Il PDK è supportato da un sistema operativo CIHR sovvenzione (MOP 86523)

1. Tecnica chirurgica <ol><li> Gli esperimenti deve essere effettuata usando tecniche asettiche e seguendo i protocolli di uso di animali della vostra istituzione specifica. Strumenti e materiali (soluzioni, sostanze in esame, traccianti, aghi, ecc), entrando in contatto con tessuti vivi, devono essere sterili per prevenire l&#39;infezione e impatti negativi sul benessere degli animali e il potenziale impatto negativo sullo studio. </li></ol> 2. Anestesia <ol><li> I ratti saranno anestetizzati con un sistema veterinario vaporizzatore isoflurano. Usare l&#39;ossigeno per uso medico a una velocità di 0,8 L / min per vaporizzare il gas isoflurano. Posto l&#39;animale nella casella di anestesia attaccato e comporre in una concentrazione di isoflurano del 4% fino a quando il respiro si è rallentato e l&#39;animale è calmo. </li><li> Quindi, interruttore il flusso di gas per l&#39;attaccamento maschera antigas per il telaio stereotassico e posto l&#39;animale in dell&#39;apparato stereotassico. Girare la concentrazione di isofluorano al 2% e monitorare l&#39;anestesia. Animali più grandi (&gt; 300g) può richiedere una maggiore concentrazione di isoflurano. L&#39;anestesia deve essere monitorata durante l&#39;intervento chirurgico e il dosaggio isoflurano aggiustato di conseguenza. La profondità e la velocità di respirazione deve essere costantemente valutata e un pizzico di valutazione tep (ogni 5 minuti) per l&#39;assenza di dolore profondo deve essere eseguito. </li><li> Una volta che l&#39;operazione è completata, spegnere l&#39;isoflurano e permettere all&#39;animale di respirare ossigeno per alcuni minuti prima della rimozione dal dispositivo stereotassico. La temperatura corporea deve essere mantenuta coprendo l&#39;animale con una coperta chirurgico e / o utilizzando una coperta riscaldamento regolabile durante l&#39;intervento. </li></ol> 3. Preparazione siringa per iniezioni intraoculari <ol><li> Per prima cosa, montare il sistema siringa per effettuare le iniezioni intraoculari. A 10 L RN 1701 a tenuta di gas siringa Hamilton è utilizzato per l&#39;iniezione. Rimuovere eventuali ago o RN presenti dado alla fine della siringa. </li><li> Inserire il puntale PFA nella coppa PEEK ghiera del raccordo. Quindi inserire il raccordo completo nella parte finale della siringa e vagamente avvitare il dado RN sopra la parte superiore. </li><li> Inserire un&#39;estremità del tubo in PEEK 1 / 16 pollice nel raccordo di compressione, attraverso l&#39;apertura nel dado RN. Assicurarsi che il tubo PEEK è completamente inserito. Serrare il dado RN di comprimere il puntale, sigillando il tubo PEEK. </li><li> Eseguire il passaggio 3.2 a entrambe le estremità del doppio attacco bicchiere RN. Collegare l&#39;estremità libera del tubo PEEK a un&#39;estremità del doppio attacco bicchiere RN serrando il dado RN. </li><li> Una micropipetta di vetro tirato formeranno l&#39;ago e botte per il sistema di iniezione. Usare 1,5 mm di diametro tubi di spessore di pareti di vetro capillare per fabbricare le pipette di vetro, e inserire la pipetta di vetro nella estremità libera del doppio attacco bicchiere RN. Serrare il dado RN per fissare la pipetta in posizione. </li><li> La punta fine di micropipette di vetro tirato è solitamente troppo piccolo per l&#39;esecuzione di iniezioni intraoculari. Al fine di creare una punta di diametro opportuno, rompere la punta della pipetta di vetro sotto la guida visiva, utilizzando un microscopio operatorio. La fine smerigliata di un vetrino di vetro si adatta bene a rompere la pipetta. Tenere la pipetta in un angolo e strofinare la punta lungo la glassa di vetro per creare una pausa. Idealmente, la punta finale dovrebbe essere leggermente smussati. Potrebbero essere necessari alcuni tentativi per produrre un buon consiglio, in modo da tirare pipette multiple prima dell&#39;uso. </li><li> Il sistema di iniezione è di tipo idraulico. Pertanto, la siringa, tubi linker PEEK, Dual RN accoppiatore vetro e la micropipetta di vetro devono essere riempiti con olio minerale prima dell&#39;uso. Utilizzando il kit di adescamento da Hamilton siringa Co. (PRMKIT), riempire la siringa di attivazione con olio minerale. Utilizzare un ago di grande diametro per consentire il passaggio facile del petrolio viscoso. Sostituire l&#39;ago con l&#39;ago 90030 Hamilton che si inserisce all&#39;interno del cilindro della siringa 10 L Hamilton. Quindi, posto un setto di gomma sopra l&#39;ago 90030 Hamilton, al fine di fornire un sigillo durante l&#39;iniezione dell&#39;olio minerale. </li><li> Inserire l&#39;ago 90030 Hamilton della siringa di attivazione nella parte posteriore del cilindro della siringa Hamilton 10 L del sistema di iniezione. Premere il setto strettamente contro l&#39;estremità della siringa per creare un sigillo. </li><li> Premere lentamente lo stantuffo. Si vedrà il passaggio di olio minerale attraverso gli elementi di vetro del sistema di iniezione e, infine, riempiendo la pipetta di vetro. Spingere tutto il petrolio attraverso il sistema di iniezione in modo da eliminare eventuali bolle d&#39;aria lungo il tratto. Se la siringa è a corto di olio minerale, estrarre lentamente l&#39;ago mentre costantemente l&#39;erogazione dell&#39;olio per evitare la formazione di bolle d&#39;aria. Riempire la siringa di attivazione e iniettare di nuovo. </li><li> Quando l&#39;intero sistema è riempito con olio minerale e bolle libero, inserire il pistone originale della siringa 10 L Hamilton. Spingere il pistone fino alla fine del suo viaggio al fine di rimuovere l&#39;olio minerale aggiuntivi dal sistema. Pulire il vetro micropipetta pulito e la fine della siringa pulita con etanolo al 70%. </li><li> Prelievi dagliw lo stantuffo della siringa per la soglia del 2 microlitri sulla canna. La fine della micropipetta di vetro si riempirà con l&#39;aria che fornisce una zona cuscinetto tra l&#39;olio minerale e il liquido desiderato da iniettare. La canna pipetta può essere riempito da collocare alla fine della micropipetta nella soluzione desiderata e ritirare lo stantuffo della siringa Hamilton. Non iniettare più di 4-5 ml di soluzione in un occhio ratto adulto. </li></ol> 4. Iniezione intraoculare Procedura: Targeting la Retina Globalmente <ol><li> Con l&#39;animale anestetizzato e fissato nella cornice stereotassica (come descritto nella Sezione 2), l&#39;uso degli occhi Alcaine gocce per anestetizzare topica della cornea. Aprire le palpebre con le dita e mettere una goccia della soluzione di anestetico sulla superficie della cornea. </li><li> Iniezione richiede due persone: una per inserire la pipetta di vetro nella camera di vitreo e mantenere la posizione di pipetta, e un altro a deprimere lo stantuffo sulla siringa che offre la soluzione desiderata. </li><li> Sotto un microscopio chirurgico, afferrare il bicchiere micropipetta e Dual accoppiatore RN vetro con le dita. Stendere le palpebre con le dita della mano libera, formando una forma a &quot;V&quot; di fronte al sito di iniezione. Applicando una trazione alle palpebre, l&#39;occhio sarà elevata dalla orbita, esponendo la superficie posteriore dietro il limbus. Creando una forma a &quot;V&quot; con le dita di fronte al sito di iniezione, una culla è formata per l&#39;occhio che fornisce stabilità durante l&#39;iniezione. </li><li> Inserire delicatamente la punta della micropipetta di vetro attraverso la congiuntiva, in una zona priva di vasi sanguigni, e attraverso la sclera, in un angolo verso il basso. Dovreste sentire un piccolo &quot;pop&quot; quando la pipetta penetra la sclera. Inserimento della pipetta con un angolo leggermente verso il basso riduce la possibilità di colpire la lente quando si inserisce l&#39;ago. </li><li> La persona che detiene la siringa dovrebbe iniettare i 4 ml di soluzione premendo il pistone per il segno 2 microlitri sulla siringa. L&#39;iniezione dovrebbe durare circa 1-2 secondi in totale. Iniettando ad un ritmo molto lento&gt; 3 secondi riduce la diffusione iniziale della soluzione attraverso la camera vitrea. Sarete in grado di vedere la soluzione di lavaggio iniettato attraverso la camera vitrea sotto il microscopio, in modo da verificare il successo della procedura. </li><li> Tenere la micropipetta stabile per circa 5 secondi e poi ritirare, nella stessa direzione come l&#39;ago è stato inserito. La congiuntiva si lembo ripercorrere la piccola apertura, contribuendo a sigillare la puntura sclerale. </li><li> Coprire la superficie della cornea con pomata oftalmica occhio (Tears Naturale PM) al fine di prevenire l&#39;essiccazione della cornea durante il recupero, e rispedire l&#39;animale in una gabbia di recupero. </li><li> Post-chirurgica analgesici devono essere somministrati secondo le linee guida delle autorità animali vostre cure, e gli animali devono essere attentamente monitorati dopo l&#39;intervento chirurgico. </li></ol> 5. Selettivamente cellule gangliari della retina dal tronco nervo ottico <ol><li> L&#39;applicazione di traccianti, droghe, plasmidi, siRNA o vettori virali per moncone del nervo ottico, seguito assotomia, obiettivi direttamente le cellule gangliari della retina attraverso il trasporto retrogrado. Questo si ottiene primo che esegue una resezione del nervo ottico secondo il &quot;protocollo Optic Nerve transezione&quot; 22. </li><li> Ci sono due metodi principali per realizzare questa procedura: utilizzando Gelfoam, o iniezione diretta nel nervo ottico. </li><li> Il metodo è simile a Gelfoam retrograda tracciamento, tuttavia quando offrendo trattamenti sperimentali al nervo ottico è auspicabile pre-etichettare le cellule gangliari della retina, iniettando traccianti retrogradi nel collicolo superiore 1 settimana prima della assotomia. Questo è importante per il tracciamento delle cellule in quanto, in alcuni casi traccianti neuronali possono interferire con il trasporto retrogrado di sostanze sperimentali o viceversa. </li><li> Subito dopo il nervo ottico viene tagliato, un piccolo pezzo di Gelfoam imbevuto nella soluzione sperimentale è posto sopra il tronco sezionato nervo ottico. I contenuti orbitali sono poi tornati alla loro posizione precedente. Quando l&#39;occhio è tornato a una posizione neutrale, è necessario usare il forcipe per spingere il pezzo di Gelfoam giù nell&#39;orbita, assicurando che essa rimanga sopra l&#39;estremità del nervo ottico. </li><li> La tecnica di iniezione è più efficace per la consegna di sostanze che devono accedere al citoplasma dell&#39;assone per essere trasportati dal flusso retrogrado axoplasmic. Questo include siRNA e plasmidi, e in alcuni casi vettori virali. Una siringa 5-10 microlitri Hamilton è usata per iniettare la soluzione desiderata nel nervo ottico transected. </li><li> Afferrare il bordo del nervo ottico con sottile punta Dumont pinze. Inserire l&#39;estremità del l&#39;ago nel nervo ottico, in parallelo con il nervo, fino a quando la coppia conica non è più visibile. L&#39;ago inserito sarà racchiuso da tutti i lati dal nervo. Un ago con uno smusso breve è auspicabile. </li><li> Una volta che il needle viene inserito nel nervo, premere delicatamente i lati del nervo con le pinze punta fine e iniettare un quarto della soluzione durante la rotazione della siringa un quarto di giro in senso orario o antiorario. </li><li> Continua a ripetere Passo 5,7 fino a completare una rotazione completa del ago e iniettato l&#39;intero contenuto della siringa. Per ottenere i migliori risultati iniettare un totale di 10 ml di soluzione con una tenuta di gas siringa da 10 microlitri Hamilton. </li><li> Rimuovere la punta della siringa dal nervo. Lasciare l&#39;eccesso di liquido iniettato che ha reflusso dal nervo all&#39;interno dell&#39;orbita in quanto ciò forma un ulteriore fondo per l&#39;assorbimento da parte le estremità degli assoni. </li><li> Restituire il contenuto orbitale alla loro posizione originale, chiudere la ferita e permettere all&#39;animale di recuperare. </li><li> Post-chirurgica analgesici devono essere somministrati secondo le linee guida delle autorità animali vostre cure, e gli animali devono essere attentamente monitorati dopo l&#39;intervento chirurgico. </li></ol> 6. Rappresentante dei risultati: Iniezioni intraoculari obiettivo di tutte le cellule della retina a livello globale, e sono perfetti per le sostanze consegna RGCs feriti dall&#39;inizio cellule gangliari si trovano nello strato più interno neuronali della retina, adiacente alla camera vitrea. RGCs possono anche essere direttamente interessati dalle sostanze fornendo al moncone sezionato nervo ottico. RGCs Fluorogold retrogrado etichettati possono essere mirati con peptidi, farmaci, vettori, plasmidi, o siRNA dal tronco del nervo, come illustrato nella figura 1. Figura 1A-C dimostra la localizzazione di un peptide Cy3 etichettato nel somata di RGCs che sono stati pre-etichettati, iniettando Fluorogold nel collicolo superiore. Cy3 peptidi etichettati sono state iniettate nel nervo ottico, subito dopo assotomia, e la retina è stato ripreso in vita per evitare che i peptidi di lisciviazione del tessuto durante la fissazione. Figura 1D-F dimostra la localizzazione di Cy3 siRNA etichettati e il tracciante retrogrado Fluorogold in RGCs axotomized. Cy3 siRNA etichettati sono stati iniettati nel tronco del nervo ottico subito dopo assotomia, e la retina è stato ripreso in vita. <img src="/files/ftp_upload/2261/2261fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Micrografie epifluorescenza di RGCs in retine flatmounted a 1 giorno dopo assotomia e l&#39;iniezione di due peptidi etichettati o siRNA nel tronco del nervo ottico. (A) Fluorogold marcatura retrograda in RGCs axotomized a 1 giorno postaxotomy (B) Cy3 fluorescenza in seguito RGCs trasporto retrogrado di peptidi etichettati, 1 giorno dopo assotomia e l&#39;iniezione del peptide nel nervo ottico. (C) Sovrapposizione di (A) e (B) dimostrare la localizzazione selettiva di peptidi Cy3 etichettate in RGCs Fluorogold etichettati. (DF) I corpi cellulari dei Fluorogold RGCs etichettati (D) sono pieni di Cy3 siRNA etichettati (E) iniettato nel tronco del nervo ottico 24 ore prima, come mostrato nella sovrapposizione (F). Barra di scala in CA è di 50 micron. Barra di scala nel DF è di 20 micron.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Resezione del nervo ottico è un modello estremamente riproducibile di adulti apoptosi neuronale del SNC. Le manipolazioni sperimentali hanno dimostrato in questo manoscritto permesso lo studio dei meccanismi di apoptosi RGC dopo l&#39;infortunio. Iniezioni intraoculari sono utili per indirizzare globale della retina. Questa procedura richiede una certa pratica, in quanto è fondamentale per non ferire l&#39;obiettivo con la punta della pipetta di vetro. Danno al cristallino ha dimostrato di...

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Erratum: Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Stereotaxic Frame</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stoelting, Kopf, WPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rat Gas Mask</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stoelting, Kopf, WPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anesthesia System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VetEquip</td>
<td>901806</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isoflurane (PrAErrane)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baxter Corp</td>
<td>DIN 02225875</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Surgical Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI, Zeiss, Leica</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Alcaine Eye Drops</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Alcon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tears Naturale P.M.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Alcon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fine tip Dumont forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11252-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 &mu;l Hamilton Syringe (1701RN; 26s/2&#x201D;/2)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton Syringe Co.</td>
<td>80030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1/16 inch Compression Fittings</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton Syringe Co.</td>
<td>55751-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1/16 inch OD, 0.010 inch ID, PEEK Tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Supelco, Bellefonte, PA</td>
<td>Z226661</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dual RN Glass Coupler</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton Syringe Co.</td>
<td>55752-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mineral Oil Priming Kit: includes syringe, needles, rubber septa</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton Syringe Co.</td>
<td>PRMKIT</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
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methods for experimental manipulations after optic nerve transection in the mammalian cns

Cellule gangliari della retina (RGCs) sono i neuroni del SNC che in uscita le informazioni visive dalla retina al cervello attraverso il nervo ottico. Il nervo ottico si può accedere nell&#39;orbita dell&#39;occhio e completamente sezionato (axotomized), tagliando gli assoni di tutta la popolazione RGC. Resezione del nervo ottico è un modello riproducibile di apoptosi morte delle cellule neuronali del sistema nervoso centrale adulto 1-4. Questo modello è particolarmente interessante perché la camera vitreo dell&#39;occhio agisce come una capsula per la somministrazione di farmaci alla retina, permettendo manipolazioni sperimentali attraverso iniezioni intraoculari. La diffusione di sostanze chimiche attraverso il fluido vitreo assicura che agiscono su tutta la popolazione RGC. Vettori virali, plasmidi o breve RNA interferenti (siRNA) può anche essere consegnata alla camera vitrea allo scopo di infettare o trasfezione delle cellule della retina 5-12. Il tropismo alto virus adeno-associato (AAV) vettori è vantaggioso per RGCs bersaglio, con un tasso di infezione si avvicina al 90% delle cellule in prossimità del sito di iniezione 6, 7, 13-15. Inoltre, RGCs possono essere selettivamente trasfettate mediante l&#39;applicazione di siRNA, plasmidi o vettori virali per la fine taglio del nervo ottico 16-19 o vettori iniettando nelle loro obiettivo il collicolo superiore 10. Questo permette ai ricercatori di studiare i meccanismi apoptotici nella popolazione neuronale feriti senza effetti confondenti sui neuroni spettatore o glia circostante. RGC apoptosi è una caratteristica tempo-corso in cui viene ritardata la morte delle cellule postaxotomy 3-4 giorni, dopo di che le cellule degenerano rapidamente. Ciò fornisce una finestra per manipolazioni sperimentali diretti contro meccanismi coinvolti nella apoptosi. Manipolazioni che riguardano direttamente il RGCs dal tronco sezionato nervo ottico vengono eseguiti al momento della assotomia, subito dopo il taglio del nervo. Al contrario, quando le sostanze vengono consegnati attraverso un percorso intraoculare, che può essere iniettata prima dell&#39;intervento o entro i primi 3 giorni dopo l&#39;intervento, che precede l&#39;avvio di apoptosi nelle RGCs axotomized. Nel presente articolo, dimostriamo diversi metodi per manipolazioni sperimentali dopo resezione del nervo ottico.

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Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

Resezione del nervo ottico è un modello ampiamente utilizzato degli adulti lesioni del SNC. Questo modello è ideale per eseguire una serie di manipolazioni sperimentali che colpiscono la retina globalmente o direttamente alla popolazione bersaglio feriti neuronale delle cellule gangliari retiniche.

Metodi per manipolazioni sperimentali dopo resezione del nervo ottico nel sistema nervoso centrale dei mammiferi

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.3K Views.  University of Toronto. Resezione del nervo ottico è un modello ampiamente utilizzato degli adulti lesioni del SNC. Questo modello è ideale per eseguire una serie di manipolazioni sperimentali che colpiscono la retina globalmente o direttamente alla popolazione bersaglio feriti neuronale delle cellule gangliari retiniche.

Video: Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve 
transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous
 chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals 
through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying short interfering RNAs 
(siRNAs), plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 5-7 or injecting vectors into their target, the superior colliculus 8. 
This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the desired neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. 
An additional benefit is the ease and accuracy with which cell survival can be quantified after injury. The retina is a flat, layered tissue and RGCs are localized in 
the innermost layer, the ganglion cell layer. The survival of RGCs can be tracked over time by applying a fluorescent tracer (3% Fluorogold) to the cut end of the 
optic nerve at the time of axotomy, or by injecting the tracer into the superior colliculus (RGC target) one week prior to axotomy. The tracer is retrogradely transported, labeling 
the entire RGC population. Because the ganglion cell layer is a monolayer (one cell thick), RGC densities can be quantified in flat-mounted tissue, without the need 
for stereology. Optic nerve transection leads to the apoptotic death of 90% of injured RGCs within 14 days postaxotomy 9-11. RGC apoptosis has a 
characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a time window for 
experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. Ninety percent of retinal ganglion cells (RGCs) whose axons are completely transected (axotomy) die within 14 days after axotomy. This model is easily amenable to experimental manipulations and highly reproducible.

Resezione del nervo ottico: un modello di apoptosi Neuron adulti nel Sistema Nervoso Centrale

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

Ricerca

Neuroscienze

An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible vision loss. Examples of such diseases in human include traumatic optic neuropathy and optic nerve degeneration in glaucoma. It is characterized by typical changes in the optic nerve head, progressive optic nerve degeneration, and loss of retinal ganglion cells, if uncontrolled, leading to vision loss and blindness.
The optic nerve crush (ONC) injury mouse model is an important experimental disease model for traumatic optic neuropathy, glaucoma, etc. In this model, the crush injury to the optic nerve leads to gradual retinal ganglion cells apoptosis. This disease model can be used to study the general processes and mechanisms of neuronal death and survival, which is essential for the development of therapeutic measures. In addition, pharmacological and molecular approaches can be used in this model to identify and test potential therapeutic reagents to treat different types of optic neuropathy.
Here, we provide a step by step demonstration of (I) Baseline retrograde labeling of retinal ganglion cells (RGCs) at day 1, (II) Optic nerve crush injury at day 4, (III) Harvest the retinae and analyze RGC survival at day 11, and (IV) Representative result.

This protocol shows how to retrogradely label retinal ganglion cells, and how to subsequently make an optic nerve crush injury in order to analyze retinal ganglion cell survival and apoptosis. It is an experimental disease model for different types of optic neuropathy, including glaucoma.

Una lesione del nervo ottico Modello Crush murini per studiare la sopravvivenza delle cellule gangliari della retina

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible ...

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory system is characterized by its ability to give rise to new neurons even in adult animals. This particular ability is partly due to the presence of OECs which create a favorable microenvironment for neurogenesis. This property of OECs has been used for cellular transplantation such as in spinal cord injury models. Although the peripheral nervous system has a greater capacity to regenerate after nerve injury than the central nervous system, complete sections induce misrouting during axonal regrowth in particular after facial of laryngeal nerve transection. Specifically, full sectioning of the recurrent laryngeal nerve (RLN) induces aberrant axonal regrowth resulting in synkinesis of the vocal cords. In this specific model, we showed that OECs transplantation efficiently increases axonal regrowth.
OECs are constituted of several subpopulations present in both the olfactory mucosa (OM-OECs) and the olfactory bulbs (OB-OECs). We present here a model of cellular transplantation based on the use of these different subpopulations of OECs in a RLN injury model. Using this paradigm, primary cultures of OB-OECs and OM-OECs were transplanted in Matrigel after section and anastomosis of the RLN. Two months after surgery, we evaluated transplanted animals by complementary analyses based on videolaryngoscopy, electromyography (EMG), and histological studies. First, videolaryngoscopy allowed us to evaluate laryngeal functions, in particular muscular cocontractions phenomena. Then, EMG analyses demonstrated richness and synchronization of muscular activities. Finally, histological studies based on toluidine blue staining allowed the quantification of the number and profile of myelinated fibers.
All together, we describe here how to isolate, culture, identify and transplant OECs from OM and OB after RLN section-anastomosis and how to evaluate and analyze the efficiency of these transplanted cells on axonal regrowth and laryngeal functions.

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth of the primary olfactory neurons. This specific property can be used for cellular transplantation. We present here a model of cellular transplantation based on the use of OECs in a laryngeal nerve injury model.

Il trapianto di cellule olfattive ensheathing per valutare il recupero funzionale dopo Peripheral Nerve Injury

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

The nervous system is often described as a hard-wired component of the body even though it is a considerably fluid organ system that reacts to external stimuli in a consistent, stereotyped manner, while maintaining incredible flexibility and plasticity. Unlike the central nervous system (CNS), the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair, but we have only just begun to understand the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using zebrafish as a model system, we have the unprecedented opportunity to couple regenerative studies with in vivo imaging and genetic manipulation. Peripheral nerves are composed of axons surrounded by layers of glia and connective tissue. Axons are ensheathed by myelinating or non-myelinating Schwann cells, which are in turn wrapped into a fascicle by a cellular sheath called the perineurium. Following an injury, adult peripheral nerves have the remarkable capacity to remove damaged axonal debris and re-innervate targets. To investigate the roles of all peripheral glia in PNS regeneration, we describe here an axon transection assay that uses a commercially available nitrogen-pumped dye laser to axotomize motor nerves in live transgenic zebrafish. We further describe the methods to couple these experiments to time-lapse imaging of injured and control nerves. This experimental paradigm can be used to not only assess the role that glia play in nerve regeneration, but can also be the platform for elucidating the molecular mechanisms that govern nervous system repair.

Although the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair after injury, little is known about the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using live, transgenic zebrafish and a reproducible nerve transection assay, we can study dynamic glial cell behaviors during nerve degeneration and regeneration.

Motor Nerve transezione e Time-lapse imaging di gliali comportamenti delle cellule in vivo Zebrafish

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Veloce micro-ionoforesi di glutammato e GABA: un utile strumento per indagare l&#39;integrazione Synaptic

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

The rodent visual system encompasses retinal ganglion cells and their axons that form the optic nerve to enter thalamic and midbrain centers, and postsynaptic projections to the visual cortex. Based on its distinct anatomical structure and convenient accessibility, it has become the favored structure for studies on neuronal survival, axonal regeneration, and synaptic plasticity. Recent advancements in MR imaging have enabled the in vivo visualization of the retino-tectal part of this projection using manganese mediated contrast enhancement (MEMRI). Here, we present a MEMRI protocol for illustration of the visual projection in mice, by which resolutions of (200 &#181;m)3 can be achieved using common 3 Tesla scanners. We demonstrate how intravitreal injection of a single dosage of 15 nmol MnCl2 leads to a saturated enhancement of the intact projection within 24 hr. With exception of the retina, changes in signal intensity are independent of coincided visual stimulation or physiological aging. We further apply this technique to longitudinally monitor axonal degeneration in response to acute optic nerve injury, a paradigm by which Mn2+ transport completely arrests at the lesion site. Conversely, active Mn2+ transport is quantitatively proportionate to the viability, number, and electrical activity of axon fibers. For such an analysis, we exemplify Mn2+ transport kinetics along the visual path in a transgenic mouse model (NF-&#954;B p50KO) displaying spontaneous atrophy of sensory, including visual, projections. In these mice, MEMRI indicates reduced but not delayed Mn2+ transport as compared to wild type mice, thus revealing signs of structural and/or functional impairments by NF-&#954;B mutations.
In summary, MEMRI conveniently bridges in vivo assays and post mortem histology for the characterization of nerve fiber integrity and activity. It is highly useful for longitudinal studies on axonal degeneration and regeneration, and investigations of mutant mice for genuine or inducible phenotypes.

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

This video illustrates a method, using a clinical 3 T scanner, for contrast-enhanced MR imaging of the na&#239;ve mouse visual projection and for repetitive and longitudinal in vivo studies of optic nerve degeneration associated with acute optic nerve crush injury and chronic optic nerve degeneration in knock-out mice (p50KO).

In vivo imaging di Optic Nerve Fiber Integrity by MRI Contrast-Enhanced nei topi

The rodent visual system encompasses retinal ganglion cells and their axons that form the optic nerve to enter thalamic and midbrain centers, and ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

Spinal Cord transezione nel larvale Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

Minimally-invasive Technique for Injection into Rat Optic Nerve

The rat optic nerve is a useful model for stem cell regeneration research. Direct injection into the rat optic nerve allows delivery into the central nervous system in a minimally-invasive surgery without bone removal. This technique describes an approach to visualization and direct injection of the optic nerve following minor fascial dissection from the orbital ridge, using a conjunctival traction suture to gently pull the eye down and out. Representative examples of an injected optic nerve show successful injection of dyed beads.

Direct injection into the rat optic nerve is useful for regenerative research. We demonstrate a minimally-invasive technique for direct injection into a rat optic nerve that does not involve opening the skull. Using this method, surgical complications are minimized and recovery is more rapid.

Tecnica mini-invasiva per iniezione in Rat nervo ottico

The rat optic nerve is a useful model for stem cell regeneration research. Direct injection into the rat optic nerve allows delivery into the central ...

Visual Evoked Potential Recording in a Rat Model of Experimental Optic Nerve Demyelination

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to monitor the disease course in the follow-up period. Changes in the VEP parameters closely correlate with pathological damage in the optic nerve. This protocol provides a detailed description about the rodent model of optic nerve microinjection, in which a partial demyelination lesion is produced in the optic nerve. VEP recording techniques are also discussed. Using skull implanted electrodes, we are able to acquire reproducible intra-session and between-session VEP traces. VEPs can be recorded on individual animals over a period of time to assess the functional changes in the optic nerve longitudinally. The optic nerve demyelination model, in conjunction with the VEP recording protocol, provides a tool to investigate the disease processes associated with demyelination and remyelination, and can potentially be employed to evaluate the effects of new remyelinating drugs or neuroprotective therapies.

Focal demyelination is induced in the optic nerve using lysolecithin microinjection. Visual evoked potentials are recorded via skull electrodes implanted over the visual cortex to examine the signal conduction along the visual pathway in vivo. This protocol details the surgical procedures underlying electrode implantation and optic nerve microinjection.

Registrazione potenziale evocato visivo in un modello murino di sperimentale del nervo ottico demielinizzazione

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to ...

Exposure of the Pig CNS for Histological Analysis: A Manual for Decapitation, Skull Opening, and Brain Removal

Pigs have become increasingly popular in large-animal translational neuroscience research as an economically and ethically feasible substitute to non-human primates. The large brain size of the pig allows the use of conventional clinical brain imagers and the direct use and testing of neurosurgical procedures and equipment from the human clinic. Further macroscopic and histological analysis, however, requires postmortem exposure of the pig central nervous system (CNS) and subsequent brain removal. This is not an easy task, as the pig CNS is encapsulated by a thick, bony skull and spinal column. The goal of this paper and instructional video is to describe how to expose and remove the postmortem pig brain and the pituitary gland in an intact state, suitable for subsequent macroscopic and histological analysis.

The goal of this paper and instructional video is to describe how to expose and remove the postmortem pig brain and pituitary gland in an intact state, suitable for subsequent macroscopic and histological analysis.