Name: high-throughput screening of recalcitrance variations in lignocellulosic biomass: total lignin, lignin monomers, and enzymatic sugar release
Uploaded: 2015-09-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening of Recalcitrance Variations in Lignocellulosic Biomass: Total Lignin, Lignin Monomers, and Enzymatic Sugar Release at JoVE.com

The authors would like to thank intern Evelyn Von Neida who provided paramount insights regarding the preparation of biomass samples for both of the high-throughput pipelines discussed in this manuscript. Support for the development of this work and manuscript was provided by the BioEnergy Science Center. The BioEnergy Science Center is a U.S. Department of Energy Bioenergy Research Center supported by the Office of Biological and Environmental Research in the DOE Office of Science. The National Renewable Energy Laboratory (NREL) is a national laboratory of the US DOE Office of Energy Efficiency and Renewable Energy, operated for DOE by the Alliance for Sustainable Energy, LLC. This work was supported by the U.S. Department of Energy under Contract No. DE-AC36-08-GO28308 with the National Renewable Energy Laboratory.

포도당과 크 실리 톨 수익률의 1. 높은 처리량 결정은 효소 당화 9, 29에 따라 <ol><li> 샘플 준비 (디 - 녹말, 분쇄, 추출, 전처리) <ol><li> 와일리 밀, 이러한 입자는 20 메쉬를 통과하는 것이 (850 μm의) 스크린을 사용하여 각 시료의 바이오 매스의 적어도 300 mg의 분쇄. 정전기 방지 지퍼 가기 가방에 이동 (일반적으로 바코드) 및 바코드 데이터베이스에 기록 샘플 정보를 제공합니다. </li><li> 조심스럽게 차 가방 (잉크 또는 마커를 사용하지 않는, 연필)을 방지하기 위해 바이오 매스를 통해 끝을 접어해야되고, 티 백을 롤 번호가 약 250 mg의 또는 정전기 방지 가방에서 지상 바이오 매스의 더 추가 드 녹말 추출하는 동안 손실. </li><li> 주석 도금 구리 와이어를 사용하여 폐쇄 티백을 싸서. 각각의 바코드 샘플에 대한 티백 번호를 기록한다. </li><li> 상업 효소 (일반적으로, 0.25 % (v / v)의 글루코 아밀라제 (~ 1600 AGU / L)과에서 드 녹말 효소 솔루션을 준비1.5 % (v / v)의 알파 - 아밀라제 0.1 M 나트륨 아세테이트 (~ 2,900 KNU-S / L) (PH 5.0)). 대량의 바이오 매스 g 당 16 mL를 120 티백 샘플 당 500 mL로 준비합니다. 주 : 접지 매스로부터 전분을 제거 할 수있는 하중은 효소 로딩 및 비율의 범위로 소화 한 후 전분을위한 시험함으로써 경험적으로 결정되어야한다. </li><li> 플라스틱 용기에 일괄 접지 매스 1g 당 탈 녹말 효소 용액 16 ml를 추가. 일괄 드 녹말 프로토콜의 경우, 버퍼 효소 용액 500 ml의 120 티 백을 추가합니다. </li><li> 가능한 전분을 제거하기 위해 120 rpm으로, 24 (± 4) 시간 동안 55 ℃에서 진탕에 품어. </li><li> 디 녹말 인큐베이션 후 헹구고 30 분 동안 탈 이온수로 여러 리터 매스 소크. 캐스케이드에 뜨거운 액체 에탄올을 일으키는 원인이되는 솔루션의 수준에 갑자기 폭력적인 상승을 초래할 수있는 솔루션에 가스 거품의 범핑 (형성 될 수 있습니다 버퍼 염을 제거하려면이 과정을 두 개의 추가 번 반복추출 동안 반응 용기) 중. </li><li> 드 먹인 바이오 매스의 철저한 세척에 따라, 추출을위한 속 슬렛 컬럼에 티 백을 배치합니다. 어떤 골무는이 단계에서 필요하지 않습니다. </li><li> 95 % 에탄올을 사용하여, 속 슬렛 역류를 설정하고 24 시간 동안 샘플을 추출합니다. </li><li> 속 슬렛 반응기에서 티 백을 제거하고 평평한 쟁반에 하나의 층에 확산. </li><li> 샘플 흄 후드에서 실온에서 밤새 건조되도록. </li><li> 티 백을 풀다 원래 바코드 정전기 방지 가방에 건조 된 바이오 매스를 반환합니다. 주 : 정전기 잡화 취급 특성, 바이오 매스에 정전기를 감소시키는 개선에 효율적이다. 다른 저장 옵션을 사용하는 경우, 추가 매스 인해 저장 용기의 측면에 집착 매스에 필요할 수있다. </li><li> 바코드 호퍼에 건조 된 바이오 매스의 50 mg의 이동 (더 재료를 사용하여 정확한 분배를 위해 더 낫다). 에스정전기 방지 가방 및 수신 호퍼의 바코드는 정확한 샘플 추적을 보장 할 수 있습니다. </li><li> 고체가 랙에 샘플의 순서에주의를 기울이고, 로봇의 무게 위에로드 호퍼. 사용 된 플레이트의 수에 따라 분배 프로토콜을 모든 샘플을 포함하고 선택 충분히 반응기 판을로드. </li><li> 로봇 부식 방지 스테인레스 스틸 96 웰 플레이트에 (0.3 mg을 ±) 건조 된 시료의 5 mg의 무게. 지역화 된 변형을 최소화하기 위해 분산 판 주위의 각 샘플을 3 회 반복 달아. </li><li> 분석 성능을 추적하기 위해 잘 특성화 바이오 매스 표준 물질의 8 제어 바이오 매스 샘플을 포함합니다. 여러 접시를 들어, 여러 표준 바이오 매스 호퍼의 사용은 반복 분배주기를 통해 호퍼에 체질에 의한 입자 크기 드리프트를 최소화 할 수 있습니다. 참고 : 각 플레이트에서 3 복제, 탈 이온수와 효소로 구성된 4 공백, 8 contro 24 샘플이 있어야한다LS, 이전에있어서 표준을 사용하는 바이오 매스. 판의 4 모서리의 각의 3 코너 우물은 설탕 표준을 위해 예약되어 있습니다. </li><li> 잘못된 바이오 매스 입자 빈 설탕 표준 우물을 확인하고있는 경우 제거합니다. </li><li> 각 웰에 탈 이온수 250 μl를 추가하고, 실리콘 접착제 백업 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 테이프로 번호판을 봉인. </li><li> 1/8 &quot;납땜 인두 팁을 사용하여, 각각의 판에 대한 각각의 스팀 포트 (117 총)에 PTFE 테이프를 관통. 가이드로 밀폐 된 원자로 접시에 쌓여 빈 접시를 사용하여 PTFE를 필름의 이동을 제한 할 수 있습니다. </li><li> 단단히 상단과 스택의 바닥에 접시와 빈 판 사이 0.031 &quot;두께의 유리 강화 PTFE 가스켓 (스팀 포트 구멍 천공)으로 판을 클램프. 17.5 분, 또는 원하는 심각도에 따라 다른 온도 / 시간 조합에 대해 180 ° C로 설정 증기 반응기를 사용하여 샘​​플 전처리. </li><li> 50 ℃로 냉각 원자로 판; C 탈 이온수로 홍수. </li></ol></li><li> 효소 당화 <ol><li> 1.0 M 시트르산 나트륨, pH 5.0으로 8 % (v / v)의 효소 용액 이루어진 당화 효소 용액을 제조 하였다. 원자로 판 당 5 mL를 준비합니다. 주 : 특정 효소 스톡 용액의 활성 및 단백질 함량에 기초하여 결정될 필요 희석한다. </li><li> 플레이트가 멋진 경우, 20 분 동안 1,500 XG에서 스윙 버킷 로터에서 그들을 원심 분리기. 필름을 밀봉 제거합니다. 참고 :이 판은 무겁와 원심 분리기 사양의 호환성을 확인해야합니다. </li><li> 각 웰 (G 바이오 매스 당 70 mg의 효소)에 8 % 효소 원액의 40 μl를 추가합니다. </li><li> 새로운 PTFE 테이프로 봉인. 자기 플레이트 클램프로 밀봉 플레이트를 놓습니다. </li><li> 조심스럽게 반전에 의해 샘플 (이상 15 회)를 혼합하고, 70 시간 동안 50 ℃에서 배양. </li><li> 당화가 체결되면, 반전에 의해 믹스 1,500 X에서 번호판을 원심 분리20 분 동안 G. </li></ol></li><li> 설탕 분석 <ol><li> 6 글루코스 0.014 M 시트르산 완충액 크실 로스 결합 검정 표준 0 내지 0.750 ㎎ / ㎖ 범위 (PH 5.0)의 세트 준비 (0, 0.2, 0.3, 0.45, 0.65, 및 0.75 mg의 / ㎖ 권장) 및 0-0.600 ㎎ / ㎖ (0, 0.1, 0.2, 0.35, ml의 권장 0.45, 0.6 밀리그램 /)는 각각 포도당과 자일 로스, 대한. </li><li> 키트의 지침에 따라 포도당 산화 효소 / 퍼 옥시 다제 (GOPOD) 및 자일 로스 탈수소 효소 (XDH) 시약을 준비합니다. </li><li> 피펫을 사용하여, 반응 플레이트의 모서리 우물 (총 12 우물)에 인접한 4 코너 우물과 가장자리의 우물에서 액체의 200 μl를 제거합니다. </li><li> 피펫을 사용하여, 96- 웰 평면 바닥 폴리스티렌 희석 플레이트의 각 웰에 탈 이온수 180 μL 분주. (12) 당 표준 및 코너 우물에 물을 추가하지 마십시오 (96 채널 헤드를 사용하는 경우 그 팁을 제거). </li><li> 피펫을 사용하여, PL 포도당 분석의 각 웰에 180 ㎕를 GOPOD 시약을 분배먹었다. </li><li> 피펫을 사용하여, 글루코오스 분석 플레이트의 각 웰에 180 μL의 XDH 시약 분주. </li><li> 피펫을 이용하여 희석 플레이트 96 웰 반응 플레이트로부터 20 μL 분취 분해물 옮긴다. 우물의 상부에서 피펫은 바이오 매스 고체와 코너 우물에 잔류 액을 방지 할 수 있습니다. 적어도 10 사이클 저작하여 혼합한다. </li><li> 피펫을 사용하여 희석 플레이트의 모서리 우물, 중복, 설탕 표준의 110 μl를 전송합니다. </li><li> 피펫을 사용하여 포도당과 자일 로스 분석 플레이트에 희석 플레이트에서 20 μL 씩 전송합니다. 분쇄하여 섞는다. </li><li> 30 분 동안 실온에서 글루코오스 및 글루코오스 분석 판을 배양한다. 주의 깊게 읽기 전에 어떤 표면의 거품을 휴식. 간략 판의 표면에 전달되는 열 총은 잘 작동합니다. </li><li> 자외선 / 가시 96- 웰 플레이트 판독기를 사용하여 510 nm의 파장을 측정하고 설정 시약 블랭크에 대해 흡광도를 기록한다.이 측정은 글루코오스 농도에 비례 퀴논 이민의 형성을 모니터링한다. 글루코스 농도는 1.3.1에서 제조 검정 표준에 기초하여 검량선으로부터 계산된다. </li><li> 자외선 / 가시 96- 웰 플레이트 판독기를 사용하여 340 nm의 파장을 측정하고 설정 흡광도를 기록한다. 이 측정은 글루코오스 농도에 비례하는 NADH의 NAD + 환원을 모니터링한다. 글루코오스 농도는 1.3.1에서 제조 검정 표준에 기초 검량선으로부터 계산된다. </li></ol></li></ol> pyMBMS 28 사용하여 총 리그닌과 리그닌 단량체 내용의 2. 높은 처리량 결정 <ol><li> 샘플 준비 <ol><li> 분쇄 및 단계 1.1.1 및 1.1.6-1.1.8에서 설명한 방법을 이용하여 바이오 매스를 추출 하였다. 이 연마하고 실험적인 컨트롤을 사용하여 표준 집합의 추출이 포함되어 있습니다. 참고 : pyMBMS의 지표 성과를ements하지 입도 의존하므로 만 pyMBMS 프로토콜을 사용하는 경우, 미생물 제제 샘플 &lt;샘플 홀더에 4mm 맞게 있도록 수행되어야한다. </li><li> 약 4 mg의 작은 주걱을 사용하여 분배 자동 샘플러 위해 설계된 80 μL 스테인레스 컵에 준비된 바이오 매스 (3~5 mg을 선호). </li><li> 분석 된 시료의 적어도 10 %는 국립 표준 기술 연구소에서 사용할 수있는 등의 관리 기준 있는지 확인하십시오 (사탕 수수 사탕 수수-8491, 포플러-8492, 소나무 - 8493 또는 밀 밀짚 8494). 표준은 이미 표준 방법을 사용하여 특성화되었다 분석 될 샘플 유사한 어떤 종류 일 수있다. </li><li> 무작위로 인해 시간이 지남에 따라 가능한 분광계 드리프트에 편견을 방지하기 위해 핀셋을 사용하여 자동 샘플러 컵에 샘플을로드합니다. 주의 : 샘플의 전형적인 랜덤는 다시 랜덤이어서 일단 모든 샘플의 측정 값을 포함 할 것이다중복 측정 용 샘플의 순서. 무작위 프로그램은 온라인으로 사용할 수 있습니다. </li><li> 표준 홀 펀치를 사용하여 수동으로 바인더와, 입력 A / D 유리 섬유 시트로부터 유리 필터 디스크를 생성한다. 핀셋으로 둥근 유리 섬유 필터를 잡고 샘플 컵에 그것을 센터, 실험 기간 동안 각 컵에 재료를 한정하기 위해 3.5 mm 육각 렌치를 사용하여 샘​​플로 밀어 넣습니다. </li></ol></li><li> 경음악 프로토콜 <ol><li> 실험 샘플에 대해 존재할 수있는 화합물의 전체 범위에서 피크 강도를 갖는 공지 된 표준을 이용하여 질량 분석을 교정. 일반적으로 바이오 매스 샘플은, 루오 로트리 (PFTBA)를 사용합니다. </li><li> 가스 유량계를 사용하여 0.9 L / 분의 헬륨 캐리어 가스 유량을 설정한다. </li><li> 500 ℃의 열분해 온도 및 오토 샘플러 소프트웨어를 사용하여 350 ° C로 인터페이스 온도로 자동 샘플러로를 설정한다. 참고 : 1/8 &quot;스테인레스 스틸 가열질량 분석기로 자동 샘플러를 접속 가열 테이프에 싸서 전달 라인은 250 ℃에서의 열 제어를 이용하여 제어된다. </li><li> 질량 분석기에 대한 데이터 수집을 시작하고 배경 스펙트럼 수집을위한 충분한 데이터를 얻기 위해 최소 60 초를 기다립니다. </li><li> 2.2.2의 사양을 자동 자동 샘플러 방법을 시작합니다. 참고 : 자동 샘플러 자동 샘플러로에 개별적으로 각각의 샘플을 삭제합니다. 총 데이터 획득 시간은 약 1.5 분이며; 그러나, 일반적인 4 mg의 시료의 열분해는 30 초 후에 완료됩니다. </li><li> 0.5 초 스캔 속도로 질량 분석 소프트웨어를 사용하여 각 샘플의 기록 총 이온 함유량 (TIC). M / Z 30-450 사이의 기록 강도. 참고 : 일반적인 바이오 매스 화합물은 17 eV의에서 부드러운 이온화를 사용합니다. 장비는 1,000 M / Z 1에서 더 큰 간격을 기록 할 수 있습니다; 그러나, 스캔 속도는 컴퓨터의 CPU 파워에 의해 제한됩니다. </li><li> 엄마를 사용하여 스펙트럼에서 배경을 제거nual 소프트웨어의 기능을 향상시킬 수 있습니다. 주 : 데이터 수집의 시작에서 초기의 주사 부 (60)는 배경 평균 값을 계산하는데 사용된다. 이 평균 배경 스펙트럼은 질량 분석기 소프트웨어에서 자동 실험 샘플 스펙트럼으로부터 제거된다. </li><li> 데이터베이스 프로그램에 각 샘플에 대한 분광 데이터를 포함하는 질량 분석기 소프트웨어에 의해 생성 된 단일 열 텍스트 파일을 가져 오기 및 하나의 데이터베이스로 모든 샘플을 결합한다. 스프레드 시트에 적용 가능한 메타 데이터를 추가합니다. 통계 소프트웨어 패키지로 형식의 데이터 (스프레드 시트 / CSV 파일을) 가져 오기 및 열분해 샘플 질량의 변화를 설명 할 수있는 스펙트럼을 정상화 의미한다. </li><li> 측정에 사용되는 복제 표준 샘플의 그룹을 분석 스펙트럼 데이터를 이용하여 주성분 분석 (PCA)을 수행하는 통계 소프트웨어 패키지를 사용하여,뿐만 아니라 화학적 분류에 통합되는 피크 평가할부하의 화합물은 28 플롯. PCA는 그룹 그들의​​ 스펙트럼의 유사성을 기준으로 샘플을하고, 표준 검사로 인해 운전 중 기기의 드리프트에 실험 오차를 측정 할 수 있습니다 :합니다. </li><li> 리그닌 syringyl (S) / guaiacyl (G)의 비율을 계산하기 위해, S 피크의 면적 합계 (m / z = 154, 167, 168, 182, 194, 208, 및 210) G 피크의 합으로 나눈 124, 137, 138, 150, 164, 178에서. </li><li> 총 리그닌 함량을 계산 m / z = 120, 124, 137, 138, 150, 152, 154, 164, 167, 178, 180, 182, 194, 및 210 리그닌 피크를 합산한다. </li><li> 이러한 Klason 리그닌으로, 총 리그닌을 추정하기위한 표준 방법에 pyMBMS 측정을 스케일링하는 보정 팩터를 계산한다. pyMBMS를 사용하여 해당 표준 시료에 대한 측정 된 총 리그닌 함량에 의해 개별 표준의 Klason 리그닌 값을 나눈다. </li><li> 데이터 세트에있는 모든 종 등이 보정 계수를 적용한다. 분석 바이오 매스의 각 유형에 대해이 단계를 반복합니다. NOTE : 보정 계수가 크게 분석 바이오 매스의 S / G에 기초하여 변할 수있다. </li></ol></li></ol>

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	<li>Perlack, R. D., Stokes, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> U.S. Billion-Ton Update: Biomass Supply for a Bioenergy and Bioproducts Industry. , (2011).</li><li>Henry, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+5.">Ch. 5.</a> Plant Resources for Food, Fuel and Conservation. , 53-80 (2009).</li><li>Henry, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+plant+biomass+resources+available+for+replacement+of+fossil+oil.">Evaluation of plant biomass resources available for replacement of fossil oil.</a> Plant Biotechnol. J. 8 (3), 288-293 (2010).</li><li>Furtado, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modifying+plants+for+biofuel+and+biomaterial+production.">Modifying plants for biofuel and biomaterial production.</a> Plant Biotechnol. J. 12 (9), 1246-1258 (2014).</li><li>Sluiter, J. B., Ruiz, R. O., Scarlata, C. J., Sluiter, A. D., Templeton, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compositional+analysis+of+lignocellulosic+feedstocks.+1.+Review+and+description+of+methods.">Compositional analysis of lignocellulosic feedstocks. 1. Review and description of methods.</a> J. Agric. Food Chem. 58 (16), 9043-9053 (2010).</li><li>Lupoi, J. S., Singh, S., Simmons, B. A., Henry, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Lignocellulosic+Biomass+Using+Analytical+Spectroscopy:+an+Evolution+to+High-Throughput+Techniques.">Assessment of Lignocellulosic Biomass Using Analytical Spectroscopy: an Evolution to High-Throughput Techniques.</a> Bioenerg. Res. 7 (1), 1-23 (2014).</li><li>Lapierre, C., Monties, B., Rolando, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thioacidolysis+of+lignin:+comparison+with+acidolysis.">Thioacidolysis of lignin: comparison with acidolysis.</a> J. Wood Chem. Technol. 5 (2), 277-292 (1985).</li><li>DeMartini, J. D., Studer, M. H., Wyman, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-scale+and+automatable+high-throughput+compositional+analysis+of+biomass.">Small-scale and automatable high-throughput compositional analysis of biomass.</a> Biotechnol. Bioeng. 108 (2), 306-312 (2010).</li><li>Selig, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+determination+of+glucan+and+xylan+fractions+in+lignocelluloses.">High throughput determination of glucan and xylan fractions in lignocelluloses.</a> Biotechnol. Lett. 33 (5), 961-967 (2011).</li><li>Selig, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignocellulose+recalcitrance+screening+by+integrated+high-throughput+hydrothermal+pretreatment+and+enzymatic+saccharification.">Lignocellulose recalcitrance screening by integrated high-throughput hydrothermal pretreatment and enzymatic saccharification.</a> Ind. Biotechnol. 6 (2), 104-111 (2010).</li><li>Studer, M. H., De Martini, J. D., Brethauer, S., McKenzie, H. L., Wyman, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+high-throughput+screening+system+to+identify+cellulosic+biomass,+pretreatments,+and+enzyme+formulations+that+enhance+sugar+release.">Engineering of a high-throughput screening system to identify cellulosic biomass, pretreatments, and enzyme formulations that enhance sugar release.</a> Biotechnol. Bioeng. 105 (2), 231-238 (2009).</li><li>Gjersing, E., Happs, R. M., Sykes, R. W., Doeppke, C., Davis, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+determination+of+sugar+content+in+biomass+hydrolysates+using+nuclear+magnetic+resonance+spectroscopy.">Rapid determination of sugar content in biomass hydrolysates using nuclear magnetic resonance spectroscopy.</a> Biotechnol. Bioeng. 110 (3), 721-728 (2013).</li><li>Templeton, D. W., Sluiter, A. D., Hayward, T. K., Hames, B. R., Thomas, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+corn+stover+composition+and+sources+of+variability+via+NIRS.">Assessing corn stover composition and sources of variability via NIRS.</a> Cellulose (Dordrecht, Netherlands). 16 (4), 621-639 (2009).</li><li>Tucker, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fourier+transform+infrared+quantification+of+sugars+in+pretreated+biomass+liquors.">Fourier transform infrared quantification of sugars in pretreated biomass liquors.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. 84-86, 39-50 (2000).</li><li>Wolfrum, E. J., Sluiter, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+multivariate+calibration+models+for+corn+stover+feedstock+and+dilute-acid+pretreated+corn+stover.">Improved multivariate calibration models for corn stover feedstock and dilute-acid pretreated corn stover.</a> Cellulose (Dordrecht, Netherlands). 16 (4), 567-576 (2009).</li><li>Ona, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-destructive+determination+of+wood+constituents+by+Fourier-transform+Raman+spectroscopy.">Non-destructive determination of wood constituents by Fourier-transform Raman spectroscopy.</a> J. Wood Chem. Technol. 17 (4), 399-417 (1997).</li><li>Ona, T., Sonoda, T., Ohshima, J., Yokota, S., Yoshizawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+quantitative+method+to+assess+eucalyptus+wood+properties+for+kraft+pulp+production+by+FT-Raman+spectroscopy.">A rapid quantitative method to assess eucalyptus wood properties for kraft pulp production by FT-Raman spectroscopy.</a> J. Pulp Pap. Sci. 29 (1), 6-10 (2003).</li><li>Hames, B. R., Thomas, S. R., Sluiter, A. D., Roth, C. J., Templeton, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+biomass+analysis.+New+tools+for+compositional+analysis+of+corn+stover+feedstocks+and+process+intermediates+from+ethanol+production.">Rapid biomass analysis. New tools for compositional analysis of corn stover feedstocks and process intermediates from ethanol production.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. 105-108, 5-16 (2003).</li><li>Studer, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+content+in+natural+Populus+variants+affects+sugar+release.">Lignin content in natural Populus variants affects sugar release.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (15), 6300-6305 (2011).</li><li>Chen, M., Zhao, J., Xia, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+four+different+chemical+pretreatments+of+corn+stover+for+enhancing+enzymatic+digestibility.">Comparison of four different chemical pretreatments of corn stover for enhancing enzymatic digestibility.</a> Biomass Bioenergy. 33 (10), 1381-1385 (2009).</li><li>Davison, B. H., Drescher, S. R., Tuskan, G. A., Davis, M. F., Nghiem, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+of+S/G+ratio+and+lignin+content+in+a+Populus.+family+influences+the+release+of+xylose+by+dilute+acid+hydrolysis.">Variation of S/G ratio and lignin content in a Populus. family influences the release of xylose by dilute acid hydrolysis.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. 129-132, 427-435 (2006).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+monomer+composition+affects+Arabidopsis+cell-wall+degradability+after+liquid+hot+water+pretreatment.">Lignin monomer composition affects Arabidopsis cell-wall degradability after liquid hot water pretreatment.</a> Biotechnol. Biofuels. 3, 27-33 (2010).</li><li>Lupoi, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+prediction+of+eucalypt+lignin+syringyl/guaiacyl+content+using+multivariate+analysis:+a+comparison+between+mid-infrared,+near-infrared,+and+Raman+spectroscopies+for+model+development.">High-throughput prediction of eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using multivariate analysis: a comparison between mid-infrared, near-infrared, and Raman spectroscopies for model development.</a> Biotechnol. Biofuels. 7, 93 (2014).</li><li>Lupoi, J. S., Smith, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+woody+and+herbaceous+biomasses+lignin+composition+with+1064+nm+dispersive+multichannel+Raman+spectroscopy.">Characterization of woody and herbaceous biomasses lignin composition with 1064 nm dispersive multichannel Raman spectroscopy.</a> Appl. Spectro. 66 (8), 903-910 (2012).</li><li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+determination+of+syringyl:guaiacyl+ratios+using+FT-Raman+spectroscopy.">Rapid determination of syringyl:guaiacyl ratios using FT-Raman spectroscopy.</a> Biotechnol. Bioeng. 109 (3), 647-656 (2012).</li><li>Lupoi, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+prediction+of+Acacia+and+eucalypt+lignin+syringyl/guaiacyl+content+using+FT-Raman+spectroscopy+and+partial+least+squares+modeling.">High-throughput prediction of Acacia and eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using FT-Raman spectroscopy and partial least squares modeling.</a> Bioenerg. Res. in press, (2015).</li><li>Sykes, R., Kodrzycki, B., Tuskan, G., Foutz, K., Davis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Within+tree+variability+of+lignin+composition+in+Populus.">Within tree variability of lignin composition in Populus.</a> Wood Sci. Technol. 42 (8), 649-661 (2008).</li><li>Sykes, R., Mielenz, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+12.+High-Throughput+Screening+of+Plant+Cell-Wall+Composition+Using+Pyrolysis+Molecular+Beam+Mass+Spectroscopy.">Ch. 12. High-Throughput Screening of Plant Cell-Wall Composition Using Pyrolysis Molecular Beam Mass Spectroscopy.</a> Biofuels: Methods and Protocols. 581, 169-183 (2009).</li><li>Decker, S., Himmel, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+17.+Reducing+the+effect+of+variable+starch+levels+in+biomass+recalcitrance+screening).">Ch. 17. Reducing the effect of variable starch levels in biomass recalcitrance screening).</a> Biomass Conversion. 908, 181-195 (2012).</li><li>Evans, R. J., Milne, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+the+pyrolysis+of+biomass.">Molecular characterization of the pyrolysis of biomass.</a> Energy Fuels. 1 (2), 123-137 (1987).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

다음 높은 처리량 스크리닝 실험을 실시 할 때 정확하고 재현성있는 데이터를 획득하기위한 키 샘플 준비 단계는 다음과 같다 설탕 자료 분석 : 일반적으로, 샘플은 수십에서 한 번에 수천에 이르기까지 많은 준비되어있다. 각 주요 단계는 전형적으로 샘플 제제 사이의 편차를 최소화하기 위해 전진에 앞서 모든 샘플에 대해 수행된다. 디 녹말 원래 프?...

비 재생 연료 및 관련 제품 하락의 글로벌 공급으로, 과학자들은 식물 유래 소스 1에서 유사 연료 및 화학 물질을 만드는 데 도전하고있다. 이 작업의 핵심은 식물의 종은 바이오 연료 및 바이오 소재 2,3의 생산에 적합 할 수있는 결정하는 것입니다. 일반적으로 이러한 원료는 리그닌, 셀룰로오스 및 헤미셀룰로오스 콘텐츠에 대한 평가; 뿐만 아니라 또는 이후의 효소 당화하지 않고, 열 기계, 및 / 또는 화학적 전처리를 통해 해체 (반항)에 감수성있다. 자세한 분석이 필요 헤미셀룰로오스, 리그닌 및 분획물의 특정 조성물뿐만 아니라 최적의 효소 활성을 결정하기 위해 사용된다. 본질적으로 원하는 상품에 생화학 적 또는 열 화학적 변환을위한 이상적인 특성을 소유하지 않는 식물의 형질 변경은 냄비의 크게 확장 된 소스와 연구자를 제공하고 있습니다ential 원료 4. 작은 샘플 세트에 매우 유용하지만, 화학 플랜트의 특징을 정량화하는 표준 분석 방법은 시료 5-7 수백 또는 수천의 신속한 스크리닝 부적당하다. 본원에 기재된 방법 HTP 신속하고 효율적으로 열 화학적 및 / 또는 효소 분해에 세포벽 들음의 변화를 바이오 매스 변이체 다수을 평가하기 위해 개발되어왔다. 그것은 HTP 스크리닝 분석법은 본원에 기술 된 변환이나 수율을 최대화하도록 설계되지 않았다는 것을 이해하는 것이 중요하다. 목적은 관련 미생물 시료 극한 들음에 상대적인 차이를 결정하는 것이다. 결과적으로, 분석 단계의 많은 목적은 최대 전환율 또는 범위를 획득하는 것 &quot;전형적인&quot;바이오 매스 변환 분석, 다르다. 예를 들어, 저급 전처리 심각도 짧은 효소 가수 분해 시간은 다를 최대화하기 위해 이용된다샘플 사이에 화상 으. 대부분의 경우, 상대적으로 높은 효소 로딩 상당히 결과를 왜곡 할 수있는 효소 활성 실험 변형으로 인한 차이를 감소시키기 위해 사용된다. 식물 세포 벽과 단량체 설탕의 구성을 결정하기위한 신속한 기술은 효소 당화 적외선 등의 진동 분광학과 같은 로봇, 사용자 정의, 열화학 호환 96 웰 플레이트 및 표준 실험 방법 8-11의 수정 및 악기 프로토콜을 (포함 다음의 해방 (IR), 근적외선 (NIR), 또는 라만) 및 핵 자기 공명 (NMR) 12-17. 이 방법은 실험의 감소로 이어지는 높은 셀룰로오스 또는 낮은 리그닌 내용, 또는 가장 높은 포도당, 자일 로스, 에탄올을 산출하기 위해 예상되는 등 이러한 방법은 바이오 매스 및 소모품의 소량을 사용 축소 된 분석을 활성화와 원료를 분리하는 열쇠입니다 비용 (18) </s&gt;까지. 방법론이 접근법의 또 다른 특징은 다양한 실험 조건이 빠르게 될 수 있도록하며, 동시에 어떤 경우에는 평가. 예를 들어, 전처리 전략 또는 효소 칵테일 다른 다양한 최적 실험 파라미터 빨리 식별되고 사용될 수 있도록, 테스트 될 수있다. 옥수수 여물 9, 포플러 8, 10, 사탕 수수 사탕 수수 (8), 및 스위치 그래스 (8)과 같은 인기있는 원료는 성공적으로 HTP 방법을 사용하여 평가되었다. 총 리그닌과 리그닌 단량체 조성물은 또한 일반적으로 바이오 매스의 특성을 정량화하고 있습니다. 리그닌 함량의 감소는 다당류 (19, 20)의 효소 소화율을 증가시키는 것으로 나타났다. 리그닌 단량체 비율 (자주 syringyl / guaiacyl (S / G) 내용보고)이라는 역할은 아직 조사 중입니다 식물 세포 벽의 해체에서 재생됩니다. 일부 보고서는 지적했다 그 S / G의 감소다른 연구는 반대의 경향 19, 22을 공개하면서 비는 가수 분해 (21) 다음의 증가 포도당 수익률되었다. 리그닌과 단량체를 평가 처리량이 방법은 진동 다변량 분석 결합 분광법 (IR, NIR 및 라만 23-26), 및 열분해 분자 빔 질량 분석법 (pyMBMS) 27, 28을 포함한다. 매스 HTP 스크리닝 방법을 개발하는 경우, 여러 일체 고려 유념 할 필요가있다. 하나의 중요한 양상은 방법의 복잡성이다. 기술에 필요한 기술 수​​준은 무엇인가? 계량 화학 분석, 예를 들어, 구성, 평가 및 예측 모델을 유지하기위한 특별한 기술을 필요로한다. 표준 방법은 바람직하지 않은 준비 또는 데이터 분석 단계를 전시 또는 독성 시약을 사용한다. 모델의 개발은 새로운 데이터 모델의 견고성을 높이기 위해 시간 동안 모델에 통합 진행 과정이다. 또 다른 consideration은 비용을 절감하고 제안 된 고 처리량 방법의 실험적 분석 시간을 감소시켰다. 상기 방법은 상당히 빠르게하지만, 매우 고가 인 경우가 많은 실험실 채택위한 가능한 방법이 될 수 없다. 이 원고에 도시 된 방법은 스루풋 성능들을 증폭하도록 수정 표준화 기술의 변형이다. 이러한 프로토콜은 정량적 예측 모델의 개발을 필요없이 관심있는 미생물의 특성을 측정한다. 표준 모델을 개발하는 데 사용되는 분석과 강한 상관 관계를 보이는 동안이 예측 방법부터이 기술의 핵심 속성이다, 실제로 샘플에 대한 관심의 양을 측정하는만큼 정확하지 않습니다. 기본적으로 표준 벤치 규모 분석 방법의 버전을 축소되어 사용되는 방법 반면, 정확도와 정밀도는 속도와 처리량을 상장되어 거래되고있다. 대부분,이 결과는 작은 볼륨 피펫 및 무게에 더 높은 오류로 인해; 뿐만 아니라 증가 된 에스샘플 크기와 충분한 이질성이 감소된다. 큰 샘플 세트가 상영과 비교 될 수 있지만 별도의 캠페인 사이의 벤치 규모의 결과 비교를 할 때, 큰주의를 기울여야한다. 대부분의 시간 소모 단계 바이오 매스의 물리적 조작을 포함한다. 연삭 샘플은 샘플 사이의 밀을 청소 포함 샘플 당 몇 분을 취할 수있다. 수동, 하역, 청소 호퍼로드 및 작성, 차 가방 및 샘플 가방을 비우는 것은 매우 노동 집약적이다. 각 단계는 분 이상 걸릴 수 있지만, 샘플의 일을 수천 몇 시간 또는 며칠이 걸릴 수 있습니다. 로봇은 약 3 ~ 4 시간 또는 6 -1 플레이트 하루 8 로봇 바이오 매스와 일반적인 원자로 판을로드 할 수 있습니다 -1. 이러한 상황은 물론 시험 될 형 바이오 매스의 양으로 사용 정밀도 파라미터들에 의존한다. 물과 반응 판을 작성, 산을 희석 또는 효소 신속하게 액체 처리 로봇을 사용하여 수행됩니다. 피접시 스택 (1-20 반응 판)의 재치료는 어셈블리, 냉각시 1 ~ 3 시간 소요되며, 분해가 포함되어 있습니다. 효소 가수 분해 3 일 걸리며 당 분석 결과 분석을 완료하고 읽을 준비 시간 약 1 시간 플러스 반응기 접시 당 10 분을 필요로한다. 설정 전처리 및 분석 일의 주간 스케줄은 지속적으로 주당 800 ~ 1,000 샘플을 분석의 인간의 구성 요소에 대한 이상한 시간과 주말 노력을 최소화, 합리적인 작업 일정을 수용하고 처리 할 수​​ 있습니다. 최대 처리량이 많은 하드웨어 (로봇, 원자로 판 등), 얼마나 많은 &quot;소프트웨어&quot;(즉, 인력)이 수동 작업을 할 수 있습니다 주로하는 방법, 여러 가지 요인에 따라 달라집니다. 실제 상한은 2,500 ~ 3,000 샘플 / 주이다 그러나, 출력은 칠일 - 주 작업과 다수의 학생 인턴 및 기술자를 필요로한다. 비교하여, HPLC에 의해 3,000 샘플 SAM의 약 12​​5일을 필요PLE 분석 플러스 수동으로 분석하기 전에 원자로 및 필터링 샘플로 샘플 무게의 추가 노동.

<table><tbody><tr><td>Biomek FX Automated Workstation</td><td>Beckman Coulter</td><td>Biomek FX</td><td>Automated Liquid Handler</td></tr><tr><td>Wiley mill</td><td>Thomas Scientific</td><td>3375E15 (Model 4), or 3383L20 (Mini-mill)</td><td></td></tr><tr><td>anti-static bags</td><td>Minigrip*</td><td>MGST4P02503</td><td>2.5x3&quot;, multiple suppliers available</td></tr><tr><td>tin-coated copper wire</td><td>McMaster-Carr</td><td>8871K84</td><td>0.016&quot; diameter, bend-and-stay wire</td></tr><tr><td>tea-bags</td><td>Herbco</td><td>press n&#039; brew teabags</td><td>3.5x5 inches</td></tr><tr><td>gluco-amylase</td><td>Novozymes</td><td>Spirizyme Fuel&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>alpha-amylase</td><td>Novozymes</td><td>Liquozyme SC DS</td><td></td></tr><tr><td>sodium acetate trihydrate</td><td>any chemical supplier</td><td></td><td>reagent grade</td></tr><tr><td>acetic acid</td><td>any chemical supplier</td><td></td><td>reagent grade</td></tr><tr><td>190 proof (95%) ethanol</td><td>any chemical supplier</td><td></td><td>reagent grade</td></tr><tr><td>hoppers</td><td>Freeslate</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well C-276 Hastelloy plates</td><td>Aspen Machining (Lafayette, Colorado)</td><td>N/A (custom built)</td><td></td></tr><tr><td>1/8&amp;rdquo; soldering iron tip</td><td>Sears</td><td></td><td></td></tr><tr><td>silicone-adhesive backed Teflon tape</td><td>3M</td><td>5180</td><td>3&quot; wide (36-yard rolls)</td></tr><tr><td>enzyme solution</td><td>Novozymes</td><td></td><td>Cellic CTec2</td></tr><tr><td>citric acid monohydrate</td><td>any chemical supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>trisodium citrate dihydrate</td><td>any chemical supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>disposable, polystyrene 96-well plates</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655101</td><td>or equivalent; multiple suppliers available</td></tr><tr><td>glucose oxidase/peroxidase&amp;nbsp;</td><td>Megazyme</td><td>K-Gluc</td><td>Megazyme D-glucose assay kit</td></tr><tr><td>xylose dehydrogenase</td><td>Megazyme</td><td>K-Xylose</td><td>Megazyme D-xylose assay kit</td></tr><tr><td>glucose standard solution</td><td>Megazyme</td><td>K-Gluc</td><td>Megazyme D-glucose assay kit</td></tr><tr><td>xylose standard solution</td><td>Megazyme</td><td>K-Xylose</td><td>Megazyme D-xylose assay kit</td></tr><tr><td>stainless steel sample cups</td><td>Frontier Laboratories</td><td>PY1-EC80F</td><td></td></tr><tr><td>glass fiber sheets</td><td>Pall</td><td>66227</td><td>8x10&quot; sheets; circles punched with standard hole punch</td></tr><tr><td>Sugarcane Bagasse Whole Biomass Feedstock</td><td>NIST</td><td>8491</td><td></td></tr><tr><td>Eastern Cottonwood (poplar) Whole Biomass Feedstock</td><td>NIST</td><td>8492</td><td></td></tr><tr><td>Monterey Pine Whole Biomass Feedstock</td><td>NIST</td><td>8493</td><td></td></tr><tr><td>Wheat Straw Whole Biomass Feedstock</td><td>NIST</td><td>8494</td><td></td></tr></tbody></table>

high-throughput screening of recalcitrance variations in lignocellulosic biomass: total lignin, lignin monomers, and enzymatic sugar release

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the use of non-renewable energy sources. In order to identify which plants, out of a diverse pool, have the desired chemical traits for downstream applications, attributes, such as cellulose and lignin content, or monomeric sugar release following an enzymatic saccharification, must be compared. The experimental and data analysis protocols of the standard methods of analysis can be time-consuming, thereby limiting the number of samples that can be measured. High-throughput (HTP) methods alleviate the shortcomings of the standard methods, and permit the rapid screening of available samples to isolate those possessing the desired traits. This study illustrates the HTP sugar release and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry pipelines employed at the National Renewable Energy Lab. These pipelines have enabled the efficient assessment of thousands of plants while decreasing experimental time and costs through reductions in labor and consumables.

열 화학적 전처리 및 후속 당화 효소의 결합 된 효과는 분석의 단부에 해제 포도당과 자일 로스의 질량의 함수로서 측정된다. 결과는 바이오 매스의 g 당 발표 포도당과 자일 로스의 밀리그램의 관점에서보고됩니다. 이것은 일반적으로 출발 물질의 조성 분석에 기초하여 이론적 퍼센트 수율로보고 벤치 스케일 분석에서보고 된 데이터에 대조적이다. 아직 주 당 샘플 수천 성분 분석을 수행하는 ?...

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High-throughput Screening of Recalcitrance Variations in Lignocellulosic Biomass: Total Lignin, Lignin Monomers, and Enzymatic Sugar Release

Plant cell wall structure and chemistry traits are evaluated to identify ideal feedstocks for biofuels and bio-materials. Standard methods have limitations when applied to large data sets. These high-throughput pretreatment, enzyme saccharification, and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry methods compare large numbers of biomass samples with decreased experimental time and cost.

총 리그닌, 리그닌 단량체, 및 효소 설탕 자료 : 리그 노 셀룰로오스 바이오 매스의 반항의 변화의 높은 처리량 검열

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the ...

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Research

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Environment

9.9K 조회수.  National Renewable Energy Laboratory. Plant cell wall structure and chemistry traits are evaluated to identify ideal feedstocks for biofuels and bio-materials. Standard methods have limitations when applied to large data sets. These high-throughput pretreatment, enzyme saccharification, and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry methods compare large numbers of biomass samples with decreased experimental time and cost.

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High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper and food industries. A deeper understanding of CAZymes is important from both fundamental biology and industrial standpoints. Vast numbers of CAZymes exist in nature (especially in microorganisms) and hundreds of thousands have been cataloged and described in the carbohydrate active enzyme database (CAZy). However, the rate of discovery of putative enzymes has outstripped our ability to biochemically characterize their activities. One reason for this is that advances in genome and transcriptome sequencing, together with associated bioinformatics tools allow for rapid identification of candidate CAZymes, but technology for determining an enzyme's biochemical characteristics has advanced more slowly. To address this technology gap, a novel high-throughput assay kit based on insoluble chromogenic substrates is described here. Two distinct substrate types were produced: Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates (made from purified polysaccharides and proteins) and Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates (made from complex biomass materials). Both CPH and ICB substrates are provided in a 96-well high-throughput assay system. The CPH substrates can be made in four different colors, enabling them to be mixed together and thus increasing assay throughput. The protocol describes a 96-well plate assay and illustrates how this assay can be used for screening the activities of enzymes, enzyme cocktails, and broths.

A high-throughput assay for enzyme screening is described. This multiplexed ready-to-use assay kit comprises of pre-chosen Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates and complex Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates. Target enzymes are polysaccharide degrading endo-enzymes and proteases.

소설 불용성 발색 기질 분석 키트를 사용하여 탄수화물 분해 효소의 높은 처리량 검열

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

연구

생화학

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

To facilitate the use of lignocellulosic biomass as an alternative bioenergy resource, during biological conversion processes, a pretreatment step is needed to open up the structure of the plant cell wall, increasing the accessibility of the cell wall carbohydrates. Lignin, a polyphenolic material present in many cell wall types, is known to be a significant hindrance to enzyme access. Reduction in lignin content to a level that does not interfere with the structural integrity and defense system of the plant might be a valuable step to reduce the costs of bioethanol production. In this study, we have genetically down-regulated one of the lignin biosynthesis-related genes, cinnamoyl-CoA reductase (ZmCCR1) via a double stranded RNA interference technique. The ZmCCR1_RNAi construct was integrated into the maize genome using the particle bombardment method. Transgenic maize plants grew normally as compared to the wild-type control plants without interfering with biomass growth or defense mechanisms, with the exception of displaying of brown-coloration in transgenic plants leaf mid-ribs, husks, and stems. The microscopic analyses, in conjunction with the histological assay, revealed that the leaf sclerenchyma fibers were thinned but the structure and size of other major vascular system components was not altered. The lignin content in the transgenic maize was reduced by 7-8.7%, the crystalline cellulose content was increased in response to lignin reduction, and hemicelluloses remained unchanged. The analyses may indicate that carbon flow might have been shifted from lignin biosynthesis to cellulose biosynthesis. This article delineates the procedures used to down-regulate the lignin content in maize via RNAi technology, and the cell wall compositional analyses used to verify the effect of the modifications on the cell wall structure.

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

A double stranded RNA interference (dsRNAi) technique is employed to down-regulate the maize cinnamoyl coenzyme A reductase (ZmCCR1) gene to lower plant lignin content. Lignin down-regulation from the cell wall is visualized by microscopic analyses and quantified by the Klason method. Compositional changes in hemicellulose and crystalline cellulose are analyzed.

의 리그닌 아래로 규제<em&gt; ZEA 메이스</em&gt; dsRNAi 및 Klason 리그닌 분석을 통해

To facilitate the use of lignocellulosic biomass as an alternative bioenergy resource, during biological conversion processes, a pretreatment step is ...

생체공학

Extraction of Lignin with High &#946;-O-4 Content by Mild Ethanol Extraction and Its Effect on the Depolymerization Yield

Lignin valorization strategies are a key factor for achieving more economically competitive biorefineries based on lignocellulosic biomass. Most of the emerging elegant procedures to obtain specific aromatic products rely on the lignin substrate having a high content of the readily cleavable &#946;-O-4 linkage as present in the native lignin structure. This provides a miss-match with typical technical lignins that are highly degraded and therefore are low in &#946;-O-4 linkages. Therefore, the extraction yields, and the quality of the obtained lignin are of utmost importance to access new lignin valorization pathways. In this manuscript, a simple protocol is presented to obtain lignins with high &#946;-O-4 content by relatively mild ethanol extraction that can be applied to different lignocellulose sources. Furthermore, analysis procedures to determine the quality of the lignins are presented together with a depolymerization protocol that yields specific phenolic 2-arylmethyl-1,3-dioxolanes, which can be used to evaluate the obtained lignins. The presented results demonstrate the link between lignin quality and potential for the lignins to be depolymerized into specific monomeric aromatic chemicals. Overall, the extraction and depolymerization demonstrates a trade-off between the lignin extraction yield and the retention of the native aryl-ether structure and thus the potential of the lignin to be used as the substrate for the production of chemicals for higher-value applications.

Here, we present a protocol to perform ethanol extraction of lignin from several biomass sources. The effect of the extraction conditions on the lignin yield and &#946;-O-4 content are presented. Selective depolymerization is performed on the obtained lignins to obtain high aromatic monomer products.

온화한 에탄올 추출 및 Depolymerization 수율에 미치는 영향에 의해 높은 β-O-4 콘텐츠 리그 닌의 추출

Lignin valorization strategies are a key factor for achieving more economically competitive biorefineries based on lignocellulosic biomass. Most of the ...

화학

Techniques for the Evolution of Robust Pentose-fermenting Yeast for Bioconversion of Lignocellulose to Ethanol

Lignocellulosic biomass is an abundant, renewable feedstock useful for production of fuel-grade ethanol and other bio-products. Pretreatment and enzyme saccharification processes release sugars that can be fermented by yeast. Traditional industrial yeasts do not ferment xylose (comprising up to 40% of plant sugars) and are not able to function in concentrated hydrolyzates. Concentrated hydrolyzates are needed to support economical ethanol recovery, but they are laden with toxic byproducts generated during pretreatment. While detoxification methods can render hydrolyzates fermentable, they are costly and generate waste disposal liabilities. Here, adaptive evolution and isolation techniques are described and demonstrated to yield derivatives of the native Scheffersomyces stipitis strain NRRL Y-7124 that are able to efficiently convert hydrolyzates to economically recoverable ethanol despite adverse culture conditions. Improved individuals are enriched in an evolving population using multiple selection pressures reliant on natural genetic diversity of the S. stipitis population and mutations induced by exposures to two diverse hydrolyzates, ethanol or UV radiation. Final evolution cultures are dilution plated to harvest predominant isolates, while intermediate populations, frozen in glycerol at various stages of evolution, are enriched on selective media using appropriate stress gradients to recover most promising isolates through dilution plating. Isolates are screened on various hydrolyzate types and ranked using a novel procedure involving dimensionless relative performance index (RPI) transformations of the xylose uptake rate and ethanol yield data. Using the RPI statistical parameter, an overall relative performance average is calculated to rank isolates based on multiple factors, including culture conditions (varying in nutrients and inhibitors) and kinetic characteristics. Through application of these techniques, derivatives of the parent strain had the following improved features in enzyme saccharified hydrolyzates at pH 5-6: reduced initial lag phase preceding growth, reduced diauxic lag during glucose-xylose transition, significantly enhanced fermentation rates, improved ethanol tolerance and accumulation to 40 g/L.

Adaptive evolution and isolation techniques are described and demonstrated to yield derivatives of Scheffersomyces stipitis strain NRRL Y-7124 that are able to rapidly consume hexose and pentose mixed sugars in enzyme saccharified undetoxified hydrolyzates and to accumulate over 40 g/L ethanol.

에탄올에 리그 노 셀룰로즈의 생물에 대한 강력한 펜 토스 발효 효모의 진화를위한 기술

Lignocellulosic biomass is an abundant, renewable feedstock useful for production of fuel-grade ethanol and other bio-products. Pretreatment and enzyme ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part I: Lignin

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st century. This has rekindled interest in the use of plant products as industrial raw materials for the production of liquid fuels for transportation1 and other products such as biocomposite materials7. Plant biomass remains one of the greatest untapped reserves on the planet4. It is mostly comprised of cell walls that are composed of energy rich polymers including cellulose, various hemicelluloses (matrix polysaccharides, and the polyphenol lignin6 and thus sometimes termed lignocellulosics. However, plant cell walls have evolved to be recalcitrant to degradation as walls provide tensile strength to cells and the entire plants, ward off pathogens, and allow water to be transported throughout the plant; in the case of trees up to more the 100 m above ground level. Due to the various functions of walls, there is an immense structural diversity within the walls of different plant species and cell types within a single plant4. Hence, depending of what crop species, crop variety, or plant tissue is used for a biorefinery, the processing steps for depolymerization by chemical/enzymatic processes and subsequent fermentation of the various sugars to liquid biofuels need to be adjusted and optimized. This fact underpins the need for a thorough characterization of plant biomass feedstocks. Here we describe a comprehensive analytical methodology that enables the determination of the composition of lignocellulosics and is amenable to a medium to high-throughput analysis. In this first part we focus on the analysis of the polyphenol lignin (Figure 1). The method starts of with preparing destarched cell wall material. The resulting lignocellulosics are then split up to determine its lignin content by acetylbromide solubilization3, and its lignin composition in terms of its syringyl, guaiacyl- and p-hydroxyphenyl units5. The protocol for analyzing the carbohydrates in lignocellulosic biomass including cellulose content and matrix polysaccharide composition is discussed in Part II2.

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part I: Lignin

Plant biomass is a major carbon-neutral renewable resource that could be used for the production of biofuels. Plant biomass consists mainly of cell walls, a structurally complex composite material termed lignocellulosics. Here we describe a protocol for a comprehensive analysis of the content and composition of the polyphenolic lignin.

식물 세포 벽의 종합 작곡 분석 (리그노셀룰로오스성 바이오 매스) 부 I : 리그닌

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st ...

생물학

Fractionation of Lignocellulosic Biomass using the OrganoCat Process

The shift from a petroleum-based to a more sustainable and bio-based economy requires the development of new refinery concepts to maintain the supply of raw materials and energy. For these novel and sustainable biorefinery concepts, it is important to use catalysts and solvents that are aligned with the principles of Green Chemistry. Therefore, the implementation of biogenic alternatives can be a promising solution. The lignocellulose pretreatment and fractionation process presented herein-OrganoCat-is an integrated fractionation of lignocellulose into its main components using biogenic acids such as 2,5-furandicarboxylic acid as catalyst. Hemicelluloses and other non-cellulosic polysaccharides are selectively depolymerized by the diluted acid and dissolved, while the crystalline cellulose remains in the solid pulp. In the presence of a second organic phase consisting of biogenic 2-methyltetrahydrofuran, disentangled lignin is extracted in situ. The process allows for the efficient fractionation of the three main components-lignin, cellulose, and non-cellulosic sugars. This helps to focus on the quality of the lignin, the improvement of enzymatic hydrolysis of the cellulose-enriched pulp, and the mild non-cellulosic sugar extraction with low degradation.

OrganoCat is a method for the pretreatment and fractionation of lignocellulose under mild conditions into lignin, fermentable sugars, and cellulose pulp. In a biogenic, biphasic solvent system of water and 2-methyltetrahydrofuran with 2,5-furancarboxylic acid as catalyst, the OrganoCat products are separated in situ for straightforward product recovery.

오가노캣 공정을 이용한 리뇨셀룰로오스 바이오매스의 분획

The shift from a petroleum-based to a more sustainable and bio-based economy requires the development of new refinery concepts to maintain the supply of ...

Ultrafast Lignin Extraction from Unusual Mediterranean Lignocellulosic Residues

Pretreatment is still the most expensive step in lignocellulosic biorefinery processes. It must be made cost-effective by minimizing chemical requirements as well as power and heat consumption and by using environment-friendly solvents. Deep eutectic solvents (DESs) are key, green, and low-cost solvents in sustainable biorefineries. They are transparent mixtures characterized by low freezing points resulting from at least one hydrogen bond donor and one hydrogen bond acceptor. Although DESs are promising solvents, it is necessary to combine them with an economic heating technology, such as microwave irradiation, for competitive profitability. Microwave irradiation is a promising strategy to shorten the heating time and boost fractionation because it can rapidly attain the appropriate temperature. The aim of this study was to develop a one-step, rapid method for biomass fractionation and lignin extraction using a low-cost and biodegradable solvent. 
In this study, a microwave-assisted DES pretreatment was conducted for 60 s at 800 W, using three kinds of DESs. The DES mixtures were facilely prepared from choline chloride (ChCl) and three hydrogen-bond donors (HBDs): a monocarboxylic acid (lactic acid), a dicarboxylic acid (oxalic acid), and urea. This pretreatment was used for biomass fractionation and lignin recovery from marine residues (Posidonia leaves and aegagropile), agri-food byproducts (almond shells and olive pomace), forest residues (pinecones), and perennial lignocellulosic grasses (Stipa tenacissima). Further analyses were conducted to determine the yield, purity, and molecular weight distribution of the recovered lignin. In addition, the effect of DESs on the chemical functional groups in the extracted lignin was determined by Fourier-transform infrared (FTIR) spectroscopy. The results indicate that the ChCl-oxalic acid mixture affords the highest lignin purity and the lowest yield. The present study demonstrates that the DES-microwave process is an ultrafast, efficient, and cost-competitive technology for lignocellulosic biomass fractionation.

Deep eutectic solvent-based, microwave-assisted pretreatment is a green, fast, and efficient process for lignocellulosic fractionation and high-purity lignin recovery.

특이한 지중해 리그놀룰로오스 잔류물에서 초고속 리닌 추출

Pretreatment is still the most expensive step in lignocellulosic biorefinery processes. It must be made cost-effective by minimizing chemical requirements ...

Label-free in situ Imaging of Lignification in Plant Cell Walls

Meeting growing energy demands safely and efficiently is a pressing global challenge. Therefore, research into biofuels production that seeks to find cost-effective and sustainable solutions has become a topical and critical task. Lignocellulosic biomass is poised to become the primary source of biomass for the conversion to liquid biofuels1-6. However, the recalcitrance of these plant cell wall materials to cost-effective and efficient degradation presents a major impediment for their use in the production of biofuels and chemicals4. In particular, lignin, a complex and irregular poly-phenylpropanoid heteropolymer, becomes problematic to the postharvest deconstruction of lignocellulosic biomass. For example in biomass conversion for biofuels, it inhibits saccharification in processes aimed at producing simple sugars for fermentation7. The effective use of plant biomass for industrial purposes is in fact largely dependent on the extent to which the plant cell wall is lignified. The removal of lignin is a costly and limiting factor8 and lignin has therefore become a key plant breeding and genetic engineering target in order to improve cell wall conversion.
Analytical tools that permit the accurate rapid characterization of lignification of plant cell walls become increasingly important for evaluating a large number of breeding populations. Extractive procedures for the isolation of native components such as lignin are inevitably destructive, bringing about significant chemical and structural modifications9-11. Analytical chemical in situ methods are thus invaluable tools for the compositional and structural characterization of lignocellulosic materials. Raman microscopy is a technique that relies on inelastic or Raman scattering of monochromatic light, like that from a laser, where the shift in energy of the laser photons is related to molecular vibrations and presents an intrinsic label-free molecular "fingerprint" of the sample. Raman microscopy can afford non-destructive and comparatively inexpensive measurements with minimal sample preparation, giving insights into chemical composition and molecular structure in a close to native state. Chemical imaging by confocal Raman microscopy has been previously used for the visualization of the spatial distribution of cellulose and lignin in wood cell walls12-14. Based on these earlier results, we have recently adopted this method to compare lignification in wild type and lignin-deficient transgenic Populus trichocarpa (black cottonwood) stem wood15. Analyzing the lignin Raman bands16,17 in the spectral region between 1,600 and 1,700 cm-1, lignin signal intensity and localization were mapped in situ. Our approach visualized differences in lignin content, localization, and chemical composition. Most recently, we demonstrated Raman imaging of cell wall polymers in Arabidopsis thaliana with lateral resolution that is sub-&mu;m18. Here, this method is presented affording visualization of lignin in plant cell walls and comparison of lignification in different tissues, samples or species without staining or labeling of the tissues.

Label-free in situ Imaging of Lignification in Plant Cell Walls

A method based on confocal Raman microscopy is presented that affords label-free visualization of lignin in plant cell walls and comparison of lignification in different tissues, samples or species.

라벨 - 무료 현장에서</em식물 세포 벽 Lignification의> 이미징

Meeting growing energy demands safely and efficiently is a pressing global challenge. Therefore, research into biofuels production that seeks to find ...

A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries

Cellulose, the most abundant source of organic carbon on the planet, has wide-ranging industrial applications with increasing emphasis on biofuel production 1. Chemical methods to modify or degrade cellulose typically require strong acids and high temperatures. As such, enzymatic methods have become prominent in the bioconversion process. While the identification of active cellulases from bacterial and fungal isolates has been somewhat effective, the vast majority of microbes in nature resist laboratory cultivation. Environmental genomic, also known as metagenomic, screening approaches have great promise in bridging the cultivation gap in the search for novel bioconversion enzymes. Metagenomic screening approaches have successfully recovered novel cellulases from environments as varied as soils 2, buffalo rumen 3 and the termite hind-gut 4 using carboxymethylcellulose (CMC) agar plates stained with congo red dye (based on the method of Teather and Wood 5). However, the CMC method is limited in throughput, is not quantitative and manifests a low signal to noise ratio 6. Other methods have been reported 7,8 but each use an agar plate-based assay, which is undesirable for high-throughput screening of large insert genomic libraries. Here we present a solution-based screen for cellulase activity using a chromogenic dinitrophenol (DNP)-cellobioside substrate 9. Our library was cloned into the pCC1 copy control fosmid to increase assay sensitivity through copy number induction 10. The method uses one-pot chemistry in 384-well microplates with the final readout provided as an absorbance measurement. This readout is quantitative, sensitive and automated with a throughput of up to 100X 384-well plates per day using a liquid handler and plate reader with attached stacking system.

This protocol describes a high throughput screen for cellulolytic activity from a metagenomic library expressed in Escherichia coli. The screen is solution based and highly automated, and uses one-pot chemistry in 384 well microplates with the final readout as an absorbance measurement.

Metagenomic 도서관에서 Cellulase 활동 Biomining에 대해 높은 처리량 화면

Cellulose, the most abundant source of organic carbon on the planet, has wide-ranging industrial applications with increasing emphasis on biofuel ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

에서 곰팡이 Endoglucanase 활동의 높은 처리량 검사 대장균</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

총 리그닌, 리그닌 단량체, 및 효소 설탕 자료 : 리그 노 셀룰로오스 바이오 매스의 반항의 변화의 높은 처리량 검열

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