Bu çalışma, İnsan Frontier Lisans Programı Örgütü (HFSP Ödülü 2007, RGP0058/2007-C) tarafından desteklenmiştir. Biz proje başlatmak için Prof. Richard Roberts ve verimli tartışmalar için teşekkür ederim.

<ol>
	<li>Katayama, H., Oda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+proteomics+for+drug+discovery+based+on+compound-immobilized+affinity+chromatography.">Chemical proteomics for drug discovery based on compound-immobilized affinity chromatography.</a> J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 855, 21-27 (2007).</li><li>Barglow, K. T., Cravatt, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-based+protein+profiling+for+the+functional+annotation+of+enzymes.">Activity-based protein profiling for the functional annotation of enzymes.</a> Nat. Methods. 4, 822-827 (2007).</li><li>Koster, H., Little, D. P., Luan, P., Muller, R., Siddiqi, S. M., Marappan, S., Yip, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capture+compound+mass+spectrometry:+a+technology+for+the+investigation+of+small+molecule+protein+interactions.">Capture compound mass spectrometry: a technology for the investigation of small molecule protein interactions.</a> Assay Drug Dev. Technol. 5, 381-390 (2007).</li><li>Dalhoff, C., Hueben, M., Lenz, T., Poot, P., Nordhoff, E., Koster, H., Weinhold, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+S-Adenosyl-L-homocysteine+Capture+Compounds+for+Selective+Photoinduced+Isolation+of+Methyltransferases.">Synthesis of S-Adenosyl-L-homocysteine Capture Compounds for Selective Photoinduced Isolation of Methyltransferases.</a> ChemBioChem. 11, 256-265 (2010).</li><li>Lu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-Adenosylmethionine.">S-Adenosylmethionine.</a> Int. J. Biochem. Cell. Biol. 32, 391-3952 (2000).</li><li>Cantoni, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+methylation:+selected+aspects.">Biological methylation: selected aspects.</a> Annu. Rev. Biochem. 44, 435-451 (1975).</li><li>Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+Watson+and+Crick:+DNA+methylation+and+molecular+enzymology+of+DNA+methyltransferases.">Beyond Watson and Crick: DNA methylation and molecular enzymology of DNA methyltransferases.</a> ChemBioChem. 3, 274-293 (2002).</li><li>Chow, C. S., Lamichhane, T. N., Mahto, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+nucleotide+repertoire+of+the+ribosome+with+post-transcriptional+modifications.">Expanding the nucleotide repertoire of the ribosome with post-transcriptional modifications.</a> ACS Chem. Biol. 2, 610-619 (2007).</li><li>Grillo, M. A., Colombatto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-Adenosylmethionine+and+protein+methylation.">S-Adenosylmethionine and protein methylation.</a> Amino Acids. 28, 357-362 (2005).</li><li>Fujioka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+small+molecule+methyltransferases:+their+structural+and+functional+features.">Mammalian small molecule methyltransferases: their structural and functional features.</a> Int. J. Biochem. 24, 1917-1924 (1992).</li><li>Borchardt, R. T., Salvatore, F., Borek, E., Zappia, V., Williams-Ashman, H. G., Schlenk, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Biochemistry of S-Adenosylmethionine. , 151-171 (1977).</li><li>Hoffman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatographic+analysis+of+the+chiral+and+covalent+instability+of+S-adenosyl-l-methionine.">Chromatographic analysis of the chiral and covalent instability of S-adenosyl-l-methionine.</a> Biochemistry. 25, 4444-4449 (1986).</li><li>Keller, A., Nesvizhskii, A. I., Kolker, E., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Empirical+statistical+model+to+estimate+the+accuracy+of+peptide+identifications+made+by+MS/MS+and+database+search.">Empirical statistical model to estimate the accuracy of peptide identifications made by MS/MS and database search.</a> Anal. Chem. 74, 5383-5392 (2002).</li><li>Nesvizhskii, A. I., Keller, A., Kolker, E., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+statistical+model+for+identifying+proteins+by+tandem+mass+spectrometry.">A statistical model for identifying proteins by tandem mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 75, 4646-4658 (2003).</li></ol>

Bu makalede kullanılan bazı reaktifler üretir caprotec bioanalytics GmbH, Inc tarafından istihdam ThomasLenz, OliviaGrabner, MirkoGlinski, MathiasDreger ve HubertKosterare.

Açıklanan protokol takip ederken aşağıdaki önlemleri ve yorumlar yararlı olabilir: a) Aday, en büyük avantajı, bu daha sonraki sıkı yıkama koşulları izin verdiği, CC ve MTase arasında bir kovalent bağ oluşumu yatıyor. Kovalent çapraz UV ışık (310 nm max.) Tarafından tetiklenen bir photoreaction elde edilir. Normal havai UV ışık yalnızca küçük bir bölümünü içerir, ancak kontrollü ve soğutmalı ışınlama caproBox kadar yükü uzun süre maruz kalmanın, hatta güneş ışığı ŞAH-CC korumak. b) MTases izole edilmesi için biyolojik örnekler denatürasyon eğilimli protein içerebilir, dolayısıyla bu örnekleri serin tutmak ve her zaman Köpüklenmemesine önlemek için zorunludur. c) caproBox 0-4 örnekleri soğutur ° C, UV ışık yayan lambalar, ancak, aynı zamanda ısı yayarlar. Bu nedenle, kısa bir süre ışınlama önce şişeleri santrifüj gerekli, bu nedenle büyük harf veya flakon duvarlara yapışmış proteinler yağış tohum oluşturamazlar. d) manyetik boncuk yeniden süspansiyon (yıkama çözümler), el ile mümkün değilse, kısa bir süre numunelerin ultrason banyosu içine koyarak ultrason geçerlidir. e) Taze% 0.2 TFA/60% ACN çözüm hazırlamak. Biz aksi yakalanan proteinler boncuklar bölünmüş olmayabilir bulundu. f) Yakalanan proteinlerin son tahlilde LC-MS/MS tarafından yürütülmektedir. Kütle spektrometresi, son derece hassas bir yöntemdir. Bu son adımları (adım 2.11 ve daha fazla) sadece LC-MS sınıf reaktifler kullanmak için gereklidir. Dış protein kaynakları, toz veya deneyci kaynaklanan örneğin keratin deneyler kirletil. Özellikle son sindirim adımları sırasında, eldiven ve bir laboratuvar önlüğü ve büyük olasılıkla bir saç net giymek ya da ideal temiz bir tezgah altında son adımları gerçekleştirmek için, temiz bir çalışma alanı dikkat etmek tavsiye edilir. LC MS sınıf su triptik sindirmek için kullanılan 50 mM amonyum bikarbonat tampon, -20 ° C&#39;de 0.22 mikron filtre, kısım, mağaza süzülmeye hazırlayın ve her bir kısım Bulaşmayı önlemek için sadece bir kez kullanabilirsiniz. Tripsin çözüm (sıralama notu, Roche, 1 mM HCl liyofilize tripsin ekleyerek 0,5 mg / ml çözüm hazırlamak) 4 ° C&#39;de birkaç hafta saklanabilir. g) güvenilir kitle spektrumu elde etmek için ESI-MS/MS analiz istikrarlı bir sprey olması esastır. h), bu çalışmada kullanılan bir başka LC-MS/MS sistemler için, ölçüm parametreleri ve peptid tanıma algoritmaları ayrı ayrı ayarlanabilir olmalıdır. Açıklanan protokole göre aşağıdaki değişiklikler mümkündür: a)% 60 ACN/0.2% TFA (adım 2.11) Alternatif boncuklar proteinlerin bırakmadan, proteinler doğrudan tryptically bir boncuk süspansiyon (içinde sindirilir olabilir aynı birimler olarak adım 5.1) ya da SDS-PAGE, proteinler, 95 adım 2.9 sonra toplanan boncuk askıya ısıtma ve piyasaya olabilir ° C SDS numune tamponu 10 dakika (her ikisi de, bütün askıya alınması veya sadece süpernatantı yüklenebilir jel cebine). Biz boncuklar, boncuk triptik sindirimi sırasında yavaş yavaş, hatta birkaç sulu yıkama adımdan sonra sulu triptik özet çözüm içine küçük miktarlarda polimer yayımı bulundu. MS peptid kimlik polimer kontaminasyonu engelleyen ve% 80 ACN (en az üç kez) kullanarak boncuk kapalı yıkanabilir. % 80 ACN yıkama adımından sonra, boncuk boncuk triptik sindirmek için önce bir kez su ile yıkanmış olmalıdır. b) streptavidin horseraddish peroksidaz ve ECL substrat kullanılarak Western blot proteinler biotin içeren CC başarılı crosslinking görselleştirmek için kullanılabilir. Hassasiyet jellerin gümüş boyama daha yaklaşık 10 kat daha yüksek, çünkü Bu nedenle, bir adım 3.2 sonra elde edilen jel, lekelenen veya olabilir ya, 10 ul örnekleri adım, 2.7 sonra da western blot ile analiz edilebilir. Ikinci durumda endogeneously biotinlenmiş proteinler da yapay ŞAH-BİDB tarafından biotinlenmiş proteinlerin yanı sıra tespit olacaktır akılda. c) Biz, özel bir sistem (lizat, hedef proteinler, seçicilik ve o CC reaktivitesi fonksiyonu hitaben) bağlıdır bulundu olmadığını crosslinking reaksiyon ücretsiz CC ve solüsyon 4 protein arasında yer alan &quot;off-boncuk&quot; yapılandırma ya da şu anda açıklanan &quot;on-boncuk&quot; yapılandırma (Şekil 1B) iyi yapar. Genel olarak, bu yöntem de uyumlu olmalıdır herhangi bir state-of-sanat stabil izotop protein ya da peptid etiketleme teknolojisi, veya 2D jel elektroforezi yakalama örnek değerlendirme. &quot;Off-boncuk&quot; yapılandırma, tüm hücreleri (yayınlanmamış) içinde protein yakalamak da mümkün. Ayrıca, ilaç veya bir protein kofaktör bağlayıcı site MS peptid sıralama protein dizisi içinde CC yakın-by crosslinking konumunu belirleyerek değerlendirilebilir. Küçük bir molekül bir protein bağlayıcı modu farklı c kullanılarak araştırılmalıdır.seçicilik fonksiyonu ve farklı linker uzunlukları hemical eklenti pozisyonları. Bu çalışmada gösterildiği gibi, proteinler ayrıca protein bağlama ortakları tarafından ele seçicilik fonksiyonu (PrmA, substrat olarak RplK) veya bilinmeyen küçük molekül protein etkileşimleri (GlnA için SAK) tespit edilebilir. Aday, fotoğraf crosslinking reaktivite ek özellik özetle, yüksek hassasiyet ile kompleks protein karışımları düşük bol protein ya da işlevsel protein aileleri izolasyonu ve tanımlanması için izin verir ve küçük molekül eğitimi için ek bir araç ile bilim adamları sağlar protein etkileşimleri .

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>SAH caproKit&trade;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>caprotec bioanalytics GmbH</td>
<td>1-1010-050 (50 reactions) 1-1010-010 (10 reactions)</td>
<td>Includes the SAH-CC, SAH competitor, streptavidin coated magnetic beads, capture buffer, and wash buffer</td>
</tr>
<tr>
<td>caproBox&trade;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>caprotec bioanalytics GmbH</td>
<td>1-5010-003 (110 V) 1-5010-004 (230 V)</td>
<td>For reproducible photo-activation while cooling the samples</td>
</tr>
<tr>
<td>caproMag&trade;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>caprotec bioanalytics GmbH</td>
<td>1-5100-001</td>
<td>For easy handling of magnetic particles without pipetting</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

profiling of methyltransferases and other s-adenosyl-l-homocysteine-binding proteins by capture compound mass spectrometry (ccms)

Afinite kromatografisi 1 veya Aktivite Bazlı Protein Profil 2 gibi fonksiyonel küçük molekül-protein etkileşimleri temelinde proteom karmaşıklığını azaltmak için çeşitli yaklaşımlar vardır. Trifunctional Yakalama Bileşikler (Aday, Şekil 1A) 3, genel bir yaklaşım için temel olan ilk denge odaklı bir küçük molekül prob (Burada seçicilik fonksiyonu, S-adenosil-L-homosistein, SAK, Şekil 1A) arasındaki etkileşimi ve hedef proteinler geri dönüşümsüz CC bağımsız bir fotoğraf activable reaktivite fonksiyonu (bir phenylazide) ve hedef proteinlerin yüzey arasında fotoğraf crosslinking üzerine sabitlenir. (Burada streptavidin manyetik boncuk gibi) bir katı faz yardımı ile karmaşık biyolojik karışımlar protein konjugatları - sıralama fonksiyonu (burada biyotin) CC izole etmek için hizmet vermektedir. Deneylerde iki konfigürasyonlar mümkündür: &quot;off-boncuk&quot; 4 veya şu anda açıklanan &quot;boncuk&quot; yapılandırma (Şekil 1B). Seçicilik fonksiyonu ilgi hemen hemen her küçük molekül (substratı, inhibitörü, ilaç molekülleri) olabilir. S-adenosil-L-metionin (SAM, Şekil 1A), muhtemelen, ATP, doğa 5, 6, en yaygın olarak kullanılan kofaktör ikinci . Bu DNA 7 8, RNA, proteinler, 9 veya küçük moleküller 10 methylate SAM-bağımlı methyltransferases (MTases), kimyasal reaksiyon tarafından katalize olan tüm canlı organizmalarda önemli metil grubu vericisi olarak kullanılır. (Gen regülasyonu, epigenetik, metabolizma) çeşitli fizyolojik senaryolarda metilasyon reaksiyonları önemli rol göz önüne alındığında, MTases profil kinazlar profil olarak fonksiyonel proteomik benzer bir öneme sahip olmaya beklenebilir. Ancak, kendi profil için analitik araçlar mevcut değildir. Yakın zamanda bu teknolojik boşluğu doldurmak için (Şekil 1A) SAK ile seçicilik grup olarak bir CC tanıttı. SAK, metil transferinden sonra SAM, ürünün bilinen bir genel MTase ürün inhibitörü 11. Bu nedenle ve doğal kofaktör SAM 12, kimyasal istikrarsızlık nedeniyle, SAK, MTases hedef CC için ideal bir seçicilik fonksiyonu kofaktör diğer bölgelerine aktarılması ya da radikal reaksiyonların yanı sıra başlatılması daha fazla enzimler tarafından kullanılır. Burada tercih edilen model olarak hizmet vermiştir Escherichia coli (E. coli), en iyi karakterize prokaryotlar biri, gerginlik DH5α profil MTases ve diğer ŞAH-bağlayıcı proteinler tarafından ŞAH-CC ve CCMS yardımcı programı rapor sayısız, biyokimyasal, biyolojik ve biyoteknolojik çalışmalarda organizma. Foto-aktive crosslinking deney verim ve hassasiyeti artırır ve özgüllüğü kolayca ücretsiz SAK bir fazla kullanarak rekabet deneylerde test edilebilir.

Watch this Scientific Journal Video about Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS at JoVE.com

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Yakalama Bileşikler fotoğraf crosslinking ve saflaştırma takip fonksiyonel geri dönüşümlü küçük molekül-protein etkileşim proteom karmaşıklığını azaltmak için trifunctional küçük moleküllerdir. Burada Yakalama Bileşik<em&gt; S</em&gt; Adenosil-<sub&gt; L</subBir methyltransferases izole&gt; seçicilik fonksiyonu olarak homosistein bağlayıcı<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Tüm hücre lizat ve MS bunları tanımlamak.

Methyltransferases, profilleme ve Diğer S Adenosil- L</subYakalama Bileşik Kütle Spektrometresi (CCMS)> homosistein bağlayıcı Proteinler

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

profiling-methyltransferases-other-s-adenosyl-l-homocysteine-binding

Research

JoVE Journal

Biology

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

15.5K Görüntüleme.  caprotec bioanalytics GmbH. Yakalama Bileşikler fotoğraf crosslinking ve saflaştırma takip fonksiyonel geri dönüşümlü küçük molekül-protein etkileşim proteom karmaşıklığını azaltmak için trifunctional küçük moleküllerdir. Burada Yakalama Bileşik S Adenosil- L seçicilik fonksiyonu olarak homosistein bağlayıcı Escherichia coli Tüm hücre lizat ve MS bunları tanımlamak.

Methyltransferases, profilleme ve Diğer S Adenosil- L homosistein bağlayıcı Proteinler

Methyltransferases, profilleme ve Diğer S Adenosil-_{L homosistein bağlayıcı Proteinler}