesis. This property of OECs has been used for cellular transplantation such as in spinal cord injury models. Although the peripheral nervous system has a greater capacity to regenerate after nerve injury than the central nervous system, complete sections induce misrouting during axonal regrowth in particular after facial of laryngeal nerve transection. Specifically, full sectioning of the recurrent laryngeal nerve (RLN) induces aberrant axonal regrowth resulting in synkinesis of the vocal cords. In this specific model, we showed that OECs transplantation efficiently increases axonal regrowth.
OECs are constituted of several subpopulations present in both the olfactory mucosa (OM-OECs) and the olfactory bulbs (OB-OECs). We present here a model of cellular transplantation based on the use of these different subpopulations of OECs in a RLN injury model. Using this paradigm, primary cultures of OB-OECs and OM-OECs were transplanted in Matrigel after section and anastomosis of the RLN. Two months after surgery, we evaluated transplanted animals by complementary analyses based on videolaryngoscopy, electromyography (EMG), and histological studies. First, videolaryngoscopy allowed us to evaluate laryngeal functions, in particular muscular cocontractions phenomena. Then, EMG analyses demonstrated richness and synchronization of muscular activities. Finally, histological studies based on toluidine blue staining allowed the quantification of the number and profile of myelinated fibers.
All together, we describe here how to isolate, culture, identify and transplant OECs from OM and OB after RLN section-anastomosis and how to evaluate and analyze the efficiency of these transplanted cells on axonal regrowth and laryngeal functions.

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth of the primary olfactory neurons. This specific property can be used for cellular transplantation. We present here a model of cellular transplantation based on the use of OECs in a laryngeal nerve injury model.

El trasplante de células ensheathing olfativo para evaluar la recuperación funcional después de la lesión del nervio periférico

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

The nervous system is often described as a hard-wired component of the body even though it is a considerably fluid organ system that reacts to external stimuli in a consistent, stereotyped manner, while maintaining incredible flexibility and plasticity. Unlike the central nervous system (CNS), the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair, but we have only just begun to understand the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using zebrafish as a model system, we have the unprecedented opportunity to couple regenerative studies with in vivo imaging and genetic manipulation. Peripheral nerves are composed of axons surrounded by layers of glia and connective tissue. Axons are ensheathed by myelinating or non-myelinating Schwann cells, which are in turn wrapped into a fascicle by a cellular sheath called the perineurium. Following an injury, adult peripheral nerves have the remarkable capacity to remove damaged axonal debris and re-innervate targets. To investigate the roles of all peripheral glia in PNS regeneration, we describe here an axon transection assay that uses a commercially available nitrogen-pumped dye laser to axotomize motor nerves in live transgenic zebrafish. We further describe the methods to couple these experiments to time-lapse imaging of injured and control nerves. This experimental paradigm can be used to not only assess the role that glia play in nerve regeneration, but can also be the platform for elucidating the molecular mechanisms that govern nervous system repair.

Although the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair after injury, little is known about the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using live, transgenic zebrafish and a reproducible nerve transection assay, we can study dynamic glial cell behaviors during nerve degeneration and regeneration.

Motor transección del nervio y Time-lapse de imágenes de Conductas de células gliales en el pez cebra en vivo

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Fast Micro-iontoforesis de glutamato y GABA: una herramienta útil para investigar la integración sináptica

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

The rodent visual system encompasses retinal ganglion cells and their axons that form the optic nerve to enter thalamic and midbrain centers, and postsynaptic projections to the visual cortex. Based on its distinct anatomical structure and convenient accessibility, it has become the favored structure for studies on neuronal survival, axonal regeneration, and synaptic plasticity. Recent advancements in MR imaging have enabled the in vivo visualization of the retino-tectal part of this projection using manganese mediated contrast enhancement (MEMRI). Here, we present a MEMRI protocol for illustration of the visual projection in mice, by which resolutions of (200 &#181;m)3 can be achieved using common 3 Tesla scanners. We demonstrate how intravitreal injection of a single dosage of 15 nmol MnCl2 leads to a saturated enhancement of the intact projection within 24 hr. With exception of the retina, changes in signal intensity are independent of coincided visual stimulation or physiological aging. We further apply this technique to longitudinally monitor axonal degeneration in response to acute optic nerve injury, a paradigm by which Mn2+ transport completely arrests at the lesion site. Conversely, active Mn2+ transport is quantitatively proportionate to the viability, number, and electrical activity of axon fibers. For such an analysis, we exemplify Mn2+ transport kinetics along the visual path in a transgenic mouse model (NF-&#954;B p50KO) displaying spontaneous atrophy of sensory, including visual, projections. In these mice, MEMRI indicates reduced but not delayed Mn2+ transport as compared to wild type mice, thus revealing signs of structural and/or functional impairments by NF-&#954;B mutations.
In summary, MEMRI conveniently bridges in vivo assays and post mortem histology for the characterization of nerve fiber integrity and activity. It is highly useful for longitudinal studies on axonal degeneration and regeneration, and investigations of mutant mice for genuine or inducible phenotypes.

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

This video illustrates a method, using a clinical 3 T scanner, for contrast-enhanced MR imaging of the na&#239;ve mouse visual projection and for repetitive and longitudinal in vivo studies of optic nerve degeneration associated with acute optic nerve crush injury and chronic optic nerve degeneration in knock-out mice (p50KO).

Imágenes in vivo de Óptica de Fibras Nerviosas Integridad de la RM con contraste en ratones

The rodent visual system encompasses retinal ganglion cells and their axons that form the optic nerve to enter thalamic and midbrain centers, and ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

La transección de la médula espinal en el pez cebra larval

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

Minimally-invasive Technique for Injection into Rat Optic Nerve

The rat optic nerve is a useful model for stem cell regeneration research. Direct injection into the rat optic nerve allows delivery into the central nervous system in a minimally-invasive surgery without bone removal. This technique describes an approach to visualization and direct injection of the optic nerve following minor fascial dissection from the orbital ridge, using a conjunctival traction suture to gently pull the eye down and out. Representative examples of an injected optic nerve show successful injection of dyed beads.

Direct injection into the rat optic nerve is useful for regenerative research. We demonstrate a minimally-invasive technique for direct injection into a rat optic nerve that does not involve opening the skull. Using this method, surgical complications are minimized and recovery is more rapid.

Técnica mínimamente invasiva para la inyección en nervio óptico de la rata

The rat optic nerve is a useful model for stem cell regeneration research. Direct injection into the rat optic nerve allows delivery into the central ...

Visual Evoked Potential Recording in a Rat Model of Experimental Optic Nerve Demyelination

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to monitor the disease course in the follow-up period. Changes in the VEP parameters closely correlate with pathological damage in the optic nerve. This protocol provides a detailed description about the rodent model of optic nerve microinjection, in which a partial demyelination lesion is produced in the optic nerve. VEP recording techniques are also discussed. Using skull implanted electrodes, we are able to acquire reproducible intra-session and between-session VEP traces. VEPs can be recorded on individual animals over a period of time to assess the functional changes in the optic nerve longitudinally. The optic nerve demyelination model, in conjunction with the VEP recording protocol, provides a tool to investigate the disease processes associated with demyelination and remyelination, and can potentially be employed to evaluate the effects of new remyelinating drugs or neuroprotective therapies.

Focal demyelination is induced in the optic nerve using lysolecithin microinjection. Visual evoked potentials are recorded via skull electrodes implanted over the visual cortex to examine the signal conduction along the visual pathway in vivo. This protocol details the surgical procedures underlying electrode implantation and optic nerve microinjection.

Grabación de potencial evocado visual en un modelo de rata de Experimental del Nervio Óptico Desmielinización

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to ...

Exposure of the Pig CNS for Histological Analysis: A Manual for Decapitation, Skull Opening, and Brain Removal

Pigs have become increasingly popular in large-animal translational neuroscience research as an economically and ethically feasible substitute to non-human primates. The large brain size of the pig allows the use of conventional clinical brain imagers and the direct use and testing of neurosurgical procedures and equipment from the human clinic. Further macroscopic and histological analysis, however, requires postmortem exposure of the pig central nervous system (CNS) and subsequent brain removal. This is not an easy task, as the pig CNS is encapsulated by a thick, bony skull and spinal column. The goal of this paper and instructional video is to describe how to expose and remove the postmortem pig brain and the pituitary gland in an intact state, suitable for subsequent macroscopic and histological analysis.

The goal of this paper and instructional video is to describe how to expose and remove the postmortem pig brain and pituitary gland in an intact state, suitable for subsequent macroscopic and histological analysis.