이 작품은 빌과 멜린다 게이츠 재단 (SBG에 그랜드 챌린지 탐험 상), 건강 연구 (NIHR), 미생물 질병의 바이오 메디컬 연구 센터, NIHR 종합 지역 연구 네트워크의 국립 연구소에 의해 자금을 지원했다. 우리는 infrastructural 지원 NWDA을 인정합니다. 우리는 폐렴 분리에 대한 교수 J. N 버드 바이져, 펜실베니아 대학 교수 P Hermans, 네이 메헨 대학 감사드립니다. 사진을 찍을 대한 참여를위한 모든 자원 봉사자와 매튜 Bangert에 대한 그들의 지원과 조언 EHPC 안전위원회에 감사합니다.

1. 선택과 검진을 자원 봉사 <ol><li> 건강한 자원 봉사자는 NHS 연구 및 윤리위원회 안내에 따라 포스터 광고 통해 대학 웹 사이트에서 모집하고 있습니다. </li><li> 참가 포함 기준은 다음과 같습니다 <ol><li> 18-60년 세 성인. </li><li> 유창한 영어를 구사하고 휴대 전화 및 문자 메시지를 모두 쉽게 의사 소통을 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 참여에 대한 제외 기준은 다음과 같습니다 <ol><li> 위험 개인 (어린이, immunosuppressed 성인, 노인, 만성 질환)에 연락을 닫습니다. </li><li> 현재 흡연자 또는 중대한 흡연의 역사 (&gt; 10 팩 년). </li><li> 천식이나 기타 호흡기 질환. </li><li> 임신. </li><li> 페니실린 또는 amoxicillin에 대한 알레르기. </li><li> 관측하지 않는 한 또는 비 interventional 단계에서 또 다른 임상 시험의 현재 참여. </li><li> 완전 정보​​ 동의 할 수 없습니다. </li></ol></li><li>초기 검사 방문, 약 일주일 접종 전에 초점을 맞춘 임상 역사와 대상 임상 시험이 포함되어 있습니다. </li><li> 이전에 인식 할 수없는 이상이 발견되는 경우, 자원은 연구에서 제외되며 적절한 조사가 일차 의료를 통해 이용하실 수 있습니다. </li><li> 초기 심사하는 동안 화이트 셀 수가 접종 방문하기 전에 정상 범위 내에 있는지 확인하기 위해 취득하는 전체 혈액 카운트를 방문하십시오. 코 세척은 (6.1 참조) 자연 폐렴 사업자를 제외하도록 수행됩니다. </li><li> 접종에 앞서, 자원 봉사자들은 연구에 참여에 수반되는 위험 부담에 대한 교육하고 응급 환자 전단지, 디지털 온도계, 긴급 전화 번호, amoxicillin 3 일 코스를 제공합니다. </li></ol> 2. 접종 주식의 작성 <ol><li> 접종 주식의 준비는 깨끗한 환경에서 수행되어야합니다. 사용 피펫은 사용되어야한다inoculum 준비를위한 D. 모든 유리와 플라스틱 도자기는 살균해야합니다. 우리는 접종 주식은 전용 fumehood과 보육을 사용하여 전용 객실에 준비하는 것이 좋습니다. </li><li> 폐렴 긴장은 혈액 한천 플레이트에 주사합니다. 접시 5 % CO 2 박에 37 ° C에서 incubated 수 있습니다. 다음 날은 모든 박테리아는 혈액 한천 플레이트에서 긁어와 구슬 재고 보존 시스템으로 주사된다. 이 구슬 주식은 접종 재고 준비에 사용됩니다. 접종 주식을 준비하기 전에 오염 및 식민지 균일의 구슬 주식을 테스트합니다. </li><li> 접종 주식을 준비하려면 전체 판을 충당하기 위해 좋겠어, 원하는 폐렴의 혈청 형 비드 재고에서 두 구슬과 혈액 한천 플레이트의 예방. 2 박 5 % CO에서 37 ° C에서 접시를 품다. 모든 자세한 incubations이 동일한 조건을 사용합니다. 또한 불임을 보장하기 하루 아침에 Vegitone 미디어를 품다. </li><li> 다음날 아침에 면봉반 판은 돌보는 것은 모든 혈액 한천을 제거하고 미리 예열 Vegitone의 국물 12 ML에 추가 할 수 없습니다. 접시의 나머지 절반을 사용하여 반복합니다. 탁도의 변화가 명백한 될 때까지 2 시간 또는 37 ° C에서 두 개의 12 ML 튜브를 남겨, 이때 둘 중 빠른 날짜가 적용됩니다. </li><li> 사전 예열 Vegitone의 국물의 40 ML에 12 ML을 추가하고 철저하게 섞는다. 다른 12 ML의 유리 병에 반복합니다. 이 시점 = 0입니다. 600 나노 미터에서 광학 밀도 (OD)를 읽을 수 100 μl를 제거합니다. 마일과 Misra (M &amp; M) 7에 의해 방법의 변형을 사용하여 식민지 형성 단위 (CFU) 수에 의해 박테리아의 정량화 20 μl를 제거합니다. 두 병을 품다. <ol><li> M &amp; M의 경우, 여섯 부분에 혈액 한천 플레이트를 나눕니다. 96 잘 플레이트 여섯 우물 (U-하단)에 멸균 PBS 180 μl를 추가합니다. 톱을 잘 믹스로 국물을 20 μl를 추가합니다. 순차적으로 샘플 1시 10분 6 번 희석하고 여섯째 잘에서 20 μl를 폐기하십시오. 의 첫 번째 섹션에 가기도 곳에서 세 10 μl 물방울혈액 한천 플레이트. 다섯 다른 우물을 위해 반복합니다. 이 반전과 incubated되기 전에 플레이트는 건조 확인하십시오. </li><li> 다음 날은 각 희석 섹션과 기록에 보이는 콜로니의 수를 계산합니다. 30 300 사이의 수와 희석 섹션을 사용하여이 평균을 세 가지에 의해 눈에 보이는 콜로니의 수를 나눕니다. </li><li> 희석 요소를 기준으로 식민지의 평균 수를 곱 후 10 일 (10 μl 방울의 양)에 의해 나눕니다. 이 μl / CFU 수 있습니다. </li><li> CFU / ML을 1,000으로이 숫자를 곱합니다. </li></ol></li><li> 초 중순 로그 단계가 0.25 OD에 도달 할 때까지 M &amp; M 방법 매 시간으로 OD 600 판독하고 박테리아의 정량화를 수행합니다. </li><li> 이 OD에 도달하면 한 병에 살균 10 % 글리세롤을 추가하고 1 ML의 aliquots를 준비합니다. -80에서 저장 aliquots ° C. </li><li> 더 농축 주식, 15 분에 3,345 XG에서 다른 병을 원심 분리기하고 표면에 뜨는을 제거합니다. Vegiton의 22.5 ML에서 펠렛을 Resuspend전자 매체와 10 %의 글리세롤을 추가합니다. -80에서 1 ML aliquots 및 매장을 준비 ° C. </li><li> 해동 및 정량화하기 전에 최소 48 시간에 -80 ° C에서 주식을 둡니다. </li><li> M &amp; M 방식으로 얼어 붙은 세균 주식을 수량화. 재현성을 보장하기 위해 개별적으로 삼 재고 튜브를 테스트합니다. 아래에 설명 된대로, 생리에서 원하는 inoculum 농도에 주식을 희석하기 위해 얻은 값을 사용합니다. </li><li> 접종를 들어, inoculum의 pneumococci의 양이 접종 전후 계산됩니다. M &amp; M 방식에 의한 세균의 정량화는이 모든 절차를 완료하는 데 걸리는 시간에 대한 계정 inoculum의 pneumococci의 평균 수를 결정하는 데 사용됩니다. <ol><li> , inoculum을 준비하여 원하는 농도로 diluting하고 &quot;사전 접종&quot;카운트에 대한 M &amp; M 방법으로 정량화를 수행합니다. </li><li> 우리의 임상 연구 시설에서이 전체 접종 절차를 완료하려면 팀 30 분 정도 소요됩니다. PN생리에 eumococcal 중지는 보통이 간격의 감소 카운트를 표시합니다. 이거 설명하기 위해, 우리는 30 분 동안 실온에서 희석 inoculum의 태어난하게하고 M &amp; M 방법으로 박테리아의 &quot;후 접종&quot;정량화를 수행합니다. </li><li> 최종 주사 농도를 결정하기 위해 전후의 평균보십시오. 귀하의 임상 프로토콜에 따라 &quot;휴식&quot;시간을 조절하지만, 가능한 한 짧은으로 간격을 유지. </li></ol></li><li> 모든 신규 주식은 주식 순도과 정체성의 확인을 참조 실험실로 전송 될 것입니다. </li></ol> 3. Inoculum 준비 <ol><li> inoculum의 준비는 예정 자원 봉사 접종을 예약하기 전에 30 분을 시작해야합니다. </li><li> -80 ° C의 냉동고의 이전에 만든 재고 튜브 중 하나를 받아, 해동, 3 분에 17,000 XG에서 microcentrifuge에 튜브를 스핀. </li><li> 37 ° C 배양기에서 따뜻한 혈액 한천 플레이트. 준비96도 M &amp; M 방식으로 세균 정량화를위한​​ 판하고 원하는 용량에 따라 희석 튜브를 준비합니다. </li><li> centrifuged 관에서 국물의 표면에 뜨는을 제거하고 생리 1 ML에 펠렛을 resuspend. 이 단계는 inoculum에서 국물을 제거합니다. </li><li> 원심 분리 단계를 반복합니다. </li><li> 생리 표면에 뜨는을 제거하고 생리 1 ML에 펠렛을 resuspend. </li><li> 원하는 inoculum 농도에 희석 집합을 수행하고 M &amp; M 방법으로 정량화. </li><li> 자원 예약에 inoculum를 타고 자원 봉사자 inoculating 후, 실험실에서 정량화를 반복합니다. -80에서 날짜와 inoculum 선량 및 매장과 관의 레이블을 ° C. </li><li> 접종의 접종에 대한 일관성을 보장하기 위해,이 같은 피펫 및 전용 실험실 장비마다 사용하는 것이 중요합니다. </li></ol> 4. 접종 <ol><li> 자원 봉사자는 반 가로 누운 위치에 편안하게 앉아해야합니다. </li><li&gt; P200 피펫을 사용하여 살균 필터 팁 inoculum 100 μl를 이끌어 그냥 비강 내부에 팁을 삽입합니다. </li><li> 천천히 원형 운동을 사용하여 코 점막 위에 inoculum을 배출. </li><li> 이 피펫 팁은 혈류를 입력 박테리아 될 수있는 상피의 무결성의 혼란으로 코 점막과 접촉하지 않는 것이 중요합니다. </li><li> 이 inoculum가 뒤로 너무 많이 배치되지 않았거나이 목구멍으로 넘어 것 또한 매우 중요합니다, 그것은 비강 내부에 거주해야합니다. </li><li> 다른 naris에 대해 반복합니다. </li><li> 지원자는 코를 킁킁 대는 나 날려 버리지 않고 10 분 동안 반 가로 누운 위치에 남아 있습니다. 이 박테리아 시간이 점막에 걸쳐 분산 할 수 있습니다. </li></ol> 5. 모니터링 <ol><li> 자원 봉사자 접종 후 매일 모니터링하고 있습니다. 이가 오후 2 시부 전에 수사관 자원 봉사자가 보낸 매일 문자 메시지가 포함되어 있습니다. </li><li> 만약 텍스트 내가s는 자원 봉사가 그 / 그녀의 안녕을 보장하기 위해 연락을드립니다 오후 2시받은 수 없습니다. 그 / 그녀가 응답하지 않는 경우, 동족의 할당 다음은 자원 봉사자의 안녕을 보장하기 위해 연락을드립니다. </li><li> 자원 봉사자는 모든 약속을에있는 모든 상부 호흡기 증상을보고하여 주시기 바랍니다. 임상 직원은 그 / 그녀의 증상을 설명하기 위해 자원을 요청하고 불만을 따를 것이다. </li><li> 자원 봉사자에게 항생제는 세 상황에서주의 할 만이다;들은 월경이며 또한 연구의 끝에서 pneumococcus을 들고하거나 몸이 편치 않은 경우하는 경우, 연구 팀에 의해 그들에게 알려야하는 경우에 및 연구 팀에 문의 할 수 없습니다. 자원은 연구 기간 동안 항상 그들과 응급 팩을 유지하도록 권장되고 다음 7 일 동안 매일 연구 팀에 문의를 요청합니다. </li><li> 우리 팀은 호의 운동 시간 동안 간호사 연락처와 7분의 24 사용할 수 있습니다 두 의사 가능우르스. 모든 검색어는 전화 통화 및 / 또는 즉시 검토하여 처리하고 있습니다. 필요한 경우 조항은 전염병 병동에 즉시, 직접 입학이 가능합니다. </li></ol> 6. 코 워시 (NW) 절차 <ol><li> 코 세차 (NW)는 초기 심사 방문뿐만 아니라, 48 시간, 7, 14 일 이후의 접종에서 수행됩니다. 사용 NW 방법이 Naclerio 외에서 가져옵니다. 8 자원 봉사자 자연스럽게 S.에 의해 식민지 pneumoniae는 접종 대상에서 제외하고 추후 있습니다. </li><li> 자원 봉사은 편안하게 장착되고 머리는 수직에서 다시 30 °를 기울입니다. </li><li> 에서 숨을 깊이 가지고 입의 지붕에 대해 거꾸로 자신의 혀를 밀어하고하면서 숨을 보유하는 자원 봉사를 물어보십시오. 이 위치에서하는 동안, 자원 봉사자들은 준비가되었다는 신호를하도록 요청하고 있습니다. </li><li> 20 ML의 식염수에 가득 찬 주사기는 앞 코 공간에 삽입되어 염분의 5 ML 퇴학입니다. volunteeR은 다음 즉시 앞으로 포수와 호일 그릇에 자신의 코를 통해 빠르게 exhaling하여 유체를 퇴학 시켜도. </li><li> 이 절차 때마다 naris가 두 번 세척되어 전체 20 ML을 사용했습니다 있도록 3 번 반복합니다. </li><li> 원심 분리기 튜브에 함께 풀 모든 샘플을 및 처리를 위해 실온에서 실험실로 보내 주시기 바랍니다. </li></ol> 7. 코 워시 처리 <ol><li> 3345 X g에서 10 분 동안 샘플을 원심 분리기. </li><li> -80에서 표시 Eppendorf 튜브 1 ML aliquots로 표면에 뜨는 및 저장소를 제거 ° C. </li><li> 펠렛에 미디어 9 STGG 100 μl를 추가하고 철저하게 섞는다. 이 시점에서 관 전체 볼륨이 결정되어 있는지 확인합니다. 이 희석은 운송 긍정적 인 NW의 CFU을 계산에 사용됩니다. </li><li> 판 gentamicin과 탄력 전체 플레이트를 포함하는 혈액 한천 플레이트에 resuspended 펠릿을 포함 STGG의 20 μl 드롭합니다. <ol><li> NW는 이후 접종하는 경우, resuspended 펠렛 및 M &amp; M 방식으로 세균 정량화의 사용을 포함하는 STGG에서 10 μl를 제거합니다. </li></ol></li><li> NW 튜브에 STGG의 또 다른 800 μl를 추가하고 철저하게 섞는다. </li><li> 전체 판을 좋겠어 혈액 한천 플레이트와 초콜릿 한천 플레이트로 25 μl로 판 25 μl. </li><li> -80에서 2 cryovials 및 매장에 매체를 STGG 일시 중지 나머지 금액 박테리아를 나누어 ° C. </li><li> 5% CO 2 ° C 야간 37 접시를 품다. </li><li> 접시에게 pneumococcus 및 기타 잠재적 인 호흡기 병원균의 다음 날을 검사합니다. </li><li> Pneumococci는 식민지의 형태가 접시에 식별됩니다. 기초의 형태와 알파 haemolytic 식민지는 optochin 디스크와 혈액 한천에 하위 교양하고 하룻밤 incubated. </li><li> optochin 문자를 구분 추정 폐렴 식민지는 그램 그램 긍정적 인 diplococci을 확인하기 물들과 Statens 세럼 문화원 Pneu를 사용 serotyped 아르motest - 라텍스 키트. </li></ol>

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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

EHPC 플랫폼은 점막 백신 모델과 소설 단백질 백신을 테스트하기위한 보호 대리로 사용하는 등 잠재적 인 용도 수 있습니다. 방법은 일관성 접종 기술과 고품질의 NW에 따라 달라집니다. 재현성은 inoculum에 문제가 될 수 있습니다. 냉동 세균 aliquots의 변수 특성 때문에, 그것은 원하는 용량을 복제 할 어려울 수 있습니다. 원하는 용량의 반턱이나 복제는 범위 내에서 간주됩니다. 이 박테리아 정량화가 정확하게 CFU 수에 의해 박테리아의 정량화를 결정하기 위해 접종 바로 이전 및 다음 수행 할 수 있다는 매우 중요합니다. 자원 봉사 약속이 발생하는 경우 이러한 이유로 단 한 inoculum가 준비 사전 접종과 그 후에 진행 정량화 도금이 떨어져 더 이상 30 분 발생 될 필요하는 동시에 매우 도움이 될 수 있습니다. NW 방법은 coope가 필요합니다자원 봉사 및 배급은 어린이의 이상적인 방법은되지 않습니다. 수율이 덜 5 ML 경우, 절차는 별도의 20 ML까지 사용 반복 할 수 있습니다. 착용 틀니는 NW 수율을 줄일 수 있습니다. 자원 봉사자가 차단 / 혼잡 코를 가지고 있으며 생리가 삽입 후 anteriorly에서 실행중인 경우, 코를 풀다, 다시 조금 더 주사기를 삽입하고, 다시 더 필요한 경우 머리를 기울이십시오. NW는 연습을 더 좋아 지기만하는 기법이다. 목적은 최소 10 ML의 반환하도록 일부 볼륨은 일반적으로 손실됩니다. 지원자는 NW 동안 생리를 맛볼 수 있다면 뒤 nasopharynx와 oropharynx 사이의 연결이 적절하게 자원 봉사의 혀에 의해 폐쇄되지 않았습니다. 지원자는 제비 생리의 대부분을 경우, 입의 지붕에 대한 혀의 밀어를 강조 다시 절차를 설명합니다. 그런 다음 볼륨이 반환 증가의 절차를 반복합니다. NW는 substant가 포함 된 경우점액의 ial 양, 그것은 원심 분리 전에 제거하는 것이 가장 좋습니다. 소용돌이 점액에 바인딩 가능한 약간의 염분으로 제거하는 동안 다음 가능한 큰 조각을 제거 할 수 있습니다 아무것도 느슨하게을 줄 수있는만큼의 샘플. 미국의 이전 EHPC 연구가 안전하게 완료되며 불리한 이벤트 11이 없었다. EHPC 플랫폼의 지속적인 안전을 보장하기 위해, 우리는 연구 팀 24 시간 액세스를 기반으로하는 비상 프로토콜을 설정합니다. 자원 봉사자들이 하루의 연구 팀에 24 시간 액세스 할 수 있도록, 연락처 세부 정보를 제공하고 있습니다. 필요한 모든 의료은 로얄 리버풀 대학 병원에 제공됩니다. 보호의 추가 조치로서, 임상 및 연구 그룹 외부에서 과학자로 구성된 안전위원회는 주간 안전 보고서를받습니다. 이 보고서는 각 자원 봉사자가 접수 및 증상이나 질병이보고되었는지 여부를 세균 복용이 포함되어 있습니다. 이 보고서는 일의 안전을 할 수 있습니다전자 연구는 외부 바이어스없이 critiqued 할 수 있습니다. 안전위원회는 또한 비상 사태의 가능성이 행사에서 24 시간 사용할 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 이름 </td><td> 회사 </td><td> 고양이 # </td></tr><tr><td> 글리세린 </td><td> 어부 </td><td> G/0650/08 </td></tr><tr><td> 0.9 %의 나트륨 염화물 </td><td> B. 브라운 </td><td> 3627667 </td></tr><tr><td> 분유 탈지 </td><td> Fluka </td><td> 70,166 </td></tr><tr><td> Tryptone 콩 국물 </td><td> Becton 디킨슨 </td><td> 211768 </td></tr><tr><td> 포도당 </td><td> BDH </td><td> 284504S </td></tr><tr><td> chocolated 말 피와 컬럼비아 한천 </td><td> Oxoid </td><td> PB0124 </td></tr><tr><td> Pneumotest - 라텍스 키트 </td><td> Statens 세럼 문화원 </td><td> 51,823 </td></tr></tbody></table>

experimental human pneumococcal carriage

연쇄상 구균 pneumoniae의 nasopharyngeal 운송은 전송의 주요 소스 및 침입 질병의 전제 조건을 모두이기 때문에 실험 인간 폐렴 운송 (EHPC)은 과학적으로 중요합니다. 운송 모델은 보호 면역 상관 관계의 정확한 결정, 운송 immunizing 효과 nasopharyngeal 틈새에있는 병원균에 대한 호스트 압력의 영향을 수 있습니다. 또한, 백신 연구 등의 역학 연구에 유용한 운송 검출의 방법은, 비교할 수 있습니다. 목적 우리는 백신 유도 면역의 대리로 캐리지의 예방과 다운 선택 후보 소설 폐렴 백신에 사용될 수있는 안전하고 유용한 재현 방법입니다 EHPC 플랫폼을 개발하는 것을 목표로하고 있습니다. 이 EHPC와 carria에서 백신 보호의 근간이 메커니즘 후보 백신 및 설명 시험으로 작동합니다GE 1. 새로운 백신이 현재 백신이 아닌 bacteraemic 폐렴에 대한 최적의 보호를 부여하지 않는 한 긴급 필요 및 비 백신 serotypes 2-4로 혈청 형 교체의 증거가되었지만 pneumococcus에 대한 현재 켤레 백신은 침략 질병의 어린이를 보호합니다. 방법 우리는 S.와 예방 pneumoniae는 생리 100 μl에 일시 중지되었습니다. 안전 EHPC 모델의 개발에 중요한 요소이며 집중적 인 자원 봉사 검사 및 모니터링을 통해 달성된다. 임상 및 연구에서 독립적 과학자들로 구성된 안전위원회는 주 단위로 목표 피드백을 제공합니다. 세균 inoculum은 표준화되어 있으며 동물 제품은 자원 봉사자 (야채 기반 미디어 및 생리)에 주사하지 않습니다 필요합니다. 식민 (10 4 -10 5)에 필요한 복용이 훨씬 낮은 THA 아르N 그이 (10 7) 동물 모델에 5를 사용했습니다. 폐렴 운송을 검출하는 것은 무료로 상대적으로 점액이 코 세척은 (이상적으로&gt; 10 ML) 높은 볼륨에 의해 향상됩니다. 이 프로토콜은 차례 프로토콜의 가장 중요한 부분을 처리합니다. 이는 (a) 자원 봉사 선택, (B) 폐렴 inoculum 준비, (C) 접종 (D) 후속과 (E) 운송 감지합니다. 결과 현재 프로토콜은 두 개의 서로 다른 박테리아 serotypes 6을 사용하여 복용의 범위에서 100여 자원 봉사자에 안전했습니다. S.를 사용하여 용량 범위 연구 pneumoniae 6B와 23F는 현재 50 %의 운송을위한 최적의 접종 선량을 결정하기 위해 실시되고있다. 운송 예측 50 % 속도가 EHPC 모델은 작은 연구 번호가 백신 효능에 대한 높은 감도를 가지고 할 수 있습니다.

우리는 경험으로는, 35 pneumococcus를 탑재 한 중 1백59명을 inoculating 있습니다. 우리는 혈청 형 6B를 사용하여 운송을 달성 낮은 복용량은 최고 투여 량을 naris 당 313,000 CFU/100 μl이었고, naris 당 11,100 CFU/100 μl이었다. 우리는 혈청 형의 23F를 사용하여 운송을 달성 낮은 복용량은 최고 투여 량을 naris 당 84,500 CFU/100 μl이었고, naris 당 9,000 CFU/100 μl이었다. 운송 평가의 우리의 방법은 최근 연구 10 자원 봉사자의 91 %가 nasopharyngeal 면봉보다 더 편안하게 코 세척을 발견했다 때문에 선택한 코 세척입니다, 코 세척은 미생물 문화를 사용하여 병원균을 감지 할 가능성이 더 높습니다했다. NW로 주사 혈액 한천 플레이트에 복구 미생물 식물 읽기 변수 어려울 수 있습니다. Gentamicin는 pneumococcus에 대한 선택하려면 첫 번째 혈액 한천 플레이트에 사용됩니다. 초콜릿 한천 플레이트와 두 번째 혈액 한천 플레이트는 다른 잠재적 인 호흡기 경로를 검색하는 데 사용됩니다폐렴 식민지를 돕거나 방해 할 수 있습니다 ogens. 읽기 쉬운 NW와 주사 혈액 한천 플레이트의 예는 그림 1a에 표시되어, 식물의 다양한 종류를 포함하는 어려운 판은 그림 1b에 표시됩니다. 모든 일정 자원 봉사자에있는 상부 호흡기 증상을 설명하도록 요청되었다있는 경우, 그리고 통신 사업자 및 비 사업자 사이의 비교는 강조했다. 최근 pneumococcus과 주사 1백45명 중 28 증상 (표 1)의 불평을했다. 이 중 여덟 통신 사업자, 스무은 안했습니다. 가장 일반적인 증상은 비 특정 코 증상 (표 1)이었다. 발열 및 / 또는 불쾌 등의 전신 증상을가보고 된의 사건, 실시 조사 중 어느 것도 폐렴 질환 및 증상의 증거가 편도선염 중 하나 경우를 제외하고 동시 바이러스 감염과 일치했다 보여 주었다 없습니다. 두 폐렴 positiv전자 자원 봉사자는 항생제로 치료했다. 하나는 목이와 귀 통증을 호소하고, 연구 담당 의사와 만나고 후, 사전 예방 차원에서 항생제를하는 것이 좋습니다되었습니다. 다른 자원은 편도선염과 임상 진단했다. 모든 자원 봉사자 증상의 빠른 해결했다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/50115/50115fig1.jpg" /> 1 그림. 혈액 한천 플레이트는 NW에 주사. NW와 주사 혈액 한천 플레이트를 읽기 어려울 수 있습니다. 1a를 명확하게 볼 수 pneumococci과 읽기 쉬운 접시의 예입니다. 1B가 더 만들어 공동 colonizing 식물이 많은 접시입니다 pneumococci가있는 경우 감지 할 어렵다. <table border="1"><tbody><tr><td> 조짐 </td><td></td><td> 운송 (N = 32) </td><td> 어떤 운송 없음 (N = 112) </td></tr><tr><td> 모든조짐 </td><td></td><td> 24% </td><td> 18% </td></tr><tr><td> 조직 </td><td> 열 </td><td> 3퍼센트 </td><td> 4퍼센트 </td></tr><tr><td></td><td> 불쾌의 * </td><td> 9퍼센트 </td><td> 4퍼센트 </td></tr><tr><td> 지방의 </td><td> 귀를 </td><td> 9퍼센트 </td><td> 3퍼센트 </td></tr><tr><td></td><td> 코 </td><td> 0 </td><td> 10% </td></tr><tr><td></td><td> 목 </td><td> 12% </td><td> 3퍼센트 </td></tr></tbody></table> 표 1. 자원 봉사의 특성은 S. 다음과 같은 현상이보고 pneumoniae 6B 접종. 모든 불만이 전체 조사에 따라, 외부 안전위원회에 의해 검토되었고이 증상은 폐렴 질환에 기인 없습니다. 가장 일반적인 증상은 목이 있었다 코와 독감과 같은 질병을 박제.

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Experimental Human Pneumococcal Carriage

실험 인간 폐렴 운송은 운송 자연 모델과 백신 개발에 사용할 수있는 잠재적 인 모델을 제공합니다. 이 기술은 가치가 아직 복잡하고 인간에 병원균을 도입하여 임상 위험을 가지고 있습니다. 우리는 자세한 프로토콜을 개발했습니다.

실험 인간 폐렴의 운송

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major ...

Research

JoVE Journal

Medicine

15.3K 조회수.  Liverpool School of Tropical Medicine. 실험 인간 폐렴 운송은 운송 자연 모델과 백신 개발에 사용할 수있는 잠재적 인 모델을 제공합니다. 이 기술은 가치가 아직 복잡하고 인간에 병원균을 도입하여 임상 위험을 가지고 있습니다. 우리는 자세한 프로토콜을 개발했습니다.

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Experimental Metastasis Assay

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients. To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established using immunodeficient mice. This article delineates the procedures involved in this assay, including sample preparation, intravenous injection, and culturing cells from lung metastases. Briefly, a pre-determined number of human cancer cells were prepared in vitro and directly injected into the circulation of immunodeficient mice through their tail veins. A small number of cells survive the turbulence in the circulation and grow as metastases in internal organs, such as lung. The injected mice are dissected after a certain period. The tissue distribution of metastases is determined under a dissecting microscope. The number of metastases in a specific tissue is counted and it directly correlates with the metastatic ability of the injected cancer cells. The arisen metastases are isolated and cultured in vitro as cell lines, which often show enhanced metastatic abilities than the parental line when injected again into immunodeficient mice. These highly metastatic derivatives become useful tools for identifying genes or molecular pathways that regulate metastatic progression.

This article describes the procedures of an experimental metastasis assay that is used to determine the metastatic potential of human cancer cell lines.

실험 전이 분석

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients.  To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established ...

연구

의학

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of extracellular matrix (ECM) and a variety of mesenchymal cells, including fibroblasts, myofibroblasts, endothelial cells, pericytes and leukocytes 1-3.
The tumour-associated stroma is responsive to substantial paracrine signals released by neighbouring carcinoma cells. During the disease process, the stroma often becomes populated by carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) including large numbers of myofibroblasts. These cells have previously been extracted from many different types of human carcinomas for their in vitro culture. A subpopulation of CAFs is distinguishable through their up-regulation of &alpha;-smooth muscle actin (&alpha;-SMA) expression4,5. These cells are a hallmark of 'activated fibroblasts' that share similar properties with myofibroblasts commonly observed in injured and fibrotic tissues 6. The presence of this myofibroblastic CAF subset is highly related to high-grade malignancies and associated with poor prognoses in patients.
Many laboratories, including our own, have shown that CAFs, when injected with carcinoma cells into immunodeficient mice, are capable of substantially promoting tumourigenesis 7-10. CAFs prepared from carcinoma patients, however, frequently undergo senescence during propagation in culture limiting the extensiveness of their use throughout ongoing experimentation. To overcome this difficulty, we developed a novel technique to experimentally generate immortalised human mammary CAF cell lines (exp-CAFs) from human mammary fibroblasts, using a coimplantation breast tumour xenograft model.
In order to generate exp-CAFs, parental human mammary fibroblasts, obtained from the reduction mammoplasty tissue, were first immortalised with hTERT, the catalytic subunit of the telomerase holoenzyme, and engineered to express GFP and a puromycin resistance gene. These cells were coimplanted with MCF-7 human breast carcinoma cells expressing an activated ras oncogene (MCF-7-ras cells) into a mouse xenograft. After a period of incubation in vivo, the initially injected human mammary fibroblasts were extracted from the tumour xenografts on the basis of their puromycin resistance 11.
We observed that the resident human mammary fibroblasts have differentiated, adopting a myofibroblastic phenotype and acquired tumour-promoting properties during the course of tumour progression. Importantly, these cells, defined as exp-CAFs, closely mimic the tumour-promoting myofibroblastic phenotype of CAFs isolated from breast carcinomas dissected from patients. Our tumour xenograft-derived exp-CAFs therefore provide an effective model to study the biology of CAFs in human breast carcinomas. The described protocol may also be extended for generating and characterising various CAF populations derived from other types of human carcinomas.

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) rich in myofibroblasts present within the tumour stroma, play a major role in driving tumour progression. We developed a coimplantation tumour xengraft model for experimentally generating CAFs from human mammary fibroblasts. The protocol describes how to establish CAF myofibroblasts that acquire an ability to promote tumourigenesis.

인간 Mammary 섬유아 세포에서 암종 - 관련 섬유아 세포의 실험 세대 (CAFs)

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and finding new sources for implantable cells are the focus of recent research4,5. Investigating the effectiveness of cell therapies is not an easy task and new tools are needed to investigate the mechanisms involved in the treatment process6. We designed an experimental protocol of ischemia/reperfusion in order to allow the observation of cellular connections and even subcellular mechanisms during ischemia/reperfusion injury and after stem cell transplantation and to evaluate the efficacy of cell therapy. H9c2 cardiomyoblast cells were placed onto cell culture plates7,8. Ischemia was simulated with 150 minutes in a glucose free medium with oxygen level below 0.5%. Then, normal media and oxygen levels were reintroduced to simulate reperfusion. After oxygen glucose deprivation, the damaged cells were treated with transplantation of labeled human bone marrow derived mesenchymal stem cells by adding them to the culture. Mesenchymal stem cells are preferred in clinical trials because they are easily accessible with minimal invasive surgery, easily expandable and autologous. After 24 hours of co-cultivation, cells were stained with calcein and ethidium-homodimer to differentiate between live and dead cells. This setup allowed us to investigate the intercellular connections using confocal fluorescent microscopy and to quantify the survival rate of postischemic cells by flow cytometry. Confocal microscopy showed the interactions of the two cell populations such as cell fusion and formation of intercellular nanotubes. Flow cytometry analysis revealed 3 clusters of damaged cells which can be plotted on a graph and analyzed statistically. These populations can be investigated separately and conclusions can be drawn on these data on the effectiveness of the simulated therapeutical approach.

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

We demonstrate how to set up an in vitro ischemia/reperfusion model and how to evaluate the effect of stem cell therapy on postischemic cardiac cells.

에서 간세포 이식 체외에서 시뮬레이션 국소 빈혈 / Reperfusion 모델

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and membrane ion currents. Those changes are likely&#160;to be responsible for the increased arrhythmogenic risk and the contractile alterations leading to systolic and diastolic dysfunction in cardiac patients. However, most information on the alterations of myocyte function in cardiac diseases has come from animal models.
Here we describe and validate a protocol to isolate viable myocytes from small surgical samples of ventricular myocardium from patients undergoing cardiac surgery operations. The protocol is described in detail. Electrophysiological and intracellular calcium measurements are reported to demonstrate the feasibility of a number of single cell measurements in human ventricular cardiomyocytes obtained with this method.
The protocol reported here can be useful for future investigations of the cellular and molecular basis of functional alterations of the human heart in the presence of different cardiac diseases. Further, this method can be used to identify novel therapeutic targets at cellular level and to test the effectiveness of new compounds on human cardiomyocytes, with direct translational value.

Current knowledge on the cellular basis of cardiac diseases mostly relies on studies on animal models. Here we describe and validate a novel method to obtain single viable cardiomyocytes from small surgical samples of human ventricular myocardium. Human ventricular myocytes can be used for electrophysiological studies and drug testing.

신선한 수술 샘플에서 분리 및 인간의 심실 심근 기능 특성

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal hyperplasia (IH) that eventually leads to vessel occlusion and graft failure. Mechanical forces, particularly low shear stress and high wall tension, are thought to initiate and to sustain these cellular and molecular changes, but their exact contribution remains to be unraveled. To selectively evaluate the role of pressure and shear stress on the biology of IH, an ex&#160;vivo perfusion system (EVPS) was created to perfuse segments of human saphenous veins under arterial regimen (high shear stress and high pressure). Further technical innovations allowed the simultaneous perfusion of two segments from the same vein, one reinforced with an external mesh. Veins were harvested using a no-touch technique and immediately transferred to the laboratory for assembly in the EVPS. One segment of the freshly isolated vein was not perfused (control, day 0). The two others segments were perfused for up to 7 days, one being completely sheltered with a 4 mm (diameter) external mesh. The pressure, flow velocity, and pulse rate were continuously monitored and adjusted to mimic the hemodynamic conditions prevailing in the femoral artery. Upon completion of the perfusion, veins were dismounted and used for histological and molecular analysis. Under ex&#160;vivo conditions, high pressure perfusion (arterial, mean = 100 mm Hg) is sufficient to generate IH and remodeling of human veins. These alterations are reduced in the presence of an external polyester mesh.

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

The mechanisms leading to the development of intimal hyperplasia (IH) and vein graft failure are still poorly understood. This study describes an ex&#160;vivo system to perfuse human veins under controlled flow and pressure. Furthermore the efficiency of external mesh reinforcement to limit the development of IH was evaluated.

인간 복재 정맥 절차<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 관류 및 외부 보강

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

<em&gt; 생체 내</em&gt; 모델은 인간의 유방암에서 호르몬 행동을 연구하기 위해

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one step treatments for acute and chronic skin lesions. Moreover, the management of chronic but also acute wounds resulting from trauma, diabetes, infections and other causes, remains challenging. In this study we describe a new method to create autologous micro-grafts from cutaneous tissue of a single patient and their clinical application. Moreover, in vitro biological characterization of cutaneous tissue derived from skin, de-epidermized dermis (Ded) and dermis of multi-organ and/or multi-tissue donors was also performed. All tissues were disaggregated by this new protocol, allowing us to obtain viable micro-grafts. In particular, we reported that this innovative protocol is able to create bio-complexes composed by autologous micro-grafts and collagen sponges ready to be applied on skin lesions. The clinical application of autologous bio-complexes on a leg lesion was also reported, showing an improvement of both re-epitalization process and softness of the lesion. Additionally, our in vitro model showed that cell viability after mechanical disaggregation with this system is maintained over time for up to seven (7) days of culture. We also observed, by flow cytometry analysis, that the pool of cells obtained from disaggregation is composed of several cell types, including mesenchymal stem cells, that exert a key role in the processes of tissue regeneration and repair, for their high regenerative potential. Finally, we demonstrated in vitro that this procedure maintains the sterility of micro-grafts when cultured in Agar dishes. In summary, we conclude that this new regenerative approach can be a promising tool for clinicians to obtain in one step viable, sterile and ready to use micro-grafts that can be applied alone or in combination with most common biological scaffolds.

The protocol describes a new method to disaggregate human tissues and to create autologous micro-grafts that, combined with collagen sponges, give rise to human bio-complexes ready to use in the treatment of skin lesions. Further, this system preserves cell viability of micro-grafts at different times after mechanical disaggregation.

피부 마이크로 이식 세대를위한 새로운 세분화 방법 후 조직 특성

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

인간의 뇌하수체 선종 세포의 3 차원 알긴산 비드 문화

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Ultrasonography in Experimental Reproductive Investigations on Rats

With the development of assisted reproductive technology and the ethical limitations of research on humans, rat animal models have been widely used in reproductive medicine. In the past, the study of reproductive system development in rodents has been based on one-time histological examination of excised tissues. Recently, with the development of high-resolution transabdominal ultrasound, high-quality sonography can now be performed to evaluate the reproductive organs of rats, allowing a new method for studying the reproductive system. Images were obtained using a high-resolution ultrasonographic system. Gynecological ultrasonography was performed on 28 eight-week-old non-pregnant rats and 5 pregnant Sprague-Dawley rats. We describe how to recognize organs of the reproductive system and associated structures in typical views during different phases of the estrus cycle. Color flow Doppler was used to measure uterine artery blood flow and evaluate uterine blood flow pattern changes during different stages of pregnancy. We have demonstrated that ultrasound exploration is a useful method for evaluating changes in internal reproductive organs. Its use raises the possibility of conducting additional experiments, including medical or surgical procedures, and provides the ability to monitor sonographic changes to internal organs without sacrificing animals.

This manuscript describes the utility of ultrasound performed on female rats to design experimental models for reproductive and gynecological investigation. A step-by-step explanation of how to perform ultrasonographic evaluation is shown.

초음파에 쥐 실험 생식 조사에

With the development of assisted reproductive technology and the ethical limitations of research on humans, rat animal models have been widely used in ...

Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an attractive therapeutic target in the clinical management of affected patients. In order to further optimize strategies aiming at therapeutic regulation of pathologically imbalanced tissue infiltration of pro-inflammatory immune cells, it will be of particular importance to achieve improved insights into disease- and organ-specific homing properties of peripheral lymphocytes. The here described experimental protocol allows to monitor lung accumulation of fluorescently labeled and adoptively transferred human lymphocytes in the context of papain-induced pulmonary inflammation. In contrast to standard in vitro assays frequently used for the analysis of immune cell migration and chemotaxis, the now introduced in vivo setting takes into account lung-specific aspects of tissue organization and the influence of the complex inflammatory scenario taking place in the living murine organism. Moreover, three-dimensional cross-sectional light-sheet fluorescence microscopic imaging does not only provide quantitative data on infiltrating immune cells, but also depicts the pattern of immune cell localization within the inflamed lung. Overall, we are able to introduce an innovative technique of high value for immunological research in the field of chronic inflammatory lung diseases, which can be easily applied by following the provided step-by-step protocol.

The here introduced protocol allows characterization of the lung homing capacity of primary human lymphocytes under in vivo inflammatory conditions. Pulmonary infiltration of adoptively transferred human immune cells in a mouse model of allergic inflammation can be imaged and quantified by light-sheet fluorescence microscopy of chemically cleared lung tissue.