여기에 설명된 프로토콜은 작은 실험실 케이지 시험에서 야생 형 대응과 형질 전환 모기 성능 및 비교를 평가하는 것이 적절합니다. 작은 케이지 시험은 말라리아 제거를 위한 새로운 기술의 구현을 채우는 것을 도울 경험적 가치를 제공하는 것이 중요합니다. 케이지 시험은 그밖 실험적인 디자인에 적응할 수 있고 욕망 트랜스 유전자의 위협의 역학을 평가하기 위하여 적당합니다.
소개 형질전환 개인에 따라. 삼중계에 3개의 0.216 입방 미터 케이지를 설정하여 실험의 초기 단계를 시작합니다. 그리고 3 주 동안 각 케이지에 60 초 인스타 야생 형 애벌레를 추가합니다.
매주 각 케이지에 마취된 마우스를 혈액 식사 소스로 제공합니다. 그리고 혈액 식사 후 3 일 동안 oviposition 용기. 매주 각 케이지에서 계란을 부화.
4주에서 8주차까지 60개의 두 번째 인스타 L2 애벌레를 무작위로 선택하여 각 케이지로 돌아갑니다. 9주차에는 케이지 를 컨트롤로 임의로 할당하고 원하는 릴리스 비율에 대해 1세트를 할당합니다. 매주 30마리의 남성과 30명의 암컷을 가진 60마리의 야생식 새끼를 컨트롤 케이지에 넣습니다.
60 야생 형 pupae와 함께 30 형질 전환 남성 강아지를 매주 추가하여 각 케이지에서 1 대 1 비율을 유지합니다. 1 대 0.1 비율로, 60 야생 유형 pupae와 함께 각 케이지에 매주 300 형질전환 남성 강아지를 추가합니다. 케이지에 모기 강아지를 추가하고 매주 혈액 식사를 제공하고 계란을 부화하십시오.
각 케이지에서 총 300개의 애벌레를 무작위로 선택하여 스크리닝을 선택합니다. 유충 및 푸팔 단계에서 형광 지배적 인 마커의 발현을 위해 형광 필터로 스테레오 현미경으로 유충을 검사하십시오. 결과 강아지의 섹스를 점수.
유전자 드라이브 실험에서 모기를 안전한 곤충에 보관하고 정기적인 모니터링을 통해 표준 수술 절차를 수행함으로써 장벽 전략을 사용합니다. 원하는 형질전환에서 야생형 남성 방출비에 대해 2세트의 트리플리케이트 0.216 입방미터 케이지로 케이지를 준비합니다. 1 대 1의 남성 방출 비율을 달성하기 위해, 추가 120 형질 전환 남성, 120 야생 유형 남성과 여성 각 복제 케이지에 pupa 단계에서.
각 케이지에서 4~7일 된 암컷에 마취된 마우스를 사용하여 혈액식을 제공합니다. 애벌레 트레이에 알을 부화 한 후, 각 케이지에서 무작위로 약 240 최초의 인스타 L1 애벌레를 선택하고 각각의 케이지로 돌아가기 전에 강아지로 양육하십시오. 전에 설명한 바와 같이 눈 마커 및 성 표현형을 위해 애벌레를 선택하고 검사합니다.
야생 형 남성에 형질전환의 각 특정 방출 비율에 대한 남성과 여성의 동일한 수와 triplicate 0.005 입방 미터 케이지의 케이지 설정을 조립합니다. 인공 수유 장치를 사용하여, 2 일 연속으로 각 케이지에 있는 4 7 일 된 여성에게 혈액 식사를 제공합니다. 두 번째 혈액 식사 후 3 일, oviposition 용기를 추가하고 3 일 후 용기를 제거합니다.
모든 죽은 자와 섹스에 의해 케이지에 남아 살아있는 성인을 득점 한 후, 분자 분석을 위해 영하 80도에서 저장합니다. 계란을 부화하고 200 L1 애벌레를 선택하고 다음 세대를위한 새로운 케이지를 채우기 위해 애벌레를 따로 설정합니다. 그런 다음 무작위로 검사를 위해 따로 설정 각 케이지에서 다른 500 애벌레를 선택합니다.
선택한 200개의 애벌레와 푸파, 500개의 애벌레를 L4 인스타 스테이지로 후배합니다. 새 케이지를 채우기 위해 200 트레이에서 강아지를 반환합니다. 화면 무작위로 선택 된 애벌레 눈 마커 및 섹스 표현형 이전과 같이.
대표적인 분석에서, 가장 우수한 복제의 예상 표현형 역학은 다른 인구 대체 케이지 시험 프로토콜에 대해 표시됩니다. 결과는 7대에 걸쳐 DsRed 마커 표현형을 가진 애벌레의 선형 증가 비율을 보여주었습니다. 1대 1의 비드라이브 릴리스는 7세대 내에 80% 이상의 트랜스진 도입에 도달했습니다.
유전자 드라이브 프로토콜은 3~ 4세대 내에 이를 달성했습니다. 따라서 유전자 구동 시스템의 단일 방출이 유전자 도입을 위해 더 효율적일 수 있음을 검증한다. 관찰의 끝에서, 유전자의 퍼짐은 유전자 드라이브 시스템에 있는 거의 완전한 소개에 도달했습니다.
방출 비율 인구 연령 구조, 케이지 크기 등과 같은 중요한 매개 변수는 실험 및 특정 목표의 목적에 따라 달라집니다. 다산 및 fecundity와 같은 피트 니스 매개 변수를 평가 하는 실험 할 수 있습니다. 케이지 시험에서 더 많은 경험적 데이터를 사용하여 인구 역학의 수학적 모델을 매개변수화할 수 있습니다.
