우리는 즉시 변형 블루밍턴의 재고 센터를 인정합니다. 이 작품은 BBSRC (BB / G008973 / 일)에서 연구비에 의해 지원되었다.

1 비행 준비 <ol><li> 유전 적 배경 (26)에 대한 제어하기 위해 행동 실험을하기 전에 적어도 6 세대, 모든 돌연변이, GAL4 / UAS 및 CSw- 같은 야생형 균주와 다른 라인을 교배. </li><li> 특정 조작이 다른 온도를 필요로하지 않는 25 ° C에서 12시 12분 시간의 명암주기에 따라 표준 옥수수 가루, 효모 및 당밀 음식 다이어트에 파리를 성장. <ol><li> 형질 전환 유전자 발현의 효과를 확인하려면 : 사용 18 °를 C는 개발을 통해 GAL4 Gal80 TS (TARGET 시스템)의 도입 유전자의 발현을 방지하고 1~2일 행동 실험 전에 30 ° C 배양기에 파리를 이동합니다. 형질 전환 유전자 발현 3,4,6,7,14의 효과를 결정하기 위해 30 ° C에서 실험을 실시한다. </li><li> 신경을 자극하는 열 활성화 TRPA1 채널을 사용하여 실험 : 알려진 온도 인 23 ° C,에서 파리를 올립니다비활성 채널을 유지하고 신경을 표현하는 TRPA1을 활성화하기 위해 30 ° C에서 동작 방으로 이동합니다. </li><li> 시냅스 출력 11, 14, 24을 차단하는 중요한 Shibire 온도를 사용하여 실험의 경우 : 후면 18 ° C에서 파리와 30 ° C에서 테스트를 실시하고 있습니다. </li></ol></li><li> 실험 전에 파리 1-2 일 수집과 빛 CO 2 마취하에 약 25의 그룹으로 계산한다. 12시 12분 시간 광 환경 제어 방에 70 %의 상대 습도 (특정 조작이 다른 온도를 요구하지 않는 한), 25 ° C에서 파​​리 식품 유리 병에서 O / N을 적어도 (효모없이)를 저장 : 어두운 상황을 때까지 실험. 참고 :이 스토리지 파리는 초파리 학습을위한 최적의 조건을 가지고 환경 제어 방에서 수행 된 이후의 학습 테스트에 순응 할 수 있도록하는 것은하고, 중요한 것은, 어떤 일 ENVI를 제거행동 표현형에 영향을 미칠 수있는 환경적인 변화. </li></ol> 실험 전에 2 준비 <ol><li> 주문 제작 방풍 T-미로 실험 (그림 1)을 수행합니다. </li><li> 정기적으로 밀폐 씰은 실험 기간 동안 얻을 수 있도록 피팅 튜브를 확인합니다. 필요한 경우, T-미로 내부를 구획 밀봉 O-링을 변경. </li><li> 교육 튜브 내부에 맞춤 구리 그리드를 배치합니다. 확인하고 정기적으로 이러한 그리드를 청소하고, 산화 된 경우 교체합니다. 전기 자극기에 연결된 스위치 박스에 실행 악어 클립을 통해 와이어에 구리 그리드를 연결합니다. 장치는 필요한 충격을 전달 될 수 있도록 전압계를 사용합니다. </li><li> 어떤 공기 누출을 방지하기 위해 긴밀하게 미로를 보유하는 g-클램프를 사용합니다. </li><li> 공기 펌프로 실행 튜브에 T-미로를 연결, 허용하는 냄새는 파리에서 그려지고 이후 T-미로에서 제거합니다. 온화한 공기를 유지~ 2 L / min으로 흐름 </li></ol> 3 냄새 희석 <ol><li> 파리가 모두 냄새에 대한 동일한 선호를 표시하도록 농도에서 두 개의 서로 다른 냄새를 사용합니다. 미네랄 오일 7,13에 희석 : 4 - 메틸 시클로 헥산 (1:67) 3 옥탄 올을 (100 일)를 사용합니다. 참고 : 조심스럽게 실험실에 따라 다를 수 이러한 농도를 결정합니다. 예를 들어 다른 사람은 모두 냄새 24 1:10을 사용합니다. 일반적으로 사용되는 다른 냄새 에틸 아세테이트 및 이소 아밀 아세테이트를 포함한다. </li><li> 피펫 따라서 냄새의 깃털로 파리를 노출, 공기가 컵에 냄새에 그려 질 수있는 구멍이 상단이 플라스틱 튜브에 의해 덮여 냄새 블록에 배치 맞춤 냄새 컵에 희석 냄새의 30 μL. </li></ol> (4) 교육 프로토콜 (그림 1과 2) <ol><li> 성인 후각 충격 조화를 들어, 희미한 붉은 빛 아래의 모든 실험 (예., 빨간색 LED), 연구자가 볼 수 있도록 수행하지만 플로리다 방지이와 같이 입력 영상과 반대로 파리 후각에 집중할 수 보는 Y. </li><li> 교육 튜브에 파리를 소개하고 T-미로에 부착하고 90 초 동안 튜브와 공기 흐름에 적응 할 수 있습니다. </li><li> 60 초간의 전체 지속 기간 동안 (3.75 초 펄스 간 간격과 열두 1.25 초 펄스들로 이루어진) 60 V의 충격으로 제 냄새 (4-메틸 시클로 헥산, MCH)을 제시한다. </li><li> 냄새 나 충격없이 30 초 휴식 기간이 충격을 따르십시오. </li><li> 충격없이 60 초 동안 초 냄새 (3 - 옥탄 올, OCT를) 현. </li><li> 냄새 나 충격없이 30 초 휴식 기간이 충격을 따르십시오. </li><li> 이러한 낡은 마우스 매트 부드러운 표면에 T-미로의 바닥을 두드리는 부드럽게 옆으로 T-미로를 켜서 T-미로의 중앙 챔버로 교육 실에서 파리로 이동합니다. 90 초 동안 중앙 챔버에서 파리를 유지한다. </li><li> 보로 선택 튜브를 장착장치의 ttom는 T-미로를 형성한다. </li><li> 학습을 측정 그들은 동시에 냄새에 노출 된 T-미로의 선택 지점에 파리를 이동 한 방향으로 이동합니다. 120 초 동안 시험 기간을 수행. </li><li> 트랩하여 최대 중앙 챔버를 슬라이딩 선택 튜브의 끝을 차단하여 선택 튜브의 파리. T-미로의 각 팔에 음식 튜브 및 횟수에 중앙 구획에 파리를 수집합니다. </li><li> 메모리를 측정 교육 (4.6) 후 파리를 수집하고 누룩을 넣지 않은 식품 유리 병에 T-미로로 전송합니다. 저장소 (소개 참조) 관심 메모리 위상을 결정하기 위해 필요한 남은 시간 동안 25 ° C에서 어두운 70 % 습도에서 파리. 단계 4.7에서와 같이 T-미로 파리를 재 도입. </li><li> 장기 기억은, 파리의 여러 배치가 동시에 훈련 할 수있는 사용자 지정 내장 된 미로를 사용합니다. 15 분 간주기 간격 (스파와 교육의 5주기를 관리CED) 또는 간주기 간격없이 (밀집). 시험 때까지 어둠 속에서 18 ° C에서 파​​리와 70 %의 습도를 유지한다. 테스트에 앞서, 25 ° C로 파리를 이동하고 적어도 1 시간 동안 순응 할 수 있습니다. 장기 기억에게 훈련 후 24 시간을 평가합니다. </li><li> 행동 실험 후, 뜨거운 물, 무취의 세제 냄새 컵을 청소합니다. 10 μL의 sigmacote으로 건조 후, 코트 컵. 전자 레인지에 의한 가열 건조를 sigmacote. 때때로 뜨거운 물, 무취의 세제 방풍 튜브 및 악취 차단 T-미로를 청소합니다. </li></ol> 성과 지표의 5 계산 : 파리 &#39;메모리의 측정 <ol><li> 마이너스 파리 (CS의 총 개수로 나눈 충격 페어링 냄새 (CS +)를 선택하는 파리의 수 - 충격 페어링 냄새 (CS)을 피하는 파리의 수와 같은 각각의 조건에 대한 성능 지수 (PI)를 계산 - + CS +) 1. PErformance 지수 (PI) = (# CS는 - 파리 - # CS +가 파리) / (# 총 파리) </li><li> MCH는 충격 페어링 냄새 및 OCT를 충격 페어링 냄새시킨 하나시킨 실험의 PI를 평균화함으로써 실험의 최종 PI를 계산한다. 이것은 하나의 냄새에 대한 높은 선호도를 갖는 파리의 편견을 제거합니다. </li></ol> 6 감각 운동 제어 <ol><li> T-미로 6,7,17로 ~ 40-50 파리를 도입하여 악취 시력을 수행합니다. </li><li> 90 초 후, 선택 포인트로 파리를 이동하고 순수한 냄새와 공기 사이에서 선택을 그들에게 두 분을 할 수 있습니다. </li><li> 수집하고 파리를 계산합니다. 테스트에 참여하는 사람들에 의해 악취를 선택 파리의 총 수를 나눔으로써 회피 백분율을 계산한다. </li><li> 충격 반응성 6,7,17 ​​들어 충격 챔버에 파리를 소개한다. </li><li> 나머지의 90 초 후, 파리 유사한 탈출 할 수있는 60-V D​​C 감전, 관리충격이없는 튜브. </li><li> 파리가 선택할 수있는 두 분을 허용; 수집하고 파리를 계산합니다. 실험에서 파리의 전체 숫자로의 충격 관을 탈출하여 충격을 피할 파리의 개수를 나눔으로써 충격 회피 백분율을 계산한다. 전기 충격을 탈출 자들의 총에 중앙 챔버에 남아 파리를 포함합니다. </li></ol>

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저자가 공개하는 게 없다.

여기에 제시된 성인 초파리 후각 충격 학습 분석은 장기 기억 15-17 포함한 메모리의 상이한 위상을, 기본 분자 메커니즘의 분석을 허용한다. 뿐만 아니라 생체 리듬 (18), 수면 (19), 다이어트 (20, 21), 노화 11-13, 신경 퇴행성 질환 (5)와 약물 치료 메모리 5,6,19의 효과의 판정 등. 대부분의 강력한 접근 방식은 최근에 파리 3,4,7,11,16,27 후각 기억을 매개 신경 회로의 기능적인 이미징을 위해 개발되어왔다. 이러한 optogenetic 기술은 초파리 (14, 16)에서 사용할 수있는 다른 발기인의 광대 한 레퍼토리를 사용합니다. 이러한 프로모터는 메모리 추적에 특정 유전자 돌연변이의 효과를 연구하기 위해 메모리 뉴런 16,27에서 유전자 인코딩 칼슘과 캠프 기자를 표현하는 데 사용됩니다. 목성인의 조건 발기인 및 돌연변이 전자의 사용은 메모리 3,4,6,7,13,14의 유전자 제품의 사후 개발 역할에 대한 연구를 할 수 있습니다. 이미징 및 동작 방법은 상기 자극 또는 그 기능을 해명하기 위해 메모리 회로 11,14,16,22-24에서 다른 뉴런을 억제하는 담색 및 열 - 활성화 채널과 결합 될 수있다. 또한, 버섯 본체 메모리 뉴런은 초파리 후각 메모리 (29)를 모델링하는 데 사용되는 전체 세포 패치 클램프 녹음 (28), 수학 및 계산 기술에 액세스 할 수 있습니다. 여기 소개 연상 메모리 프로토콜의 다른 형태와 조합 한 실험 진행은, 노화, 질병, 초파리가 처벌, 동기, 중독 보상에 응답하여 발생하는 연상 메모리에서 분자 - 회로 레벨 변화를 모델링하는데 사용되는 것을 허용 5,6,11-13,16,30-31.

여기에 제시된 방법은 몇 가지 작은 수정 1 툴리와 퀸으로 설명한다는 것입니다. 초파리는 첫 번째 단계에서 훈련되고 훈련 파리는 두 번째 단계에서 시험된다 : 실험은 두 단계로 수행된다. 훈련하는 동안, 파리의 그룹이 동시에 악취에 노출 일 (CS +) 및 교육 튜브에 전기 충격 (미국). 전기 충격없이 - 파리는 냄새 2 (CS)를받을 수 있습니다. 쇼크 특정 냄새의 페어링이 단일 한 사이클 트레이닝이라고하며, 가장 자주 사용되는 냄새는 4 - 메틸 시클로 헥산 (MCH) 및 3 - 옥탄 올 (10 월)이다. 한 사이클 훈련은 최대 7 시간 동안 검출 될 수있는 메모리의 불안정한상의 형성에 이르게; 그러나, 메모리는 일반적으로 불리는 학습, 인수 또는 2 분의 메모리가 무엇인지 확인하는 즉시 시험한다. 30 분 또는 1 시간을 측정하는 반면 메모리, 단기 메모리 칭한다3 시간 메모리는 중기 메모리로서 지칭된다. 교육주기 (간격 훈련) 사이의 간격을 반복 훈련 사이클 파리의 노출은 CREB ​​전사에 따라 다르며 주까지 지속되는 장기 기억의 통합 된 형태로 이어집니다. 갭 (한 덩어리로 만들어진 교육)이없는 교육은 일반적으로 교육 7,13,15-17,20,21의 5 사이클 후 24 시간을 측정한다 장기 기억과 유사한 마취 저항 메모리 (ARM)의 형성에 이르게. 이 방법으로, 메모리의 이러한 상이한 위상에 다양 유전자 돌연변이의 효과를 결정할 수있다. 활성화 또는 특정 신경 세포의 신경 활동을 차단하는 담색 또는 온도에 민감한 유전자의 프로모터 구동 식 한 메모리 수집, 통합 및 검색 3,4,11,15,16,20에 요구되는 뉴런 조사 할 수 있습니다, 22 ~ 24. 이 F 때문에 연령과 관련된 기억 손상을 연구 할 때 1 시간에 메모리는 일반적으로 측정된다메모리의 ORM은 11-13 노화의 영향에 특히 취약 나타납니다. 행동 및 유전 컨트롤 전체 범위는 메모리 실험을 수행하는, 예를 들어, 성능 결함 때문에 중앙 메모리 결함이나 충격이나 후각 큐 5 -7 감지에서 플라이 방지 말초 감각 결함 여부를 확인하는 한 7, 25, 26.

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:189px;height:28px;">Materials</td>
			<td style="width:139px;height:28px;">Source</td>
			<td style="width:116px;height:28px;">Cat. No.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:189px;height:20px;">3-Octanol</td>
			<td style="width:139px;height:20px;">Sigma</td>
			<td style="width:116px;height:20px;">218405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:189px;height:20px;">4-Methyl cyclohexanol</td>
			<td style="width:139px;height:20px;">Sigma</td>
			<td style="width:116px;height:20px;">15,309-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:189px;height:20px;">Benzaldehyde</td>
			<td style="width:139px;height:20px;">Sigma</td>
			<td style="width:116px;height:20px;">418099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:189px;height:20px;">Mineral Oil</td>
			<td style="width:139px;height:20px;">Fluka</td>
			<td style="width:116px;height:20px;">BP2629-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:189px;height:20px;">Hexyl acetate</td>
			<td style="width:139px;height:20px;">Sigma</td>
			<td style="width:116px;height:20px;">108154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:189px;height:20px;">Fructose</td>
			<td style="width:139px;height:20px;">Sigma</td>
			<td style="width:116px;height:20px;">F0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:189px;height:22px;">Agarose</td>
			<td style="width:139px;height:22px;">Bioline</td>
			<td style="width:116px;height:22px;">BIO-41025</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

drosophila adult olfactory shock learning

초파리는 따라서 크게인지 질병 1-7에 관련된 분자 메커니즘의 해명을 포함하여, 메모리에 대한 우리의 이해를 용이 40 년 이상 고전적 조건 형성 실험에서 사용되어왔다. 학습 및 기억은 성인 가소성 유전자 1-7의 기여를 측정하는 신경 발달 8-10 유전자의 효과를 연구하기 유충 및 초파리에서 정량 할 수있다. 또한, 초파리의 짧은 수명은 나이 관련 기억 손상을 매개 5,11-13 유전자의 분석을 용이하게한다. 초파리 신경계를 세분화 많은 유도 성 프로모터의 가용성은 언제 어디서 관심의 유전자가 일반 메모리뿐만 아니라 보강 신호 3,4,14,16의 다양한 측면의 릴레이에 필요한 것이 가능 확인 할 수 있습니다. 성인 초파리에서 공부하는 메모리의 상세한 분석이 가능동작과 관련된 회로 및 장기 메모리 (15) -17의 측정. 성인 스테이지의 길이가 메모리에 3-6,11-13,15-21 노화 및 신경 퇴행성 질환의 효과를 결정하는 단계에 더하여, 메모리의 장기간 유전 행동,식이 요법 및 약물 학적 조작을 수용한다. 고전적 조건 형성은 동물에 의해 서로 연관 될 중립 냄새 큐 (조건 자극, CS +) 및 보강 자극, 예를 들면., 감전, 크로스, (무조건 자극, 미국)의 동시 프레 젠 테이션에 의해 유도된다 1.16. 두번째 조건 자극 (CS는 -) 이후 미국을받지 않고있다. 테스트 단계에서 초파리 동시에 CS + 및 CS - 냄새되게됩니다. 초파리는 악취를 선택할 시간을 제공 한 후, 동물의 분포가 기록된다. 이 절차는 알기온은 혐오 또는의 욕구 조절이 안정적으로 조절 자극 중 하나에 대한 타고난 환경에 의해 도입 편견없이 측정 할 연관. 다양한 제어 실험은 모든 유전자형 혼자 냄새와 보강 정상적으로 동작하는지 테스트하기 위해 수행된다.

성능 지수 (PI)가 메모리의 척도로서 기능한다. 표 1은 PI의 대표적인 계산을 도시한다. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> MCH는 충격과 짝 </td><td> 3-OCT를 충격과 짝 </td></tr><tr><td> OCT (튜브) MCH 피하는 파리 = 80 (MCH 튜브) MCH 선호 파리 = 20 PI 1 - (80-20) / 80 + 20) = 0.6 </td><td> (MCH 튜브) OCT를 회피 파리 (75) = OCT (튜브) OCT를 선호하는 파리 25 = PI 2 = (75-25) / (+ 25 75) = 0.5 </td></tr><tr><td> 실험 = (0.6 + 0.5)의 PI /2=0.55 </td><td></td></tr></tbody></table> 표 1에 도시 된 데이터를 사용하여 성능 지수의 계산 대표. 다른 실험에 대한 성능 지수는 메모리 효과를 규명하기 위해 비교 될 수있다. 예를 한 번비교는 광저우 S 야생형 성인 파리 (WT)과 무지 렁 한 많은 돌연변이 성인 학습 수행 한 일련의 실험의 결과를 포함 그림 3에 표시됩니다. 10 연구 책임자의 평균은 평균의 표준 오차 (SEM)을 나타내는 오차 막대와 함께 제공됩니다. 이러한 결과는 무지 렁 파리 야생형에 비해 학습의 감소를 보여 있음을 보여줍니다. <img alt="그림 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50107/50107fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50107/50107fig1.jpg" /> 그림 1 성인 실험 장치. 파리 등은 충분한 지식과 T 미로에서 시험한다. 훈련은 전기 충격이없는 초 악취 B 다음에 전기 충격 악취을 제시하는 작업이 포함됩니다. 중간 챔버의 휴식 기간이 지난 후에 파리 동시에 냄새 두되게됩니다. 파리 갇혀있다이 튜브에 수집과 학습 / 메모리 점수를 얻기 위해 계산합니다. <img alt="그림이" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50107/50107fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50107/50107fig2.jpg" /> 그림 2 성인 교육 프로토콜. 파리는 두 단계로 훈련된다. 파리 60 초 동안 냄새 전기 충격 (미국)와 짝 (CS +)를 수신하는 첫 번째 단계. 다음 단계에서 파리는 전기 충격이없는 초 냄새 (CS-)을받을 수 있습니다. 파리는 그 때 CS + 및 CS - 사이 그들의 선택에 대한 시험 후 90 초 동안 휴식을 사용할 수 있습니다. <img alt="그림 3" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50107/50107fig3highres.jpg" width="400" /> 그림 3 성인 초파리에 무지 렁이 야생형 학습을 보여주는 대표적인 그래프. </strong&gt; WT와 무지 렁 파리 훈련의 한 세션 다음 시험 하였다. 무지 렁 파리는 WT (N = 10)에 비해 학습의 감소를 보여줍니다.

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Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

성인 초파리 연상 메모리를 측정하는 방법을 설명한다. 분석은 네거티브 강화제 (감전)되게 냄새를 연결하고 메모리가 측정 될 수 있도록 추후에이 정보를 기억하는 비행의 능력에 기초한다.

초파리 성인 후각 충격 학습

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the ...

drosophila-adult-olfactory-shock-learning

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

27.8K 조회수.  University of Bristol.  성인 초파리 연상 메모리를 측정하는 방법을 설명한다. 분석은 네거티브 강화제 (감전)되게 냄새를 연결하고 메모리가 측정 될 수 있도록 추후에이 정보를 기억하는 비행의 능력에 기초한다. 

비디오: Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of these diseases, including Alzheimer's, Parkinson's and Huntington's disease are characterized by age-dependent deterioration in learning and memory functions and movement coordination2. Here we use behavioral assays, including the negative geotaxis assay3 and the aversive phototaxic suppression assay (APS assay)4,5, to show that some of the behavior characteristics associated with human neurodegeneration can be recapitulated in flies. In the negative geotaxis assay, the natural tendency of flies to move against gravity when agitated is utilized to study genes or conditions that may hinder locomotor capacities. In the APS assay, the learning and memory functions are tested in positively-phototactic flies trained to associate light with aversive bitter taste and hence avoid this otherwise natural tendency to move toward light. Testing these trained flies 6 hours post-training is used to assess memory functions. Using these assays, the contribution of any genetic or environmental factors toward developing neurodegeneration can be easily studied in flies.

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Behavior assays for measuring locomotor functions, learning, and memory abilities in Drosophila.

에 시금 운동력이있는 사람, 학습, 및 메모리 적자 Drosophila</emNeurodegeneration의> 모델

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of ...

연구

신경과학

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

만성에 대한 성인 태어나 강한 뉴런의 선택 바이러스성 전달 생체내에 Optogenetic의 자극

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

In the following we describe the methodological details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with genetic interference, provides a handle to analyze the neuronal and molecular fundamentals of specifically associative learning in a simple larval brain.
Organisms can use past experience to adjust present behavior. Such acquisition of behavioral potential can be defined as learning, and the physical bases of these potentials as memory traces1-4. Neuroscientists try to understand how these processes are organized in terms of molecular and neuronal changes in the brain by using a variety of methods in model organisms ranging from insects to vertebrates5,6. For such endeavors it is helpful to use model systems that are simple and experimentally accessible. The Drosophila larva has turned out to satisfy these demands based on the availability of robust behavioral assays, the existence of a variety of transgenic techniques and the elementary organization of the nervous system comprising only about 10,000 neurons (albeit with some concessions: cognitive limitations, few behavioral options, and richness of experience questionable)7-10.
Drosophila larvae can form associations between odors and appetitive gustatory reinforcement like sugar11-14. In a standard assay, established in the lab of B. Gerber, animals receive a two-odor reciprocal training: A first group of larvae is exposed to an odor A together with a gustatory reinforcer (sugar reward) and is subsequently exposed to an odor B without reinforcement 9. Meanwhile a second group of larvae receives reciprocal training while experiencing odor A without reinforcement and subsequently being exposed to odor B with reinforcement (sugar reward). In the following both groups are tested for their preference between the two odors. Relatively higher preferences for the rewarded odor reflect associative learning - presented as a performance index (PI). The conclusion regarding the associative nature of the performance index is compelling, because apart from the contingency between odors and tastants, other parameters, such as odor and reward exposure, passage of time and handling do not differ between the two groups9.

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are able to associate odor stimuli with gustatory reward. Here we describe a simple behavioral paradigm that allows the analysis of appetitive associative olfactory learning.

에 Appetitive 연관 강한 학습<em&gt; Drosophila</em&gt; 애벌레

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including lens-secreting cone cells, pigment cells, a bristle cell and eight photoreceptors (PRs) R1-R8 2. The PRs have specialized microvillar structures, the rhabdomeres, which contain light-sensitive pigments, the Rhodopsins (Rhs). The rhabdomeres of six PRs (R1-R6) form a trapezoid and contain Rh1 3 4. The rhabdomeres of R7 and R8 are positioned in tandem in the center of the trapezoid and share the same path of light. R7 and R8 PRs stochastically express different combinations of Rhs in two main subtypes5: In the 'p' subtype, Rh3 in pR7s is coupled with Rh5 in pR8s, whereas in the 'y' subtype, Rh4 in yR7s is associated with Rh6 in yR8s 6 7 8.
Early specification of PRs and development of ommatidia begins in the larval eye-antennal imaginal disc, a monolayer of epithelial cells. A wave of differentiation sweeps across the disc9 and initiates the assembly of undifferentiated cells into ommatidia10-11. The 'founder cell' R8 is specified first and recruits R1-6 and then R7 12-14. Subsequently, during pupal development, PR differentiation leads to extensive morphological changes 15, including rhabdomere formation, synaptogenesis and eventually rh expression.
In this protocol, we describe methods for retinal dissections and immunohistochemistry at three defined periods of retina development, which can be applied to address a variety of questions concerning retinal formation and developmental pathways. Here, we use these methods to visualize the stepwise PR differentiation at the single-cell level in whole mount larval, midpupal and adult retinas (Figure 1).

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The Drosophila retina is a crystal-like lattice composed of a small number of cell types that are generated in a stereotyped manner 1. Its amenability to sophisticated genetic analysis allows the study of complex developmental programs. This protocol describes dissections and immunohistochemistry of retinas at three discrete developmental stages, with a focus on photoreceptor differentiation.

애벌레의, Pupal 및 성인의 해부 및 Immunohistochemistry<em&gt; Drosophila</em&gt; 망막

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

에있는 후각 수용체 뉴런의 전체 마운트 Immunolabeling<em&gt; 초파리</em&gt; 안테나

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

의 기록 세포 내 전압 응답에 대한 전기 생리 방법<em&gt; 초파리</em&gt; 빛 자극에 광수와의 interneurons<em&gt; 생체</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an excellent model system for such investigations due to its complex behaviors, powerful genetic techniques, and compact nervous system. Laboratory behavioral assays have long been used with Drosophila to simulate properties of the natural environment and study the neural mechanisms underlying the corresponding behaviors (e.g. phototaxis, chemotaxis, sensory learning and memory)1-3. With the recent availability of large collections of transgenic Drosophila lines that label specific neural subsets, behavioral assays have taken on a prominent role to link neurons with behaviors4-11. Versatile and reproducible paradigms, together with the underlying computational routines for data analysis, are indispensable for rapid tests of candidate fly lines with various genotypes. Particularly useful are setups that are flexible in the number of animals tested, duration of experiments and nature of presented stimuli. The assay of choice should also generate reproducible data that is easy to acquire and analyze. Here, we present a detailed description of a system and protocol for assaying behavioral responses of Drosophila flies in a large four-field arena. The setup is used here to assay responses of flies to a single olfactory stimulus; however, the same setup may be modified to test multiple olfactory, visual or optogenetic stimuli, or a combination of these. The olfactometer setup records the activity of fly populations responding to odors, and computational analytical methods are applied to quantify fly behaviors. The collected data are analyzed to get a quick read-out of an experimental run, which is essential for efficient data collection and the optimization of experimental conditions.

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.

의 컴퓨터 추적하여있는 분석 후각 행동<em&gt; 초파리</em&gt; 네 사분면의 후각에

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an ...

Taste Preference Assay for Adult Drosophila

Olfactory and gustatory perception of the environment is vital for animal survival. The most obvious application of these chemosenses is to be able to distinguish good food sources from potentially dangerous food sources. Gustation requires physical contact with a chemical compound which is able to signal through taste receptors that are expressed on the surface of neurons. In insects, these gustatory neurons can be located across the animal's body allowing taste to play an important role in many different behaviors. Insects typically prefer compounds containing sugars, while compounds that are considered bitter tasting are avoided. Given the basic biological importance of taste, there is intense interest in understanding the molecular mechanisms underlying this sensory modality. We describe an adult Drosophila taste assay which reflects the preference of the animals for a given tastant compound. This assay may be applied to animals of any genetic background to examine the taste preference for a desired soluble compound.

Taste Preference Assay for Adult Drosophila

Taste is an important sensory process which facilitates attraction to beneficial substances and avoidance of toxic substances. This protocol describes a simple ingestion assay for determining Drosophila gustatory preference for a given chemical compound.

성인을위한 맛의 기본 설정 분석<em&gt; 초파리</em

Olfactory and gustatory perception of the environment is vital for animal survival.  The most obvious application of these chemosenses is to be able to ...

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

Many insights into the molecular mechanisms underlying learning and memory have been elucidated through the use of simple behavioral assays in model organisms such as the fruit fly, Drosophila melanogaster. Drosophila is useful for understanding the basic neurobiology underlying cognitive deficits resulting from mutations in genes associated with human cognitive disorders, such as intellectual disability (ID) and autism. This work describes a methodology for testing learning and memory using a classic paradigm in Drosophila known as courtship conditioning. Male flies court females using a distinct pattern of easily recognizable behaviors. Premated females are not receptive to mating and will reject the male&#39;s copulation attempts. In response to this rejection, male flies reduce their courtship behavior. This learned reduction in courtship behavior is measured over time, serving as an indicator of learning and memory. The basic numerical output of this assay is the courtship index (CI), which is defined as the percentage of time that a male spends courting during a 10 min interval. The learning index (LI) is the relative reduction of CI in flies that have been exposed to a premated female compared to na&#239;ve flies with no previous social encounters. For the statistical comparison of LIs between genotypes, a randomization test with bootstrapping is used. To illustrate how the assay can be used to address the role of a gene relating to learning and memory, the pan-neuronal knockdown of Dihydroxyacetone phosphate acyltransferase (Dhap-at) was characterized here. The human ortholog of Dhap-at, glyceronephosphate O-acyltransferase (GNPT), is involved in rhizomelic chondrodysplasia punctata type 2, an autosomal-recessive syndrome characterized by severe ID. Using the courtship conditioning assay, it was determined that Dhap-at is required for long-term memory, but not for short-term memory. This result serves as a basis for further investigation of the underlying molecular mechanisms.

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

This protocol describes a Drosophila learning and memory assay called courtship conditioning. This classic assay is based on a reduction of male courtship behavior after sexual rejection by a non-receptive premated female. This natural form of behavioral plasticity can be used to test learning, short-term memory, and long-term memory.

학습과 기억의 척도 로서의 Drosophila Courtship 컨디셔닝

Many insights into the molecular mechanisms underlying learning and memory have been elucidated through the use of simple behavioral assays in model ...

An Objective and Reproducible Test of Olfactory Learning and Discrimination in Mice

Olfaction is the predominant sensory modality in mice and influences many important behaviors, including foraging, predator detection, mating, and parenting. Importantly, mice can be trained to associate novel odors with specific behavioral responses to provide insight into olfactory circuit function. This protocol details the procedure for training mice on a Go/No-Go operant learning task. In this approach, mice are trained on hundreds of automated trials daily for 2&#8211;4 weeks and can then be tested on novel Go/No-Go odor pairs to assess olfactory discrimination, or be used for studies on how odor learning alters the structure or function of the olfactory circuit. Additionally, the mouse olfactory bulb (OB) features ongoing integration of adult-born neurons. Interestingly, olfactory learning increases both the survival and synaptic connections of these adult-born neurons. Therefore, this protocol can be combined with other biochemical, electrophysiological, and imaging techniques to study learning and activity-dependent factors that mediate neuronal survival and plasticity.

Here, we train mice on an associative learning task to test odor discrimination. This protocol also allows for studies on learning-induced structural changes in the brain.

초파리 성인 후각 충격 학습

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에 시금 운동력이있는 사람, 학습, 및 메모리 적자 Drosophila 모델

만성에 대한 성인 태어나 강한 뉴런의 선택 바이러스성 전달 생체내에 Optogenetic의 자극

에 Appetitive 연관 강한 학습

애벌레의, Pupal 및 성인의 해부 및 Immunohistochemistry

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의 기록 세포 내 전압 응답에 대한 전기 생리 방법

의 컴퓨터 추적하여있는 분석 후각 행동

성인을위한 맛의 기본 설정 분석

학습과 기억의 척도 로서의 Drosophila Courtship 컨디셔닝

후 각 학습 및 쥐에 있는 차별의 객관적이 고 재현성 시험