이 작품은 인간 프론티어 과학 프로그램기구 (HFSP 수상 2007 년 RGP0058/2007-C)에 의해 지원되었다. 우리는 프로젝트를 시작을위한 유익한 토론을위한 교수 리차드 로버츠 감사합니다.

<ol>
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I., Keller, A., Kolker, E., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+statistical+model+for+identifying+proteins+by+tandem+mass+spectrometry.">A statistical model for identifying proteins by tandem mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 75, 4646-4658 (2003).</li></ol>

ThomasLenz, OliviaGrabner, MirkoGlinski, MathiasDreger 및 HubertKosterare이 문서에서 사용되는 시약의 일부를 생산 caprotec bioanalytics GmbH의, Inc의 고용.

설명 프로토콜을 다음과 같은 경우 다음과 같은주의 사항 및 의견은 유용할 수 있습니다 :이 이후 엄격한 세척 조건을 허용하는 등 CCS의) 가장 큰 장점은 CC와 MTase 사이에 공유 결합의 형성에 자리잡고 있습니다. 공유 결합 crosslink는 자외선 (310 nm의 최대.)에 의해 실행 photoreaction에 의해 이루어진다. 일반 오버헤드 빛이 자외선의 작은 파편만이 포함되어 있습니다 단, caproBox의 제어와 냉각 조사까지 오버헤드에 더 이상 노출 또는 일 빛으로부터 SAH - CC를 보호합니다. B) MTases가 격리해야하는에서 생물 학적 샘플이 변성하는 경향이 단백질을 포함할 수 있습니다, 따라서 그것은 샘플이 시원한 유지하고 항상 얼굴이 볼만 피하기 위해 필수입니다. C) caproBox는 0-4로 샘플을 냉각 ° C, UV 빛을 발하는 램프가, 그러나 또한 열을 방출. 따라서 그것은 간략하게 조사하기 전에 튜브를 원심 필요하므로 대문자 또는 유리 벽면을 준수하는 단백질 침전의 씨앗을 형성 수 없습니다. 자석 구슬을 다시 중단이 (세척 솔루션의 예) 손으로 불가 능할 경우 D), 곧 초음파 욕조에 샘플을 배치하여 초음파를 적용합니다. E) 갓 0.2 % TFA/60 %의 ACN 솔루션을 준비합니다. 우리는 달리 캡처된 단백질이 구슬에서 죽습되지 않을 수 있습니다는 사실을 발견했습니다. F) 캡처 단백질의 최종 분석 LC-MS/MS에 의해 수행됩니다. 질량 분석법은 매우 민감한 방법입니다. 이것은 마지막 단계 (단계 더 나아가 2.11)에서 독점적으로 LC - MS 등급 시약을 사용해야합니다. 외부 단백질 소스, 먼지 또는 실험자에서 발생하는 등 각질에 의해 실험의 오염을 피하십시오. 특히 최종 소화 단계 동안, 그것은 장갑과 실험 복과 가능한 고정시켜 또는 이상 깨끗한 벤치에서 최종 단계를 수행하기 위해, 깨끗한 작업 공간에 대한 관심을 지불하는 것이 좋습니다. LC MS 학년 물에 tryptic 소화에 사용되는 50 MM의 탄산수 소 암모늄 버퍼, -20 ° C에서 0.22 μm의 필터, 나누어지는, 저장을 통해 필터를 준비하고, contaminations가 발생하지 않도록 한 번만 각 나누어지는을 사용합니다. 트립신 용액 (시퀀싱 학년, 로체, 동결 건조된 트립신 1 MM HCL을 추가하여 0.5 μg / μl 솔루션을 준비)를 4 ° C 몇 주 동안 저장할 수 있습니다. G) 신뢰할 수있는 질량 스펙트럼을 얻으려면 그것은 ESI-MS/MS 분석에서 안정 스프레이를하는 것이 필수적입니다. H) 현재 연구에 사용되는 이외의 LC-MS/MS 시스템의 경우, 측정 매개 변수와 펩티드 식별 알고리즘은 개별적으로 조정해야합니다. 다음 수정은 설명 프로토콜과 관련하여 가능합니다 :)이 또는 60% ACN/0.2 %의 TFA (단계 2.11)에 의해 비즈에서 단백질을 발표하기 위해 단백질 직접 tryptically 구슬 중지 (이내 소화 수있는 동일한 볼륨으로 단계 5.1)이나, SDS - PAGE에 대해, 단백질은 95 단계로 2.9 이후 수집한 비즈를 보류하고 가열에 의해 발표 수 있습니다 ° C SDS 샘플 버퍼에 10 분 (모두 전체 정지 또는 유일한 뜨는 로드할 수에 대한 겔 주머니에). 우리는 비즈 천천히에도 여러 수성 세척 단계 후 온 - 비드 tryptic 소화하는 동안 수성 tryptic 다이제스트 솔루션에 폴리머 소량의 릴리스는 사실을 발견했습니다. 폴리머 오염 MS 펩티드 식별을 방해하고 80 % ACN을 (적어도 세 번)를 사용하여 비즈 씻어 수 있습니다. 80 % ACN 세척 단계 후, 비즈 전에 온 - 비드 tryptic 소화 물에 한번 세탁해야합니다. B) streptavidin - horseraddish 퍼옥시데이즈 및 ECL 기판을 사용하여 서양 blots 또한 단백질에 비오틴이 포함된 CC의 성공 crosslinking을 시각화하는 데 사용할 수 있습니다. 감도가 젤의 은색 얼룩보다 약 10 배 이상이기 때문에 따라서, 단계 3.2 이후 얻은 젤이, blotted 또는 수 있습니다 중, 10 μl 샘플 단계 2.7 이후에도 서양 얼룩으로 분석 수 있습니다. 후자의 경우에는 endogeneously biotinylated 단백질도 인위적으로 SAH - CC로 biotinylated 단백질 이외에 감지됩니다 잊었습니다. C) 우리는, 특별한 시스템 (lysate, 대상 단백질, 선택성 그리고 CC의 반응 기능을 주소)에 따라 사실을 발견 여부 crosslinking 반응은 무료 CC 및 솔루션 4 단백질 사이에 일어난 일입니다 &quot;오프 구슬&quot;구성, 또는 현재 설명 &quot;에 - 구슬 &#39;구성 (그림 1B)은 더 나은 수행합니다. 일반적으로 메서드는 또한와 호환되어야하는 국가 수준의 예술 안정 동위 원소 단백질이나 펩타이드의 라벨 기술, 또는 2D 겔 전기 영동에 의해 캡처 샘플 평가. &quot;오프 구슬&quot;구성에서 전체 셀 (게시되지 않은 결과) 내에 단백질을 포착하는 것도 가능합니다. 또한, 약물이나 단백질의 cofactor 구속력이 사이트는 MS 펩타이드 배열에 의해 단백질 시퀀스 내에서 CC의 가까이별로 crosslinking 위치를 결정하여 설명하실 수 있습니다. 단백질을 작은 분자의 바인딩 모드는 다른 사용자를 사용하여 탐험 수 있습니다택 기능과 다양한 링커 길이에 hemical 첨부 파일 위치. 으로 현재 연구에 나타난 단백질 또한 단백질 바인딩 파트너는 선택도 기능 (PrmA의 기판으로 RplK) 또는 알려지지 않은 작은 분자의 단백질 상호 작용 (GlnA에 SAH) 확인할 수 있습니다하여 해결. 요약, CCS, 사진 crosslinking의 반응의 추가 기능, 고감도와 복잡한 단백질 혼합물에서 낮은 풍부한 단백질이나 기능성 단백질 가족의 격리 및 식별 가능하며 작은 분자를 연구를위한 추가 도구를 사용하여 과학자를 제공 - 단백질 상호 작용 .

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		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
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		<tbody>
		
<tr>
<td>SAH caproKit&trade;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>caprotec bioanalytics GmbH</td>
<td>1-1010-050 (50 reactions) 1-1010-010 (10 reactions)</td>
<td>Includes the SAH-CC, SAH competitor, streptavidin coated magnetic beads, capture buffer, and wash buffer</td>
</tr>
<tr>
<td>caproBox&trade;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>caprotec bioanalytics GmbH</td>
<td>1-5010-003 (110 V) 1-5010-004 (230 V)</td>
<td>For reproducible photo-activation while cooling the samples</td>
</tr>
<tr>
<td>caproMag&trade;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>caprotec bioanalytics GmbH</td>
<td>1-5100-001</td>
<td>For easy handling of magnetic particles without pipetting</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

profiling of methyltransferases and other s-adenosyl-l-homocysteine-binding proteins by capture compound mass spectrometry (ccms)

이러한 친화도 크로마 토그래피 1 또는 활동 기반 단백질 프로파일이 같은 기능을 작은 분자 - 단백질 상호 작용에 기초하여 프로테옴의 복잡도를 줄이기 위해 접근의 다양한 방법이 있습니다. Trifunctional 캡처 화합물 (CCS, 그림 1A) 3은 일반적인 접근 방식을 바탕으로하는 최초의 평형 중심의 작은 분자 프로브 (여기 선택성 기능, S - adenosyl - L - 호모 시스테인, SAH, 그림 1A) 사이의 상호 작용 및 대상 단백질은 irreversibly CC의 독립적인 사진 activable 반응 기능 (여기 phenylazide)와 대상 단백질의 표면 사이에 사진 crosslinking에 고정됩니다. 고체 상 (여기서 streptavidin 자성 구슬)의 도움으로 복잡한 생물학 혼합물에서 단백질 conjugates - 정렬 기능 (여기 비오틴)는 CC를 분리하는 역할을합니다. 실험의 두 가지 구성이 가능합니다 : &quot;오프 구슬&quot;4 또는 현재 설명 &quot;에 - 구슬 &#39;구성 (그림 1B). 택 기능은 관심의 거의 모든 작은 분자 (기판, 억제제, 약물 분자) 수 있습니다. (SAM, 그림 1A) S - Adenosyl - L - 메티오닌은 아마도 ATP, 자연 5, 6에 가장 널리 사용 cofactor의 두번째입니다. 이것은 화학 반응은 DNA 7, RNA 8, 단백질 9, 또는 작은 분자 10 methylate SAM - 종속 methyltransferases (MTases)에 의해 촉매되는 모든 살아있는 유기체의 주요 메틸 그룹 기증자로 사용됩니다. 다양한 생리 시나리오에서 methylation 반응의 중요한 역할 (유전자 조절, epigenetics, 신진 대사)을 감안할 때, MTases의 프로파일 링은 kinases의 프로 파일링 기능으로 proteomics의 유사한 중요성 될 것으로 기대하실 수 있습니다. 자신의 프로파일에 대한 분석 도구는 그러나, 사용할 수 없습니다. 우리는 최근이 기술 격차 (그림 1A)을 채우기 위해 선택성 그룹으로 SAH과 CC를 소개했다. SAH, 메틸이 완료된 후 SAM의 제품은 알려진 일반 MTase 제품 억제제 11. 이런 이유 때문에 자연 cofactor SAM은 그 화학적 불안정성 12 때문에 SAH가 MTases을 타겟으로 CC를위한 이상적인 선택도 기능입니다 cofactor의 다른 부분을 전송하거나 극단적인 반응뿐만 아니라를 시작 더 효소에 의해 사용됩니다. 여기, 우리는 기본 모델로 하였다 대장균 (E. 대장균), 가장 특징 prokaryotes 중 하나의 변형 DH5α에서 프로 파일링 MTases 및 기타 SAH 결합 단백질에 의해 SAH - CC 및 CCMS의 유틸리티를보고 수많은, 생화학 생물 학적 및 biotechnological 연구 유기체. 사진 활성 crosslinking는 실험의 수율과 감도를 강화하고, 특이성이 쉽게 무료로 SAH을 초과 사용하여 경쟁 실험에 대해 테스트할 수 있습니다.

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Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

캡처 화합물 사진 crosslinking 및 정화하여 다음 기능을 가역 작은 분자 - 단백질 상호 작용에 의한 프로테옴의 복잡도를 줄이기 위해 trifunctional 작은 분자 수 있습니다. 여기있는 캡처 컴파 운드를 사용하여<em&gt; S</em&gt; - adenosyl -<sub&gt; L</sub에서 methyltransferases를 분리 선택도의 함수로&gt; - 호모 시스테인 바인딩<em&gt; 대장균</em&gt; 전체 세포는 lysate와 MS에 의해 그들을 식별합니다.

Methyltransferases의 프로 파일링 및 기타 S - adenosyl - L</sub캡처 컴파 운드 질량 분광법 (CCMS)에서> - 호모 시스테인 결합 단백질

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

profiling-methyltransferases-other-s-adenosyl-l-homocysteine-binding

Research

JoVE Journal

Biology

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

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Methyltransferases의 프로 파일링 및 기타 S - adenosyl - L - 호모 시스테인 결합 단백질

Methyltransferases의 프로 파일링 및 기타 S - adenosyl -_{L - 호모 시스테인 결합 단백질}