우리는 원고의 중요한 읽기위한 DRS 랜디 엘킨스, 로빈 Kastenmayer, 테드 토리, 댄 정지 및 Tovi 리먼 감사드립니다. 이 작품은 교내 연구 부문의 교내 연구 프로그램, 알레르기 및 전염병, 보건 국립 연구소 국립 연구소에 의해 중국의 973 국가 기초 연구 프로그램, # 2007CB513103에 의해 지원되었다. 우리는 도움을 NIAID 교내 편집기 브렌다 라에 마샬 감사합니다.

무균 기술은 실험 결과를 혼란시킬 수있는 마우스로 외인성 감염 요원의 실수로 도입을 피하기 위해 동물로 administrated 될 모든 재료에 적용해야합니다. 1. 피를 단계 말라리아 기생충과 실험실 쥐를 감염 <ol><li> 상온에서, 냉동 혈액 단계 말라리아 기생충을 포함하는 두 병이 깨지는 해동. 이 예제에서 사용이 쥐 말라리아 기생충의 종자는 Plasmodium yoelii yoelii 및 Plasmodium yoelii의 nigeriensis입니다. </li><li> 22-30 게이지 (G) 바늘로 주사를 맞게하고 살균, 제약 학년 PBS (산도 7.4) 400 μL를 그립니다. </li><li> 내용이 homogenously 혼합 때까지 주사기를 반전 아래, 같은 주사기를 사용하여 해동 감염된 혈액 100 μL를 그립니다. (옵션 : 피펫이 주사 주사기로 전송하기 전에 컬렉션 튜브에 PBS 및 감염된 혈액을 전송하는 데 사용할 수 있습니다.) </li><li> 기생충이 직접 마우스 복막에 솔루션을 포함하는 200 μL를 주입. 완료되면, 샵스 빈의 주사기를 폐기하십시오. (또한 실험실 마우스의 유지 관리에 대한 보충 자료를 참조). 일반적으로 inoculum의 표준 크기가 원래 냉동 자료에 기생충 감염의 수준에 따라, 100-500 μL 사이입니다. </li><li> 이 마우스 각으로 교차하는 두 기생충의 변종을 주사. 생쥐는 주사 후 미세 3-5일 긍정하게 될 것입니다. parasitemias가 1~5% 사이에 도달하면 다음 단계로 진행합니다. </li></ol> 2. 마우스의 혼합 클론 감염 <ol><li> 사전 혼합 복제 감염으로, Giemsa 스테인드 얇은 피묻은 얼룩에 의해 현미경 검사 (그림 3)에 대한 다른 기생충의 변종에 감염된 두 기증 마우스의 꼬리 혈액을 수집하고, 적혈구 세포 밀도의 측정 (세부 절차에 대한 보충 자료를 참조) . </li><li> 이전 얻은 parasitemia 붉은 혈액 세포 밀도 측정을 사용하여 생리 식염수 (1.5 % W / V trisodium의 구연 산염 이수화물, 0.85 % W / V 나트륨 염화물) 및 inoculum 혼합물을 생산하는 데 필요한 마우스 혈액의 볼륨을 계산합니다. </li><li> 100μl 당 백만 감염된 적혈구의 최종 농도에 기생충 솔루션을 조정합니다. </li><li> 혼합 복제 inoculum를 얻기 위해 1:1 비율에서 두 기증자로부터 감염된 혈액을 결합합니다. 두 부모의 클론이 성장 속도에 차이가하면,의 비율을 조정 1시 2분 또는 1시 5분에 느린 성장하는 부모 복제 부모의 빠른 성장. </li><li> 감염 각 마우스의 복막에 혼합 시료 100 μL를 주입. (주입하는 생쥐의 수를 결정하기 위해 3.9 단계도 참조) </li><li> 이 방법을 사용하여 단일 부모 변종 각이 쥐를 감염. 단일 클론 감염은 두 부모 변종을 성공적으로 전송 결정을하실 수 있습니다. </li></ol> 3. 수유 모기 <ol><li> 300-500 성인 (남성과 여성) 아노 펠 레스 모기 stephensi 각 pupae에서 세 5-7일 게시물의 출현을 포함하는 세 새장을 준비합니다. 용기는 플라스틱이나 금속 뚜껑에 의해 안전 그물로 덮여있다. 두 케이지는 부모의 클론에 이송되며 세 번째 케이지는 유전 십자가의 준비입니다. </li><li> 혼합 복제 감염 후 사일 시작 감염된 생쥐에서 Giemsa - 스테인드 얇은 혈액 꼬리 얼룩을 준비합니다. </li><li> 1000x 확대 최소한 50 미세한 필드를 검사하여 현미경으로 얼룩을 검사하고 남성과 여성의 gametocytes 존재 여부를 결정합니다. </li><li> 남성과 여성 gametocytes 큰 공포 대형 과립의 존재 (그림 3)에 의해 인식할 수 있습니다. 남성과 여성 gametocytes는 각각, 핑크, 파랑 세포질 있습니다. gametocytes가 존재하는 경우, 3.6 단계 따르십시오. </li><li> gametocytes이 결석하는 경우, 그들이 나타날 때까지 매일 계속 모니터링. gametocytes가 존재하는 경우 다음 단계를 계속합니다. </li><li> 마취제와 3 각 감염된 마우스 (20g 마우스 체중 당) 마취에 마우스 복막에 MG / xylazine의 ML 33 MG / ML을 포함한 마취 약물 칵테일 50 μL를 주입. 마취제와 xylazine의 최종 선량은 각각 82.5 및 7.5 MG / kg이다. </li><li> 쥐들이 24 시간을위한 설탕 공급 부족과 모기가 중단없이 30 분 동안 먹을 수있게되었습니다 성인 아노 펠 레스 모기 stephensi을 포함 새장 위에 엎드려서 얼굴을 넣습니다. </li><li> 표준 조건 (; 또한 실험실 모기의 유지 관리에 대한 보충 방법을 참조하십시오 온도가 24-26 사이에 유지 ° C)을 아래 insectary에서 모기를 유지합니다. </li><li> 모든 50-100 여성 모기 한 감염된 마우스를 사용합니다. 쥐가 마취하에 계속하는 동안 수유 후 자궁 전위에 의해 즉시 쥐를 안락사. </li></ol> 4. 해부 모스키토 MidgUTS 카운트 Oocysts <ol><li> 9 일 먹이 후, 모기는 곤충의 midgut에서 oocysts에 대해 검사됩니다. 단일 클론 감염된 생쥐에 피드가 두 부모 변종의 gametocytes을 나타냅니다 모기에 oocysts의 존재는 전염성이 있습니다. </li><li> 모기 midgut을 해부하다하려면, 새장 5-10 감염된 모기를 수집하는 작은 컨테이너에 연결된 흡인기를 사용합니다. </li><li> CO 2 가스를 사용하여 모기를 마취하고 얼음에 유리 페트리 접시에 그들을 전송합니다. 별도의 남성 모기를 폐기하십시오. 남성의 안테나는 암컷에 비해 눈에 띄게 bushier 있습니다. </li><li> PBS 두 주사기를 작성, 26 게이지 절반 인치 (G ½) 바늘과 함께 그들을 맞습니다. 유리 슬라이드에 주사기에서 PBS 100 μL에 대한 보증금. </li><li> PBS의 드롭에 5-10 anesthetized 여성 모기를 전송하고 해부 현미경에서 슬라이드를 놓으십시오. </li><li> 같은 바늘을 사용하면, 흉부 및 복부 뒷부분에서 곤충을 잡고, 다음 각 모기의 날개와 다리를 제거 midgut, 흰 색 같은 몸, 발표 때까지 분리 시체를 가져옵니다. midgut를 분리하고 신체의 나머지 부분을 삭제. </li><li> 슬라이드가 건조하는 경우 midgut에 대한 자세한 PBS를 추가합니다. 건조 해주면 midgut이 타락한 것이다. midguts 통해 커버 전표를 놓습니다. </li><li> 100x 확대에 가벼운 현미경 midguts을 검사합니다. (그림 3) 각 midgut에서 oocysts의 숫자를 세어보세요. Oocysts은 midguts의 바깥쪽 표면에 거짓말 두꺼운 벽 원형 구조로 인식할 수 있습니다. </li><li> 완료되면, 주사기, 주사 바늘 및 샵스 빈의 슬라이드의 폐기. </li><li> oocysts이 midguts에 부재중인 경우, gametocytes의 높은 숫자에 감염된 쥐 모기 먹이를하고 이상 수유 시간을 제공합니다. 온도는이 단계에 중요합니다. 온도가 24-26 ° C.에 설정되어 있는지 확인 </li></ol> 5. 원심 분리에 의해 모기 Sporozoites 모집 <ol><li> 다음과 같이 sporozoite 수집 튜브를 준비 : 깨끗이 0.5 - ML의 원심 분리기 튜브의 뚜껑을 잘라 골조 19 G 바늘을 사용하여 튜브의 하단에있는 구멍 (0.1-0.2 mm 직경)를 펀치. </li><li> 글라스 울로 튜브의 1 / 3을 입력합니다. (한 관 ~ 100 모기에서 수확 sporozoites 충분합니다) 1.5 - ML 수집 관에 필터 튜브를 삽입 </li><li> 17 일 게시물 먹이에서 흡인기를 사용하여 작은 용기에 케이지에서 모기 (4 단계)를 수집합니다. </li><li> 모기를 마취하는 CO 2 가스를 사용합니다. </li><li> 남성 모기의 암컷을 분리. 컨테이너에서 얼음에 유리 페트리 접시에 anesthetized 여성 모기를 전송합니다. </li><li> PBS로 가득한 26 G의 ½ 잎 두 개의 주사기를 준비합니다. 유리 슬라이드에 주사기에서 PBS 100 μL에 대한 보증금. </li><li> 현미경 슬라이드에 모기를 전송합니다. 해부 현미경 모기 &#39;머리, 날개, 다리와 복부를 제거합니다. </li><li> 세부적으로 밀고 집게를 사용하면 1.5 ML 균질 화기 (박격포와 유봉)에서 0.5 ML PBS로 thoraxes를 전송합니다. (sporozoite 2-3 H에 대한 infective 유지) 얼음 thoraxes을 저장합니다. </li><li> (그림 3 참조) 침샘에서 sporozoites를 공개 얼음 thoraxes을 균질하고, 유리 피펫을 사용하여 글라스 울 (단계 5.1-5.2)로 채워진 튜브에 lysates을 (homogenates) 전송. </li><li> 상온에서 1,000 rpm으로 10-20 초위한 원심 분리기. </li><li> 수집 흐름 -을 통해 (정화의 sporozoite 서스펜션)가 22-30 G의 바늘로 주사를 사용합니다. (옵션 : 드롭 흐름을 통해 미세한 슬라이드에 커버가 표준 가벼운 현미경, 400X 배율에서 살고 sporozoites를 실수로 시각화 장소도 참조 그림 3 10-50 μL) </li><li> 마우스 (; 심판이 12 참조 최대 200,000 기생충이 단일 모기에서 수확 가능)로 sporozoite 정지의 IP 0.1-0.5 ML을 주사. 성공적인 경우에, 동물은 주사 후 72 시간을 감염 될 것입니다. </li></ol> 6. 제한 희석을 사용하여 복제 프로 제니 <ol><li> sporozoite 주사 후 72 시간이 얇은 피묻은 얼룩의 Giemsa의 얼룩 후 적혈구 세포 밀도의 측정 현미경 검사에 대한 다른 기생충의 변종 (자세한 절차를 보려면 보충 자료 참조)에 감염된 두 기증 마우스의 꼬리 혈액을 수집합니다. </li><li> 0.1-1 %의 parasitemia을 표시 마우스를 선택하고 그의 감염된 적혈구가 복제 절차 기증자로서 주로 단일 기생충을 포함하고 있습니다. 생쥐가 미세하게 부정하는 경우 6.1 일 다음 단계를 반복합니다. 동물이 14 일 이내에 감염되지 않는 경우) 5 단계 중 2 단계를 반복하고 단계 5.11에서 sporozoites의 존재를 결정합니다. </li><li> 송아지 혈청과 포유 동물 링어의 솔루션 (2.7 MM의 칼륨 염화물, 1.8 MM의 염화칼슘, 154 MM의 나트륨 염화물)의 차가운 1시 1분 솔루션에 수확 꼬리 혈액을 희석해서로 죄수를 달성하기 위해한 감염된 적혈구 100 μL 당 세포, 그리고 얼음에 inoculum를 저장할 0.6의 centration. 이러한 방법으로 개인 마우스의 대부분은 하나 또는 제로 기생충 중 하나를 받으실 수 있습니다. </li><li> 정맥 50-100 생쥐의 각 희석 감염된 혈액 100 μL를 주입. </li><li> 5 ~ 7 일 후, Giemsa - 스테인드 얇은 피묻은 얼룩을 검사하여 혈액 무대 기생충의 존재에 대한 쥐를 화면. 성공적인 실험에서 생쥐의 20~50%가 감염되어 8 일 이후 감염에서 0.1-5.0 %의 parasitemia를 표시합니다. </li></ol> 7. 유전자 표식을 사용하는 제니의 특성화 <ol><li> 냉장 생리학 구연 산염 생리 식염수, 소용돌이 짧게, 그리고 펠렛 혈액 세포로 상온에서 3,000 rpm으로 3 분위한 원심 분리기의 0.2 ML를 포함하는 1.5 - ML의 microcentrifuge 관에서 마우스 꼬리 피가 20-40 μL를 수집합니다. 바로 DNA를 추출하거나 -80시 펠렛 ° C. 유지 </li><li> 표준 DNA 추출 방법을 사용 기생충 DNA를 준비합니다. DNA의 급속한 분리 들어, 높은 순수 PCR 템플릿을 준비 키트 (로체 응용 Bioscience)를 사용합니다. </li><li> 재조합 자손은 microsatellite (MS) 또​​는 유전 십자가의 두 부모의 변종을 차별화 할 수 서로 다른 염색체에있는 단일 염기 다형성 (SNP)를 사용하여 genotyping 후 확인할 수 있습니다. P. MS의 genotyping을위한 단일 형광 라벨이 표시된 primers를 사용하는 단순 방법 yoelii는 (심판이 8,9 참조) 사용할 수 있습니다. </li></ol> 8. 피를 단계 말라리아 기생충의 Cryopreservation <ol><li> 50-10 ML의 50~20%의 parasitemia와 anesthetized 마우스 심장 주사에 의해 감염된 혈액의 0.5-1 ML 수집은 생리 생리 식염수를 차게. </li><li> 상온에서 2,000 rpm으로 5 분 원심 분리기. 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 혈액 알약에 Glycerolyte 57 솔루션 드롭 현명한 2X 볼륨 (Fenwal 연구소)을 추가하고 잘 섞는다. </li><li> cryotubes (튜브 당 0.2-0.5 ML)에 정지를 전송합니다. </li><li> -80 ° C (최대 1 월) 또는 액체 질소에 cryopreserved 혈액을 저장합니다. </li></ol> 9. 대표 결과 : 성공적인 실험에서 복제된 라인 50~10% 독립 재조합 자손 것입니다. <img src="/files/ftp_upload/2365/2365fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 유전자 교차하는 동안 가족 생활주기와 유전자 재조합 이벤트 도식 표현. 유전자 재조합 이벤트 모기의 발전의 초기 단계에서 이루어집니다. 모기의 midgut 다른 유전 배경을 &quot;haploid&quot;남성과 여성 gametes의 수정에 따라, &quot;diploid&quot;zygotes가 형성됩니다. 접합자는 기생충의 생활주기의 유일한 diploid 단계를 구성, 감수 분열은 수정 12 시간 이내에 다음과 모기와 포유류의 모든 후속 단계가 haploid 남아있다. 결과 zygotes는 ookinetes 및 oocysts으로 개발합니다. 각 oocyst의 성장과 mitotic 사업부는 모기 &#39;hemoceal에 출시되는 sporozoites 수천을 생산하고 있습니다. 침샘으로 마이 그 레이션하는 사람 sporozoites는 간과 적혈구 세포 단계의 개발이 이루어지는 포유류의 호스트로 전송하는 위치에 있습니다. 붉은 혈액 세포주기의 과정에서, 몇몇 기생충은 성숙한 남성과 여성의 gametocytes로 구별하실 수 있습니다. 이러한 gametocytes 다른 모기, 영속 전송에 의해 촬영 때 기생충의 생활주기가 완료되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/2365/2365fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 말라리아 기생충 및 재조합 자손의 생산에 핵 유전자의 상속. 유전자 재조합은 염색체 reassortment이나 크로스 오버 이벤트에 의해 생성하실 수 있습니다. Homozygous 자손 같은 부모 클론 1 개 또는 2 개 (A와 D), 각각의 gametes 사이 selfing에 의해 생산. B) 두 개의 다른 부모 클론 혼자 염색체 reassortment에 의해 형성되는 재조합 핵 (블루 타원)의 gametes 사이의 교차 수정에 의해 만들어진 Heterozygous 자손. C) 상동 염색체의 비 자매 chromatids 사이 crossovers에 의해 형성되는 두 개의 다른 부모 클론, 재조합 핵 (적색 타원)의 gametes 사이의 교차 수정에서 생산 Heterozygous 자손. <img src="/files/ftp_upload/2365/2365fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 설치류 말라리아 기생충 Plasmodium yoelii의 형태론. 10 일째 게시물 oocysts와) 링 단계, B) trophozoite, C) schizont, D) merozoites, E) 미숙한 남성 gametocyte, F) 성숙 남성 gametocyte, G) 미숙한 여성 gametocyte, H) 성숙 여성 gametocyte 전) midgut 먹이 (화살표로 표시 성숙 oocysts, 200x 배율), J) 모기 침샘 (100x 배율), K) sporozoites (400x 배율).

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저자는 공무원이며, 이것은 정부의 작품이기 때문에 작품은 미국에서 이미 공개 도메인에 있습니다. 다른 계약에도 불구하고, NIH는 표시 PubMedCentral에 작품을 제공하고 대중 사용할 수있는 권리를 보유하고 PubMedCentral는 관습 관행과 일치 작업을 태그 또는 수정하실 수 있습니다. 당신은 정부가 사용 라이센스에 따라 미국 이외의 권한을 설정할 수 있습니다.

우리는 또한 다른 쥐 malarias의 유전 십자가의 생산에 적용되는 설치류 말라리아 Plasmodium yoelii에서 유전자 십자가의 생산을위한 기술을 보여줍니다. 단일 클론 부모와 생쥐의 감염은 대개 부모가 십자가를 수행하기 전에 기능 gametes를 생산 능력이 있는지 확인하는 부모 기생충의 성공적인 전송을 결정하기 위해 수행됩니다. 모기를 통해 성공적인 전송이 insectary의 온도...

보충 자료 : <ul><li> 실험실 생쥐들의 유지 보수 </li><li> 연구실 모기 유지 </li><li> Giemsa 물들다 얇은 피묻은 얼룩의 현미경 검사는 얼룩 </li><li> 붉은 혈액 세포 밀도의 측정 </li></ul> 실험실 생쥐들의 유지 보수 근친 실험실 마우스 스트레인 5~8주 오래된 세 BALB / C,의 여성이 연구에 사용됩니다. 마우스는 피더와 물통을 갖춘 와이어 바 뚜껑이있는 표준 솔리드 하단에 폴리 카보 네이트 케이지에 보관되어 있습니다. 마우스가 일정한 온도 유지 (25 ± 1 ° C) 12시 12분 시간에 조명 : 어두운주기. (sterilizable, 할란 - Teklad에서) 생쥐 2018S 할런 Teklad 글로벌 19 % 단백질 압출 쥐 다이어트 피드를 허용하고 산성의 식수 광고 libitum와 함께 제공된. 동물 실험 프로토콜 LMVR11E (건강, 베데스다, 메릴랜드 국립 연구소)에서 알레르기 및 전염병 국립 연구소에서 동물 케어 및 사용위원회에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행됩니다. 연구실 모기 유지 아노 펠 레스 모기 stephensi의 실험실에서 자란 식민지에서 있습니다. 성인은 온도 및 습도 제어 방 (25 23 보관 나일론 새장에 유지됩니다 ° Plasmodium yoelii 및 Plasmodium chabaudi에 대한 C, 21 to 19 ° Plasmodium berghei에 대한 C, 80~95% 습도; 12시 12분에 시간 라이트 : 어두운 사이클). 성인 모기가 10 % 포도당과 2.00 % 파라 아미노 벤의 산성 (PABA) 보충 물 솔루션을 공급하고 있습니다. 고품질의 성인을 얻으려면, 500 애벌레는 중탄산 약 1 MG와 함께 제공되는 1000 cm 3 열 접시에 증류수 1 L에 낮은 밀도 상태로 재배하고 있습니다. 그들은 번데기 단계로 발전하기 전까지 부화 후 유충은 tetramin 분말 (페트코에게) 부여되고 신흥위한 성인 모기 케이지으로 전송됩니다. Giemsa 물들다 얇은 피묻은 얼룩의 현미경 검사는 얼룩 를 사용하여 깨끗한 가위는 감염된 마우스의 꼬리의 끝 (1.0 mm)를 해제 싹둑. 깨끗한 표본 슬라이드에 꼬리 혈액 플레이스 한방울 (0.5-1.0 μL). 마우스 1-2 분에 출혈이 중단됩니다. 표본 슬라이드에 45 ° 각도로 상대에 그것을 유지, 혈액 드롭 위에 깨끗한 확장기가 슬라이드를 삽입하고, 혈액이 확장기의 전체 너비 adsorb 수 있습니다. 표본 슬라이드를 잡고 얇은 얼룩을 만들어 빠르게하고 원활하게 전달 확장기 슬라이드를 밀어. 절대 메탄올에 슬라이드를 담가 후 혈액 영화 건조 해합니다. Giemsa 얼룩 (증류수에서 10 % Giemsa 염색)로 덮는 전에 한 번 더 건조 공기에 슬라이드를 허용합니다. 실온에서 10-15 분 얇은 혈액 영화를 잠복기 후, 신중하게 수돗물로 슬라이드를 씻어하고 공기가 건조 보자. 1000x 배율 (100x 객관적인 렌즈)와 계산 parasitemia (RBC는 계산 100 당 iRBC의 숫자)에 침지 기름 가벼운 현미경, 감염된 적혈구 (감염된 RBC의 형태에 대한 그림 3 참조 iRBC)의 번호를 확인합니다. 말라리아 기생충의 다른 변종 성장 속도와 pathogenicity에 따라 다릅니다. 혈액 무대 parasitaemias의 모니터링은 혈액 단계 말라리아 기생충의 복용량에 따라 주사 후 24 시간 수행할 수 있습니다. 10 7 감염된 RBC intraperitoneally 또는 정맥 10 6 감염된 RBC와 함께 주입하면 예를 들어, 마우스가 미세하게 긍정적인 24 시간 것입니다. 붉은 혈액 세포 밀도의 측정 parasitaemias, 감염된 생쥐의 적혈구 세포 (RBC) 밀도의 수준과 같은 감염의 과정에 걸쳐 다릅니다. RBC 밀도는 단일 및 혼합 복제 감염의 시작과 복제 실험을하기 전에 1-2 시간 이내에 측정한다. Cellometer를 사용하여 노이 바 우어 hemocytometer 및 자동 계산 (Nexcelom Bioscience)를 사용하여 수동으로 계수 : RBC 밀도 측정을위한 두 가지 방법이 있습니다. 두 방법에서는 모세관 유리 (VWR)를 사용하여 마우스 꼬리 혈액 1 μL를 철회하고 PBS의 10 ML에 희석하여 잘 섞는다. 노이 바 우어의 hemocytometer를 사용하려면 hemacytometer에 정지 20 μL를로드합니다. 10X 객관적인 렌즈와 가벼운 현미경에 hemacytometer 놓으십시오. hemacytometer 추가 16 작은 사각형으로 나뉩니다 9 큰 사각형과 모서리에 4 큰 사각형으로 나누어 그리드가 포함되어 있습니다. 네 개의 코너 광장에서 16 작은 사각형의 각 세포의 총 수를 계산합니다. 바이어스를 계산하거나 그리드 라인을 중첩 셀을 계산하지 않으려면, &quot;에&quot;로 셀 계산이 중복하는 경우 상단 또는 오른쪽 라인과 &quot;아웃&quot;이 중복 아래쪽이나 왼쪽 라인을 경우. 작은 평방 당 세포의 숫자를 추정하고 0.00625 (작은 사각형의 볼륨이 6.25 NL이다)로 나눕니다. 이것은 microliter 당 세포 (&amp;의 개수를 산출무, L). 이 데이터에서 10,000 (희석 계수)과 곱하여 최종 적혈구 세포 밀도를 계산합니다. 공기 건조, 증류수와 70 % 에탄올로 커버 슬립과 집계 실 린스. 또는 Cellometer의 계수 챔버 슬라이드에 정지 20 μL를로드합니다. Cellometer 슬라이드 챔버 (독자)에 슬라이드를 삽입합니다. , Cellometer 소프트웨어를 시작하고 &quot;적혈구 세포&quot;옵션을 선택하고, 10,000 희석 요소를 입력합니다. RBC 밀도를 기록합니다.

protocol for production of a genetic cross of the rodent malaria parasites

antimalarial 약물에 대한 응답과 말라리아 기생충의 pathogenicity의 변화는 생물 학적 및 의료 중요하다. 연계 매핑 1-3 설치류와 인간의 4-6 말라리아 기생충의 다양한 특성을 기본 유전자 또는 loci 성공적으로 확인되었다. 말라리아 기생충 Plasmodium yoelii 야생 아프리카 설치류로부터 분리된 많은 말라리아 종 중 하나이며 실험실에서 성장에 적응되었습니다. 이 종족은 인간의 말라리아 기생충의 생물 학적 특성 중 많은 것들을 재현한, 같은 microsatellite 및 증폭 단편의 길이 다형성 (AFLP) 마커와 같은 유전자 마커 또한 기생충 7-9 위해 개발되었습니다. 따라서, 쥐 말라리아 기생충의 유전자 연구는 Plasmodium falciparum에 대한 연구를 보완하기 위해 수행할 수 있습니다. 여기, 우리는 P.의 유전 십자가를 생산을위한 기술을 보여줍니다 첫째 DRS에 의해 개척되었다 yoelii. 데이비드 Walliker, 리차드 카터와 에딘버러 (Edinburgh) 10 대학에서 동료. P.의 유전 십자가 yoelii 및 기타 설치류의 말라리아 기생충은 관심의 phenotypes와 모기가 사일 감염 후 감염된 생쥐에서 피드 수에 따라 다릅니다 두 유전자 별개의 클론의 gametocytes를 포함 inoculum와 쥐 뮤스의 musculus를 감염에 의해 실시하고 있습니다. 마우스 혈액에서 남성과 여성 gametocytes의 존재는 미세 이송하기 전에 확인합니다. 수유 후 48 시간 이내에 모기의 midgut에서 haploid gametocytes은 남성과 여성의 gametes에 차별 비옥하고, diploid의 접합자 (그림 1) 형태. ookinete에 접합자의 개발 과정, 감수 분열 11 발생 나타납니다. 접합자는 두 유전자 별개의 기생충, 유전자 교류 (. 상동 염색체의 쌍 비 자매 chromatids 사이의 염색체 reassortment 상호 오버, 그림 2) gametes 사이의 교차 수정을 통해 파생하는 경우는 재조합의 결과가 발생할 수 있습니다 동종 loci에서 유전 물질. 각 접합자 네 haploid의 핵 이어지는 두 개의 연속 핵 분열을 겪습. ookinete 추가 oocyst으로 개발하고 있습니다. oocyst가 성숙되면, sporozoites (십자가의 자손)의 수천이 형성 및 모기 hemoceal로 출시됩니다. Sporozoites는 침샘에서 수확 및 사전 erythrocytic 및 erythrocytic 단계 개발이 이루어지는 새로운 murine 호스트로 주입됩니다. Erythrocytic 양식은 복제와 유전 결합 매핑하기 전에 부모의 라인을 구분 문자에 관한 분류됩니다. 개별 부모 클론 제어 감염은 유전 십자가의 생산과 같은 방식으로 수행됩니다.

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Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

쥐 말라리아 기생충의 유전자 십자가는 모기에 두 유전자 별개의 기생충을 먹이에 의해 수행됩니다. 재조합 자손은 모기가 감염된 쥐를 물어 수 있도록 후 마우스 혈액에서 복제됩니다. 이 비디오의 유전자 십자가를 생산하는 방법을 보여줍니다<em&gt; Plasmodium yoelii</em&gt; 기타 설치류의 말라리아 기생충에 적용됩니다.

쥐 말라리아 기생충의 유전자 크로스의 생산을위한 프로토콜

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

protocol-for-production-genetic-cross-rodent-malaria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.1K 조회수.  National Institutes of Health. 쥐 말라리아 기생충의 유전자 십자가는 모기에 두 유전자 별개의 기생충을 먹이에 의해 수행됩니다. 재조합 자손은 모기가 감염된 쥐를 물어 수 있도록 후 마우스 혈액에서 복제됩니다. 이 비디오의 유전자 십자가를 생산하는 방법을 보여줍니다 Plasmodium yoelii 기타 설치류의 말라리아 기생충에 적용됩니다.

비디오: Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most common forms of disease are visceral leishmaniasis (VL) and cutaneous leishmaniasis (CL). Mouse models of leishmaniasis are widely used, but quantification of parasite burdens during murine disease requires mice to be euthanized at various times after infection. Parasite loads are then measured either by microscopy, limiting dilution assay, or qPCR amplification of parasite DNA. The in vivo imaging system (IVIS) has an integrated software package that allows the detection of a bioluminescent signal associated with cells in living organisms. Both to minimize animal usage and to follow infection longitudinally in individuals, in vivo models for imaging Leishmania spp. causing VL or CL were established. Parasites were engineered to express luciferase, and these were introduced into mice either intradermally or intravenously. Quantitative measurements of the luciferase driving bioluminescence of the transgenic Leishmania parasites within the mouse were made using IVIS. Individual mice can be imaged multiple times during longitudinal studies, allowing us to assess the inter-animal variation in the initial experimental parasite inocula, and to assess the multiplication of parasites in mouse tissues. Parasites are detected with high sensitivity in cutaneous locations. Although it is very likely that the signal (photons/second/parasite) is lower in deeper visceral organs than the skin, but quantitative comparisons of signals in superficial versus deep sites have not been done. It is possible that parasite numbers between body sites cannot be directly compared, although parasite loads in the same tissues can be compared between mice. Examples of one visceralizing species (L. infantum chagasi) and one species causing cutaneous leishmaniasis (L. mexicana) are shown. The IVIS procedure can be used for monitoring and analyzing small animal models of a wide variety of Leishmania species causing the different forms of human leishmaniasis.

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

An in vivo imaging system is used to generate quantitative measurements of murine infection with the Trypanosomatid protozoan Leishmania. This is a non-invasive and non-lethal method for detecting parasites expressing luciferase within many tissues throughout the course of chronic Leishmania spp. infection.

라이브 호스트에 트렌스 제닉 Leishmania의 기생충의 생체내 이미징에서

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

연구

면역학 및 감염병학

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Mosquitoes are vectors for a number of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites and filarial worms. Laboratories are investigating anti-pathogen components of the innate immune system in disease vector species in the hopes of generating transgenic mosquitoes that are refractory to such pathogens1, 2. The innate immune system of mosquitoes consists of several lines of defense 3. Pathogens that manage to escape the barrier imposed by the epithelium-lined mosquito midgut 4 enter the hemolymph and encounter circulating hemocytes, important cellular components that encapsulate and engulf pathogens 5, 6. Researchers have not found evidence for hematopoietic tissues in mosquitoes and current evidence suggests that the number of hemocytes is fixed at adult emergence and numbers may actually decline as the mosquito ages 7. The ability to properly collect and identify hemocytes from medically important insects is an essential step for studies in cellular immunity. However, the small size of mosquitoes and the limited volume of hemolymph pose a challenge to collecting immune cells. 
Two established methods for collecting mosquito hemocytes include expulsion of hemolymph from a cut proboscis 8, and volume displacement (perfusion), in which saline is injected into the membranous necklike region between the head and thorax (i.e., cervix) and the perfused hemolymph is collected from a torn opening in a distal region of the abdomen 9, 10. These techniques, however, are limited by low recovery of hemocytes and possible contamination by fat body cells, respectively 11. More recently a method referred to as high injection/recovery improved recovery of immunocytes by use of anticoagulant buffers while reducing levels of contaminating scales and internal tissues 11. While that method allows for an improved method of collecting and maintaining hemocytes for primary culture, it entails a number of injection and collecting steps that are not necessary if the downstream goal is to collect, fix and stain hemocytes for diagnostics. Here, we demonstrate our method of collecting mosquito hemolymph that combines the simplicity of perfusion, using anticoagulant buffers in place of saline solution, with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes.

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A simplified yet accurate method to collect and stain mosquito hemocytes is described. Our method combines the simplicity of perfusion with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes. This method facilitates studies requiring knowledge of the types of hemocytes and their abundance.

옐로 피버 모스키토에서 Hemocytes를 수집 및 스테 이닝을위한 프로토콜 Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

모든 독감의 양적 분석 간단한 슬롯 얼룩 Assays에서 유니버설 항체를 사용하는 바이러스성 Hemagglutinins 및 Neuraminidases를 입력하십시오

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

에서 DNA 추출을위한 간단한 Chelex 프로토콜<em&gt; 아노펠레스</em&gt; 종.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene function and phenotype(s). The development of mutant strains with targeted gene deletions, targeted mutations, complemented gene function, and/or tagged genes provides powerful strategies to address gene function, particularly if these genetic manipulations can be efficiently targeted to the gene locus of interest using integration mediated by double cross over homologous recombination.
Due to very high rates of nonhomologous recombination, functional genomic analysis of Toxoplasma gondii has been previously limited by the absence of efficient methods for targeting gene deletions and gene replacements to specific genetic loci. Recently, we abolished the major pathway of nonhomologous recombination in type I and type II strains of T. gondii by deleting the gene encoding the KU80 protein1,2. The &Delta;ku80 strains behave normally during tachyzoite (acute) and bradyzoite (chronic) stages in vitro and in vivo and exhibit essentially a 100% frequency of homologous recombination. The &Delta;ku80 strains make functional genomic studies feasible on the single gene as well as on the genome scale1-4.
Here, we report methods for using type I and type II &Delta;ku80&Delta;hxgprt strains to advance gene targeting approaches in T. gondii. We outline efficient methods for generating gene deletions, gene replacements, and tagged genes by targeted insertion or deletion of the hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HXGPRT) selectable marker. The described gene targeting protocol can be used in a variety of ways in &Delta;ku80 strains to advance functional analysis of the parasite genome and to develop single strains that carry multiple targeted genetic manipulations. The application of this genetic method and subsequent phenotypic assays will reveal fundamental and unique aspects of the biology of T. gondii and related significant human pathogens that cause malaria (Plasmodium sp.) and cryptosporidiosis (Cryptosporidium).

Genetic Manipulation in &lt;em&gt;&amp;Delta;ku80&lt;/em&gt; Strains for Functional Genomic Analysis of &lt;em&gt;Toxoplasma gondii&lt;/em&gt;

Here we report a method for using type I and type II &Delta;ku80 strains of Toxoplasma gondii to efficiently generate targeted gene deletions and gene replacements for functional genomic analysis.

유전 조작<em&gt; Δku80</em의 기능 게놈 분석을위한&gt; 균주<em&gt; 톡소 포자충</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Many experimental systems have been utilized to understand the mechanisms regulating T cell development and function in an immune response. Here a genetic approach using retroviral transduction is described, which is economic, time efficient, and most importantly, highly informative in identifying regulatory pathways.

공부하는 유전 적 접근으로 헬퍼 T 세포의 레트로 바이러스 형질 도입은 메커니즘 자신의 차별화 및 기능 제어

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new method with a powerful and simple strategy for the establishment of B-LCLs, the red blood cell lysis method. This method simplified the PBMC separation procedure with red blood cell removal, and used as little as 0.5 mL of whole blood for establishing EBV-immortalized cell lines, which can proliferate to large cell numbers in a relatively short amount time with a 100% success rate. The method is simple, reliable, time saving, and applicable to treating a large number of the clinical samples.

A simple red blood cell lysis method for establishing B-LCLs was developed with high immortalization efficiency, requiring a small amount of blood and saving time from initiation to cryopreservation.

B 임파 세포 라인의 설립에 대한 간단한 적혈구 용해 방법

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

Phenotypic Analysis of Rodent Malaria Parasite Asexual and Sexual Blood Stages and Mosquito Stages

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. However, effective malaria parasite targets for vaccine and chemotherapy development are still limited. This is largely due to the unavailability of relevant and practical in vivo infection models for human Plasmodium species, most notably for P.&#160;falciparum and P. vivax. Therefore, rodent malaria species have been extensively used as practical alternative in vivo models for malaria vaccine, drug targeting, immune response, and functional characterization studies of conserved Plasmodiumspp. genes. Indeed, rodent malaria models have proven to be invaluable, especially for exploring mosquito transmission and liver stage biology, and were indispensable for immunological studies. However, there are discrepancies in the methods used to evaluate the phenotypes of transgenic and wild-type asexual and sexual blood-stage parasites.&#160;Examples of these discrepancies are the choice of an intravenous vs. intraperitoneal infection of rodents with blood-stage parasites and the evaluation of male gamete exflagellation. Herein, we detail standardized experimental methods to evaluate the phenotypes of asexual and sexual blood stages in transgenic parasites expressing reporter-gene or wild-type rodent malaria parasite species. We also detail the methods to evaluate the phenotypes of malaria parasite mosquito stages (gametes, ookinetes, oocysts, and sporozoites) inside Anopheles mosquito vectors. These methods are detailed and simplified here for the lethal and non-lethal strains of P. berghei and P. yoelii but can also be applied with some adjustments to P. chabaudi and P. vinckei rodent malaria species.

Due to the striking similarities of the life cycle and biology of rodent malaria parasites to human malaria parasites, rodent malaria models have become indispensable for malaria research. Herein, we standardized some of the most important techniques used in the phenotypic analysis of wild-type and transgenic rodent malaria species.

설치류 말라리아 기생충 무성 및 성적 혈액 단계 및 모기 단계의 현상형 분석

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

소설 급지대 무료 시스템 대량 생산을 위한 생체 외에서 Murine 자연 킬러 세포의

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate hosts, respectively. While pathogenic symptoms of leishmaniasis can vary widely, from benign cutaneous lesions to highly fatal visceral disease forms depending on the infective species, all Leishmania species reside inside host macrophages during the vertebrate stage of their lifecycle. Leishmania infectivity is therefore directly related to its ability to invade, survive and replicate within parasitophorous vacuoles (PVs) inside macrophages. Thus, assessing the parasite&#39;s ability to replicate intracellularly serves as a dependable method for determining virulence. Studying leishmaniasis development using animal models is time-consuming, tedious and often difficult, particularly with the pathogenically important visceral forms. We describe here a methodology to follow the intracellular development of Leishmania in bone marrow-derived macrophages (BMMs). Intracellular parasite numbers are determined at 24 h intervals for 72 - 96 h following infection. This method allows for a reliable determination of the effects of various genetic factors on Leishmania virulence. As an example, we show how a single allele deletion of the Leishmania Mitochondrial Iron Transporter gene (LMIT1) impairs the ability of the Leishmania amazonensis mutant strain LMIT1/&#916;Lmit1 to grow inside BMMs, reflecting a drastic reduction in virulence compared to wild-type. This assay also allows precise control of experimental conditions, which can be individually manipulated to analyze the influence of various factors (nutrients, reactive oxygen species, etc.) on the host-pathogen interaction. Therefore, the appropriate execution and quantification of BMM infection studies provide a non-invasive, rapid, economical, safe and reliable alternative to conventional animal model studies.

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

All pathogenic Leishmania species reside and replicate inside macrophages of their vertebrate hosts. Here, we present a protocol to infect murine bone marrow-derived macrophages in culture with Leishmania, followed by precise quantification of intracellular growth kinetics. This method is useful for studying individual factors influencing host-pathogen interaction and Leishmania virulence.

대 식 세포 안의 세포내 성장의 정량화는 빠르고 Leishmania 기생충의 독성을 평가 하기 위한 신뢰할 수 있는 방법

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate ...