저자는 T - 미로와 행동 공간을 제공하는 찰스 박사 Luetje 감사하고 싶습니다. 이 작품은 미국 심장 협회 (YA)를, 신경계 질환을위한 국립 연구소 및 행정 권한 부여 R01NS64269 (RGZ)을, 그리고 퓨 자선 트러스트 (RGZ)를 지원합니다.

1. 소개 이 비디오에서는, 우리는 운동과 neurodegenerative 장애에 손상 아르 학습과 기억 기능의 측정을 설명하기 Drosophila를 사용하여 두 행동 assays을 설명합니다. 첫째, 우리는 운전하는 행위는 부정 geotaxis 분석을 사용하여 측정하는 방법을 보여줍니다. 둘째, 우리는 aversive 쓴맛과 조명을 연결하기 위해 훈련하고 메모리 기능을 평가 6 시간 후에 테스트 긍정적 - phototactic 파리를 사용하여 학습과 기억 능력을 평가할 것입니다. 마지막으로, 우리는 이러한 행동 assays의 의미와 한계를 설명합니다. 2. 장비 및 시약 <ol><li> 작업 플라이 <ul><li> 스테레오 스코프 (자이스 혈구) </li><li> 파리 푹신한 작은 페인트 붓 </li><li> Drosophila 이산화탄소 (CO 2) 마취 장치 (Geneseesci, 병원) </li></ul></li><li> 부정 Geotaxis 분석 <ul><li> 28.5 X 95mm의 폴리스티렌 비알 (국회 의사당 여사님, 주식 회사) </li><li> 미니 알람 타이머 / 스톱워치 (VWR 인터내셔널) </li><li> 샤피의 펜 </li><li> 접착제 테이프 </li></ul></li><li> Aversive Phototaxis 억제 분석 <ul><li> 퀴나인 염산염 (시그마 알드리치, CAS 번호 : 6119-47-7) </li><li> 증류수 </li><li> 무게로 정확한 희석 디지털 측정 스케일 </li><li> 빠른 연결 해제 커넥터, 고밀도 폴리에틸렌 (NALGENE VWR 카탈로그 번호 62868-021) </li><li> 광원에 대​​한 빠른 연결 끊기 커넥터 어댑터에 맞게 폐쇄 월말부터 2 ML 마크에서 컷 15 ML의 원심 분리기 튜브 (VWR 인터내셔널), </li><li> 챔버 라이닝 여과지에 말라리아 솔루션을 로드할 수 단일 채널 200 μL pipetter </li><li> T - 미로 (간단한 행동 시스템, 그림 1) </li><li> 알루미늄 호일 </li><li> 광원 (자이스 혈구) </li><li> 빨간 불빛과 함께 램프. </li><li> 필터 페이퍼 </li><li> 미니 알람 타이머 / 스톱워치 (VWR 인터내셔널) </li></ul></li></ol> 3. 파리 준비 <ul><li> 파리가 25 표준 cornmeal - 한천 - 당밀 - 효모 매체에 유지 관리됩니다 ° C 12 시간 라이트 / 어두운주기. </li><li> 버진 파리는 eclosion 당일 이산화탄소 마취 격리됩니다. 노화 연구, 파리는 유리병 당 스무 그룹으로 관리하고 매 3 일 신선한 유리병로 전학 왔어. 유전 배경에서 발생하는 차이를 최소화하기 위해, 노화 연구에 대해 동일한 부모의 십자가에서 형제 파리를 사용하는 것이 중요합니다. </li><li> assays 모두, 파리는 유리병 지당 10 파리의 그룹 sexed 유지하고 있습니다. 행동에 성별 차이가 상당한이며 데이터가 6을 해석하고 재현하기 어려울지도로 연구에 남성과 여성의 파리 혼합하지 않는 것이 좋습니다. </li><li> 부정 geotaxis 분석을 위해, 파리는 유리병 지당 10의 그룹으로 분류되고 마취 후 한 시간을 테스트했습니다. 이 전위의 활동에 영향을 미칠 수도로 난다는 마취에서 완전히 회복하는 것이 중요합니다. </li><li> APS의 분석은 각 그룹의 파리는 분석이 수행되기 전에 6 시간 동안 필터 종이 moistened 물로 빈 폴리스티렌 약병에 배치됩니다. 이것은 파리가 분석되기 전에 굶어 죽고 있으며 aversive의 맛을 더 통찰력 수 있도록합니다. 분석이 수행되기 전에, 열 그룹에서 각 비행기는 다음 탈출을 피하기 위해, 느슨하게 났고요 빈 15mL 원심 튜브에 배치됩니다. </li></ul> 4. 부정 Geotaxis 분석 <ul><li> Geotaxis는 일반적으로 동일한 유전자형이나 치료 (각 유전자형 / 치료를 위해 총 100-200 파리) 7 십 개인의 10-20 그룹에 대한 측정됩니다. 별도의 약병에 각 그룹 CO 2 마취 장치 및 장소에 만불 여성이나 남성 파리 정렬 그룹. 마취에서 회복하기 위해 파리에 대해 최소한 하나 시간을 허용합니다. </li><li> 이 빈 폴리스티렌 튜브가 수직으로 서로를 마주 테이프에 합류하는 등 각 그룹에 대한 등반 장치를 준비합니다. 튜브의 구멍이 완벽하게 파리에 대한도 등반 표면을 제공하기 위해 서로 정렬되어 있는지 확인하는 것이 중요합니다. </li><li> 낮은 유리병은 바닥 표면 위에 8cm의 수직 거리를 측정하고 유리병의 전체 둘레 주위에 원을 그리는 각 유리병을 표시합니다. </li><li> 신중하게 모든 비행의 탈출을 방지 낮은 유리병에 열 파리의 그룹을 전송합니다. 즉시 안전하게 접촉 구멍 상단 유리병과 테이프로 낮은 병을 커버. 파리 분석을 실시하기 전에 1 분 새로운 설정으로 순응 수 있습니다. </li><li> 부드럽게 유리병의 바닥에 파리를 누르고 탭시 10 초 8 cm 표시 위에 올라갈 수있는 파리의 수를 측정합니다. </li><li> 각 시험 사이 일분 나머지 기간 동안 수 있도록, 같은 그룹에 열번이 분석을 반복합니다. </li><li> 로 8 cm 마크를 통과 그룹당 파리의 개수를 기록총 파리 비율입니다. </li></ul> 5. Aversive Phototaxis 억제 분석 (APS 어세이) 원래 르 부르그 및 Buecher (2002 년) 4 적응이 분석은 aversive의 자극 (이 경우, 말라리아의 쓴맛)와 빛을 연결할 그들을 훈련하기 위해 파리에있는 긍정적인 phototactic 동작을 악용. 교육 / 에어컨 위상 후, 야생 입력 파리 aversive 맛이있는 조명 영역을 연결하고 그것을 피할 수있게 될 것입니다. 손상된 학습 용량 파리는이 협회를 만들기 위해 실패합니다. 또한, APS 분석도의 단기 기억 기능을 측정하는 데 사용할 수있는 것은 배운 작업을 기억 능력을 테스트하는 동일한 테스트 6시간 포스트 컨디셔닝에 이미 훈련 파리를 쓰는하여 5 날아. <ol><li> 퀴나인 솔루션을 준비 <ul><li> 0.1M 주식 솔루션 (50mL 증류수에 1.98g)하기 위해 증류수에 말라리아 염산염을 디졸브. 주식 솔루션은 작은 aliquots에 년 -20 ° C에서 최대 유지 수 있습니다 </li><li> 증류수의 재고 솔루션을 diluting 약 1 μm의의 작업 솔루션을 준비합니다. </li></ul></li><li> T - 미로를 준비 <ul><li> T - 미로에서 출구와 두 개의 독립적인 회의소, &quot;어둠&quot;의 챔버와 &quot;조명&quot;챔버 (그림 1)와 센터 컬럼으로 구성되어 있습니다. </li><li> 상공 회의소 준​​비는 두 15mL 플라스틱 원심 분리기 튜브를 타고 아래에서 2 ML 표시에 절단 설명서 끝부분을 폐쇄 보았다. 각 끝에있는 커넥터 어댑터를 맞춤하고, parafilm와 연결을 밀봉. 튜브의 끝에 어댑터 구스넥 광원에 대​​한 입력 슬롯 역할을합니다. 광원과 하나가 튜브를 연결하고 튜브는 &quot;조명&quot;챔버 것입니다. &quot;어둠&quot;의 챔버 역할을 다른 튜브 알루미늄 호일로 감싸주세요. </li><li> 증류수 또는 조명 챔버의 종이와 장소를 필터링하는 말라리아 솔루션 중 하나 180uL을 추가합니다. </li><li> 중간 폐쇄 (그림 1)에서 트랩 도어와 센터 컬럼의 각 측면에 조명과 어두운 회의소 바람을 피우고하여 T - 미로를 조립. </li><li> 조명 챔버에 광원을 넣습니다. </li></ul></li><li> 교육 aversive 자극과 phototaxis을 억제하기 위해 날아 <ul><li> 돌려서는 어둠 T - 미로에서 실이 챔버에 하나의 비행기를 전송하고 즉시 미로로 다시 어둠의 튜브를 나사. </li><li> 방에 불을 끄고 적색 램프를 켭니다. </li><li> 파리가 30 초 동안 어둠 챔버에 순응 천천히 조명 챔버 조명 광원을 설정하도록 허용합니다. 천천히 두 방을 분리 트랩도어를 엽니다. </li><li> 파리가 10 초 이내에 조명 챔버에 산책하면, 그것은 긍정적 phototactic 간주하고 분석을 위해 훈련 준비입니다. phototaxis에 실패 시각 시스템에 문제를 지적하고 부정 phototaxis은 분석에서 제외해야 함께 날아. </li><li> Aversive Phototaxis 억제 (APS) 교육 들어, 어두운 챔버로 긍정적인 phototaxis을 보여준 플라이를 누르고 트랩 도어를 닫고 불을 끕니다. acclimatizing 30 초 수 있습니다. 이 시간 동안 조명 챔버에 말라리아 솔루션 필터 종이를 넣어. 천천히 트랩 문을 열고 불을 켭니다. 말라리아 코팅 조명 챔버에 파리 산책을 허용합니다. 일분 후, 어둠의 챔버에 다시 파리를 탭이 9 번 이상 반복합니다. (일반적으로 야생 유형 3-5 훈련 재판 후 조명 챔버를 피하기 날아.) </li><li> 즉시 훈련 후 다섯 테스트 실험이 실시됩니다. 각 시험 재판에서 빛이 조명 실로 걸어 훈련 비행을 위해 켜져 10 초 후 수 있습니다. 조명 유리병에 도보로 실패는 &quot;보강을 통해 배운 과제&quot;와 동일합니다 &quot;패스&quot;로 기록됩니다. 다섯 경기를 연속으로 시련을 통해 패스 요금은 기록하고 PC0 (0 HR 게시물 금고) 그림 2 아래와 같습니다. </li></ul></li><li> 파리의 단기 기억 기능을 평가 <ul><li> 교육 및 초기 PC0 녹음 후, 각 비행기는 원래 음식 약병에 다시 배치하고 6 시간 동안 따로 보관. </li><li> 여섯 시간 포스트 훈련, 주제 각 비행을 이전과 같은 방식으로 다시 다섯 재판하고, 횟수, 파리가 (실패) 조명 병을 방지 (합격) 또는에 간다를 기록합니다. 이 패스 속도는 단기 기억의 지표 PC6 (6 시간 게시물 컨디셔닝)로 기록됩니다. </li></ul></li></ol> 6. 데이터 해석 및 통계 분석 <ol><li> 부정 Geotaxis 분석 <ul><li> 이 분석에서 생성된 원시 데이터는 각 그룹에서 10 초 8 cm 표시를 건너 파리의 수를 나타냅니다. 비율이 변환 10 세션이 지남에 따라 각 그룹에 대한 평균 통과 속도를 계산합니다. </li><li> 데이터는 의미의 표준 오차 (SEM)과 그룹당 평균 통과 속도 (유전자형, 치료 등) 그래픽 표시됩니다. </li><li> 그룹 간의 차이점다음 통계적으로 의미가 또는 학생 T - 테스트 또는 ANOVA를 사용하지 않는 것으로 결정하실 수 있습니다. </li></ul></li><li> Aversive Phototaxis 억제 분석 <ul><li> 이 분석에서 원시 데이터는 각 비행 다섯 연속 시련의 조명 챔버를 방지 횟수로 표현된다. 통과 율은 전체 시련을 통해 성공적인 회피 실험의 비율로 계산됩니다. 그룹 당 15 파리 최소이 방법으로 평균 통과 속도를 계산합니다. </li><li> 또는 평균 통과 속도 PC6 (6 시간 이후 헤어드라 이어, &quot;메모리&quot;표시기) 각각 SEM과 함께, 데이터를 그래픽으로 평균 통과 속도 PC0 ( &quot;학습&quot;표시기가 바로 에어컨 후)로 표현된다. </li><li> 학습 및 메모리 인덱스는 야생 입력하고 &quot;유전 - 조작 - 양성&quot;그룹 (예 : GFP overexpressing가 날아 등) 적절하게 모두 그룹 간의 비교입니다. </li></ul></li></ol> 7. 대표 결과 이 비디오 실험에서, 우리는 중추 신경계에 날아 overexpressing 인간 타우의 학습 및 메모리와 모터 적자를 평가하고 파리 overexpressing GFP의 그 자신의 성능을 비교. Drosophila 인간의 타우의의 연결 overexpression은 뇌 8 심각한 vacuolization 원인과 학습 및 메모리 기능 9 상당한 적자로 이어질을 보여줘왔다. 그림 2A와 같이, 십일 오래된 남성 또는 여성이 overexpressing 인간의 타우가 날아 연령 일치하는 GFP overexpressing에 비해 상당한 운동력이있는 사람의 결손을 날아. 또한, 이러한 파리 컨트롤 그룹에 비해 PC0 통과 속도에 의해 그림과 같이 쓴맛과 조명을 연결하는 데 실패뿐만 아니라, PC6 통과 속도 (그림 2B)의 감소에 의해 그림과 같이 해당 협회를 기억하지 못합니다. 이 실험은 더욱 Drosophila 모델 인간 neurodegenerative 조건을 공부하고 인간과 포유류의 관찰 행동 phenotypes의 일부를 recapitulating 사용할 수있는 것을 확인합니다. <img src="/files/ftp_upload/2504/2504fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. Aversive Phototaxis 억제 분석을위한 T - 메이즈 설치합니다. A.이 트랩도어로 구분하여 왼쪽 (호일로 덮여)에 필터 종이와 &quot;어둠&quot;의 튜브로 늘어선 &quot;조명&quot;팔콘 튜브,에 연결된 광원과 APSA 실험에 대한 전반적인 실험 설정. B.는 교육 및 시험 단계 동안, 파리가 어둠 챔버에 있으며 표시등이 조명 챔버에서 설정 후 트랩 문이 열렸어. <img src="/files/ftp_upload/2504/2504fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 사용하여 부정 geotaxis와 APS의 실험에서 결과는 대표 팬의 연결 드라이버 overexpressing GFP 또는 타우를 파리. 답변 부정 geotaxis 분석에서, 10 일 된 남자 (블루​​ 열) 또는 여성 (빨간색 열) overexpressing GFP는 타우 - overexpressing은 파리보다 높은 등반 활동을 보여주 날아. B. 20 일 된 암컷은 overexpressing GFP가 타우 overexpressing가 파리보다 (PC6) 함수 더 나은 학습 (PC0)와 메모리를 보여주 날아.

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	<li>Bonini, N. M., Fortini, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neurodegenerative+disease+modeling+using+Drosophila.">Human neurodegenerative disease modeling using Drosophila.</a> Annual Review of Neuroscience. 26, 627-656 (2003).</li><li>Lloyd, T. E. &. a. m. p. ;. a. m. p., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flightless+flies:+Drosophila+models+of+neuromuscular+disease.">Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease.</a> Ann N Y Acad Sci. 1184, e1-e20 (2010).</li><li>Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+mutants+of+Drosophila+isolated+by+countercurrent+distribution.">Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 58, 1112-1119 (1967).</li><li>Le Bourg, E., Buecher, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learned+suppression+of+photopositive+tendencies+in+Drosophila+melanogaster.">Learned suppression of photopositive tendencies in Drosophila melanogaster.</a> Animal Learning &#38; Behavior. 30, 330-341 (2002).</li><li>Seugnet, L., Suzuki, Y., Stidd, R., Shaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aversive+phototaxic+suppression:+evaluation+of+a+short-term+memory+assay+in+Drosophila+melanogaster.">Aversive phototaxic suppression: evaluation of a short-term memory assay in Drosophila melanogaster.</a> Genes Brain Behav. 8, 377-389 (2009).</li><li>Nilsen, S. P., Chan, Y. -. B., Huber, R., Kravitz, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gender-selective+patterns+of+aggressive+behavior+in+Drosophila+melanogaster.">Gender-selective patterns of aggressive behavior in Drosophila melanogaster.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 12342-12347 (2004).</li><li>Leal, S. M., Neckameyer, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+evidence+for+GABAergic+regulation+of+specific+behaviors+in+Drosophila+melanogaster.">Pharmacological evidence for GABAergic regulation of specific behaviors in Drosophila melanogaster.</a> J Neurobiol. 50, 245-261 (2002).</li><li>Wittmann, C. W., Wszolek, M. F., Shulman, J. M., Salvaterra, P. M., Lewis, J., Hutton, M., Feany, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tauopathy+in+Drosophila:+Neurodegeneration+Without+Neurofibrillary+Tangles.">Tauopathy in Drosophila: Neurodegeneration Without Neurofibrillary Tangles.</a> Science. 293, 711-714 (2001).</li><li>Mershin, A., Pavlopoulos, E., Fitch, O., Braden, B. C., Nanopoulos, D. V., Skoulakis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+and+memory+deficits+upon+TAU+accumulation+in+Drosophila+mushroom+body+neurons.">Learning and memory deficits upon TAU accumulation in Drosophila mushroom body neurons.</a> Learn Mem. 11, 277-287 (2004).</li><li>Ganetzky, B., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indirect+Suppression+Involving+Behavioral+Mutants+with+Altered+Nerve+Excitability+in+DROSOPHILA+MELANOGASTER.">Indirect Suppression Involving Behavioral Mutants with Altered Nerve Excitability in DROSOPHILA MELANOGASTER.</a> Genetics. 100, 597-614 (1982).</li><li>Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylcholinesterase+mutants+in+Drosophila+and+their+effects+on+the+structure+and+function+of+the+central+nervous+system.">Acetylcholinesterase mutants in Drosophila and their effects on the structure and function of the central nervous system.</a> J Comp Neurol. 189, 741-774 (1980).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

부정 geotaxis와 APS의 assays 모두 운동력이있는 사람이나 학습과 유전 또는 환경 조작에서 발생하는 메모리 용량의 변화를 측정하기 위해 강력한 행동 assays 있습니다. 그러나, 더 최적화를 기다리고 이러한 assays 몇 가지 단점이 있습니다. 부정 geotaxis 분석에서 특정 유전자의 돌연변이 파리에 심각한 모터 장애를 렌더링 수 있습니다. 이러한 경우에는, 파리는 거의 선동에 따라 중력에 대응 벽면을 타고 수 없습니다. 직접 움직임을 측정하는 다른 행동 assays가 더 적절한 수 있습니다. 이러한 assays 마비가와 압류 10, 및 운동 조정의 손실을 기록 optomotor 행동 11 대책 righting 반사 행동을 포함합니다. APS의 분석에서, 최초의 방해가 무작위로 전진하지 않고 조명 챔버의 입구에서 막는 파리하실 수 있습니다. 이전 파리 일반적으로 덜 활성과 오랜 기간 동안 중지하고 휴식하는 경향이 이후 노화가 공부 조건 중 하나에있는 경우이 문제가 더된다. 이 경우에는 실험자 항상 유효하지 않습니다 움직임을 촉진하기 위해 기계적 자극을 제공한다. 둘째, 하나는 논쟁 수도 긍정 phototaxis의 손실에서 조명 챔버 결과로 이동 실패. 이전 작업 보강 부정은 4를 제거되면 파리는 빛의 반응을 되돌릴 것으로 나타났습니다 때문에 이것은 거의 경우 않습니다. 셋째, aversive의 자극과 접촉의 기간은 재판에서 재판에 따라 다를 수 있습니다. 이 변화는 일반적으로 말라리아를 피하에서 파리를 방지하기 위해 절어 필터 종이 챔버의 내부 벽 encircling으로 줄일 수 있습니다. 또한, 실험자 각 플라이는 별도의 언급이 일분의 챔버에서 보낸 시간의 양을 늘림으로써 필터 종이와 접촉에 충분한 시간을 보낼 수 있도록 수 있습니다. 요약, 음성 geotaxis와 APS의 assays 행동 결손을 평가 빠르고 간단한 방법이며, 양적 운동력이있는 사람과 Drosophila의 학습과 기억 능력을 나타냅니다. 이러한 assays은 Drosophila 인간의 neurodegenerative 조건을 모델링 특히 유용합니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 자료 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 논평 </th></tr><tr><td> 폴리스티렌 비알 </td><td> 캐피톨 여사님, 주식 회사 </td><td> 28Fly </td><td> 28.5 X 95mm의 폴리스티렌 여사님, 소재의 품질 중요한 나쁜 파리 등산하기 너무 미끄러워 경우. </td></tr><tr><td> 입체경를 해부 </td><td> 자이스 혈구 </td><td> 000000-1432-979 </td><td> 두 가지 거위 목 라이트 가이드 (12V/30W) </td></tr><tr><td> 퀴나인 염산염 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> 6119-47-7 </td><td> 증류수에 용해. </td></tr><tr><td> 빠른 연결 해제 커넥터 </td><td> Nalgene (VWR) </td><td> 62868-021 </td><td> 고밀도 폴리에틸렌 </td></tr><tr><td> T - 메이즈 </td><td> 간단한 동작 시스템 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 단일 채널 200 μL 피펫 </td><td> Eppendorf </td><td> 022443305 </td><td></td></tr></tbody></table>

assaying locomotor, learning, and memory deficits in drosophila models of neurodegeneration

유전 방식의 발전 모델 시스템 1로 Drosophila를 사용하여 인간의 neurodegenerative 질병에 관련된 유전자의 연구를 활성화했습니다. 알츠하이머, 파킨슨병과 헌팅턴의 질병을 포함하여 이러한 질병의 대부분은 학습과 기억 기능 및 운동 조정 2 연령에 의존 저하가 특징입니다. 여기 우리는 인간 neurodegeneration와 관련된 행동 특성 중 일부는 파리에 recapitulated 수있는 것을 보여주기 위해 부정적인 geotaxis 분석 3 aversive phototaxic 억제 분석 (APS 분석) 4,5를 포함한 행동 assays를 사용합니다. 부정 geotaxis 분석에의 자연 경향이 흥분이 유전자 또는 전위의 용량을 저해 수 조건을 연구 활용하면 중력에 대해 이동 파리. APS의 분석에서 학습 및 메모리 기능 aversive 쓴맛과 조명을 연결시키고 그럼으로써 빛을 향해 이동이 다르게 자연적인 경향을 피하기 위해 훈련 비행 긍정적 - phototactic에서 테스트합니다. 이러한 훈련을 테스트하는 것은 6시간 사후 교육이 메모리 기능을 평가하는 데 사용됩니다 날아. 이러한 assays를 사용하여 개발 neurodegeneration 대​​한 모든 유전 또는 환경 요인의 기여는 쉽게 파리에서 공부하실 수 있습니다.

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Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

, 전위의 기능을 측정하는 학습을위한 행동 assays, 및 메모리 능력<em&gt; Drosophila</em&gt;.

에 시금 운동력이있는 사람, 학습, 및 메모리 적자 Drosophila</emNeurodegeneration의> 모델

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of ...

assaying-locomotor-learning-memory-deficits-drosophila-models

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

33.5K 조회수.  University of Miami, Miller School of Medicine. , 전위의 기능을 측정하는 학습을위한 행동 assays, 및 메모리 능력 Drosophila.

비디오: Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

An Automated Rapid Iterative Negative Geotaxis Assay for Analyzing Adult Climbing Behavior in a Drosophila Model of Neurodegeneration

Neurodegenerative diseases are frequently associated with a progressive loss of movement ability, reduced life span, and age-dependent neurodegeneration. To understand the mechanism of these cellular events, and their causal relationships with each other, Drosophila melanogaster, with its sophisticated genetic tools and diverse behavioral features, are used as disease models for assessing neurodegenerative phenotypes. Here we describe a high-throughput method to analyze Drosophila adult negative geotaxis behavior, as an indication for possible motor defects associated with neurodegeneration. An automated machine is designed and developed to drive fly synchronization using an initial electric impulse, later allowing the recording of negative geotaxis behavior over a course of secs to mins. Images from the digitally recorded video are then processed with the self-designed RflyDetection software for statistical data manipulation. Different from the manually controlled negative geotaxis assay based on single fly, this precise, fast, and high-throughput protocol allows data acquisition from more than hundreds of flies simultaneously, providing an efficient approach to advance our understanding in the underlying mechanism of locomotor deficits associated with neurodegeneration.

An Automated Rapid Iterative Negative Geotaxis Assay for Analyzing Adult Climbing Behavior in a Drosophila Model of Neurodegeneration

This step-by-step protocol analyzes Drosophila negative geotaxis behavior using an automated multi-cylinder system that hosts hundreds of flies and synchronizes their action by an electric motor. Upon synchronization, fly negative geotaxis behavior is assayed, digitally recorded, and analyzed using the self-designed RflyDetection software.

Neurodegeneration의 초파리 모델에서 성인 등반 동작을 분석 하기 위한 자동화 된 신속한 반복 부정적인 Geotaxis 분석 결과

Neurodegenerative diseases are frequently associated with a progressive loss of movement ability, reduced life span, and age-dependent neurodegeneration. ...

연구

행동분석학

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

발생학

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the elucidation of the molecular mechanisms involved in cognitive diseases1-7. Learning and memory can be assayed in larvae to study the effect of neurodevelopmental genes8-10 and in flies to measure the contribution of adult plasticity genes1-7. Furthermore, the short lifespan of Drosophila facilitates the analysis of genes mediating age-related memory impairment5,11-13. The availability of many inducible promoters that subdivide the Drosophila nervous system makes it possible to determine when and where a gene of interest is required for normal memory as well as relay of different aspects of the reinforcement signal3,4,14,16.
Studying memory in adult Drosophila allows for a detailed analysis of the behavior and circuitry involved and a measurement of long-term memory15-17. The length of the adult stage accommodates longer-term genetic, behavioral, dietary and pharmacological manipulations of memory, in addition to determining the effect of aging and neurodegenerative disease on memory3-6,11-13,15-21.
Classical conditioning is induced by the simultaneous presentation of a neutral odor cue (conditioned stimulus, CS+) and a reinforcement stimulus, e.g., an electric shock or sucrose, (unconditioned stimulus, US), that become associated with one another by the animal1,16. A second conditioned stimulus (CS-) is subsequently presented without the US. During the testing phase, Drosophila are simultaneously presented with CS+ and CS- odors. After the Drosophila are provided time to choose between the odors, the distribution of the animals is recorded. This procedure allows associative aversive or appetitive conditioning to be reliably measured without a bias introduced by the innate preference for either of the conditioned stimuli. Various control experiments are also performed to test whether all genotypes respond normally to odor and reinforcement alone.

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

The method to measure adult Drosophila associative memory is described. The assay is based on the ability of the fly to associate an odor presented with a negative reinforcer (electric shock) and then recall this information at a later time, allowing memory to be measured.

초파리 성인 후각 충격 학습

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the ...

신경과학

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the fly as an experimental system include its genetic tractability, short life span and the possibility to observe and quantitatively analyze complex behaviors. The expression of disease-linked genes in specific neuronal populations of the Drosophila brain, can be used to model human neurodegenerative diseases such as Parkinson's and Alzheimer's 5.
Dopaminergic (DA) neurons are among the most vulnerable neuronal populations in the aging human brain. In Parkinson's disease (PD), the most common neurodegenerative movement disorder, the accelerated loss of DA neurons leads to a progressive and irreversible decline in locomotor function. In addition to age and exposure to environmental toxins, loss of DA neurons is exacerbated by specific mutations in the coding or promoter regions of several genes. The identification of such PD-associated alleles provides the experimental basis for the use of Drosophila as a model to study neurodegeneration of DA neurons in vivo. For example, the expression of the PD-linked human &alpha;-synuclein gene in Drosophila DA neurons recapitulates some features of the human disease, e.g. progressive loss of DA neurons and declining locomotor function 2. Accordingly, this model has been successfully used to identify potential therapeutic targets in PD 8.
Here we describe two assays that have commonly been used to study age-dependent neurodegeneration of DA neurons in Drosophila: a climbing assay based on the startle-induced negative geotaxis response and tyrosine hydroxylase immunostaining of whole adult brain mounts to monitor the number of DA neurons at different ages. In both cases, in vivo expression of UAS transgenes specifically in DA neurons can be achieved by using a tyrosine hydroxylase (TH) promoter-Gal4 driver line 3, 10.

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Here we describe two assays that have been established to study age-dependent neurodegeneration of dopaminergic (DA) neurons in Drosophila: the climbing/startle-induced negative geotaxis assay which allows to study the functional effects of DA neurons degeneration and the tyrosine hydroxylase immunostaining which is used to identify and count DA neurons in whole brain mounts.

에 신약 표현형을 평가<em&gt; 초파리</em&gt; 등산 분석 실험에 의한 도파민 뉴런과 뇌 전체의 면역 염색

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such behavior is spontaneous locomotor activity. Here we describe our protocol that utilizes Drosophila population monitors and a tracking system that allows continuous monitoring of the spontaneous locomotor activity of flies for several days at a time. This method is simple, reliable, and objective and can be used to examine the effects of aging, sex, changes in caloric content of food, addition of drugs, or genetic manipulations that mimic human diseases.

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster are useful in studying genetic or environmental manipulations that affect behaviors such as spontaneous locomotor activity.&#160; Here we describe a protocol that utilizes monitors with infrared beams and data analysis software to quantify spontaneous locomotor activity.&#160;

의 자발적인 운동 활성의 결정<em&gt; 초파리</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila

Drosophila melanogaster is an ideal model organism for studying various diseases due to its abundance of advanced genetic manipulation techniques and diverse behavioral features. Identifying behavioral deficiency in animal models is a crucial measure of disease severity, for example, in neurodegenerative diseases where patients often experience impairments in motor function. However, with the availability of various systems to track and assess motor deficits in fly models, such as drug-treated or transgenic individuals, an economical and user-friendly system for precise evaluation from multiple angles is still lacking. A method based on the AnimalTracker application programming interface (API) is developed here, which is compatible with the Fiji image processing program, to systematically evaluate the movement activities of both adult and larval individuals from recorded video, thus allowing for the analysis of their tracking behavior. This method requires only a high-definition camera and a computer peripheral hardware integration to record and analyze behavior, making it an affordable and effective approach for screening fly models with transgenic or environmental behavioral deficiencies. Examples of behavioral tests using pharmacologically treated flies are given to show how the techniques can detect behavioral changes in both adult flies and larvae in a highly repeatable manner.

A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila

The present protocol assesses the locomotor activity of Drosophila by tracking and analyzing the movement of flies in a hand-made arena using open-source software Fiji, compatible with plugins to segment pixels of each frame based on high-definition video recording to calculate parameters of speed, distance, etc.

초파리에서 운동 활동을 분석하는 간단한 기술

Drosophila melanogaster is an ideal model organism for studying various diseases due to its abundance of advanced genetic manipulation techniques and ...

Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders

Locomotive defects resulting from neurodegenerative disorders can be a late onset symptom of disease, following years of subclinical degeneration, and thus current therapeutic treatment strategies are not curative. Through the use of whole exome sequencing, an increasing number of genes have been identified to play a role in human locomotion. Despite identifying these genes, it is not known how these genes are crucial to normal locomotive functioning. Therefore, a reliable assay, which utilizes model organisms to elucidate the role of these genes in order to identify novel targets of therapeutic interest, is needed more than ever. We have designed a sensitized version of the negative geotaxis assay that allows for the detection of milder defects earlier and has the ability to evaluate these defects over time. The assay is performed in a glass graduated cylinder, which is sealed with a wax barrier film. By increasing the threshold distance to be climbed to 17.5 cm and increasing the experiment duration to 2 min&#160;we have observed a greater sensitivity in detecting mild mobility dysfunctions. The assay is cost effective and does not require extensive training to obtain highly reproducible results. This makes it an excellent technique for screening candidate drugs in Drosophila mutants with locomotion defects.

We present an optimized inexpensive and reliable negative geotaxis assay in Drosophila melanogaster as a model for neurodegenerative disorders. Being more sensitive to mild locomotor defects, this assay will help screen for potential genetic interactions and drug targets.

퇴행성 신경 질환의 초파리 모델에서 등반 결함의 정량 분석

Locomotive defects resulting from neurodegenerative disorders can be a late onset symptom of disease, following years of subclinical degeneration, and ...

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health worldwide. Although mammalian models have provided important insights into the underlying mechanisms of pathogenicity, the complexity of mammalian systems together with their high costs are limiting their use. Therefore, the simple but well-established Drosophila model-system&#160;provides an alternative for investigating the molecular pathways that are affected in these diseases. Besides behavioral deficits, neurodegenerative diseases are characterized by histological phenotypes such as neuronal death and axonopathy. To quantify neuronal degeneration and to determine how it is affected by genetic and environmental factors, we use a histological approach that is based on measuring the vacuoles in adult fly brains. To minimize the effects of systematic error and to directly compare sections from control and experimental flies in one preparation, we use the &#39;collar&#39; method for paraffin sections. Neurodegeneration is then assessed by measuring the size and/or number of vacuoles that have developed in the fly brain. This can either be done by focusing on a specific region of interest or by analyzing the entire brain by obtaining serial sections that span the complete head. Therefore, this method allows one to measure not only severe degeneration but also relatively mild phenotypes that are only detectable in a few sections, as occurs during normal aging.

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Drosophila is widely used as a model system to study neurodegeneration. This protocol describes a method by which degeneration, as determined by vacuole formation in the brain, can be quantified. It also minimizes effects due to the experimental procedure by processing and sectioning control and experimental flies as one sample.

질량 조직학은에 신경 퇴행을 정량화하기<em&gt; 초파리</em

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health ...

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

Many insights into the molecular mechanisms underlying learning and memory have been elucidated through the use of simple behavioral assays in model organisms such as the fruit fly, Drosophila melanogaster. Drosophila is useful for understanding the basic neurobiology underlying cognitive deficits resulting from mutations in genes associated with human cognitive disorders, such as intellectual disability (ID) and autism. This work describes a methodology for testing learning and memory using a classic paradigm in Drosophila known as courtship conditioning. Male flies court females using a distinct pattern of easily recognizable behaviors. Premated females are not receptive to mating and will reject the male&#39;s copulation attempts. In response to this rejection, male flies reduce their courtship behavior. This learned reduction in courtship behavior is measured over time, serving as an indicator of learning and memory. The basic numerical output of this assay is the courtship index (CI), which is defined as the percentage of time that a male spends courting during a 10 min interval. The learning index (LI) is the relative reduction of CI in flies that have been exposed to a premated female compared to na&#239;ve flies with no previous social encounters. For the statistical comparison of LIs between genotypes, a randomization test with bootstrapping is used. To illustrate how the assay can be used to address the role of a gene relating to learning and memory, the pan-neuronal knockdown of Dihydroxyacetone phosphate acyltransferase (Dhap-at) was characterized here. The human ortholog of Dhap-at, glyceronephosphate O-acyltransferase (GNPT), is involved in rhizomelic chondrodysplasia punctata type 2, an autosomal-recessive syndrome characterized by severe ID. Using the courtship conditioning assay, it was determined that Dhap-at is required for long-term memory, but not for short-term memory. This result serves as a basis for further investigation of the underlying molecular mechanisms.

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

This protocol describes a Drosophila learning and memory assay called courtship conditioning. This classic assay is based on a reduction of male courtship behavior after sexual rejection by a non-receptive premated female. This natural form of behavioral plasticity can be used to test learning, short-term memory, and long-term memory.

학습과 기억의 척도 로서의 Drosophila Courtship 컨디셔닝

Many insights into the molecular mechanisms underlying learning and memory have been elucidated through the use of simple behavioral assays in model ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

성적 증명서와 Metabolites에서의 정화<em&gt; Drosophila</em&gt; 헤드

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

에 시금 운동력이있는 사람, 학습, 및 메모리 적자 Drosophila 모델

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Neurodegeneration의 초파리 모델에서 성인 등반 동작을 분석 하기 위한 자동화 된 신속한 반복 부정적인 Geotaxis 분석 결과

해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

초파리 성인 후각 충격 학습

에 신약 표현형을 평가

의 자발적인 운동 활성의 결정

초파리에서 운동 활동을 분석하는 간단한 기술

퇴행성 신경 질환의 초파리 모델에서 등반 결함의 정량 분석

질량 조직학은에 신경 퇴행을 정량화하기

학습과 기억의 척도 로서의 Drosophila Courtship 컨디셔닝

성적 증명서와 Metabolites에서의 정화