이 체외 노출 시스템을 사용하여 ALI에서 경작된 인간 폐 세포를 노출시킴으로써 급성 폐 세포 독성에 관한 공중 입자의 검사는 동물 실험을 줄이는 데 도움이 될 수 있다. 이러한 노출 시스템의 주요 장점은 세포상에 균질분포및 입자의 위치를 이끌어 내는 방사형 에어로졸 분포 개념이다. 세포를 파종하기 전에 6 개의 웰 플레이트의 각 웰에 2.5 밀리리터의 강화 된 성장 매체를 추가하십시오.
세포 배양 물기를 우물 내부에 조심스럽게 배치하고 모든 세포 배양 삽입에 성장 배지 1 밀리리터를 추가합니다. 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 30분간 배양합니다. 세포의 트립시화 후, 10 밀리리터의 등산화용액으로 채워진 컵에 세포 배양 현탁액의 100 마이크로리터를 희석시한다.
흔들리지 않고 컵을 천천히 기울이는다. 세포 카운터에서, A549 세포의 세포 특이적 측정 파라미터를 기반으로 밀리리터 당 가능한 세포 및 세포 생존가능성을 결정한다. 플레이트의 템퍼링 후, 각 세포 배양물에서 밀리리터당 3배 10의 밀도를 가진 A549 세포의 세포 배양 삽입 및 종자 1밀리리터 내의 배지를 흡인한다.
부드러운 흔들림으로 세포 현탁액을 분배하고 24 시간 동안 배양하십시오. 프레스 의 전면에 시간 제어를 통해 프레스 시간을 설정합니다. 압축 공기 밸브에서 압축 공기 공급을 엽니다.
프레스 의 전면에 압력 레귤레이터를 사용하여 압축 공기 압력을 약 2 개의 막대로 설정합니다. 서랍을 꺼내 누르기 버튼을 누르고 디지털 압력 스위치의 압박을 읽습니다. 소량의 시험 물질로 물질 용기를 채웁니다.
플런저를 물질 용기에 삽입하고 약간 앞뒤로 돌려 용기에 분말을 고르게 분배합니다. 플런저를 장착한 물질 용기를 서랍에 넣고 누기 버튼을 누릅니다. 서랍을 열고 플런저를 제거합니다.
중요한 단계는 안정적인 미립자 노출을 가능하게하기 위해 물질 용기 내의 분말 케이크로 특별히 압축되어야하는 테스트 물질의 압박입니다. 에어로졸 안내 모듈에서 입구 어댑터와 응축수 반사판을 제거합니다. 에어로졸 안내 모듈의 에어로졸 먹이 보어 3개를 플러그와 더미 플랩으로 샘플링 모듈의 중간 공급 연결으로 닫습니다.
에어로졸 가이딩 모듈의 튜브 커넥터와 진공 선을 연결합니다. 핸드 휠을 사용하여 모듈을 닫고 유량 컨트롤러의 값을 측정합니다. 닫은 후 몇 분 후에 값은 분당 5 밀리리터 미만으로 감소합니다.
에어로졸 생성기 소프트웨어를 시작합니다. 물질 스크레이퍼가 가장 낮은 위치에 있지 않은 경우 버튼 호밍 모드를 누릅니다. 압착 된 테스트 재료로 물질 용기를 물질 스크레이퍼 위에 거꾸로 놓습니다.
물질 용기의 유리가 전면에 직면하도록 하십시오. 잠금 플레이트를 슬롯에 놓고 물질 용기 위에 놓고 검은 나사를 조입니다. 피드 및 회전값을 원하는 설정으로 변경합니다.
아래쪽 화살표를 사용하여 물질 스크레이퍼가 압착 물질 근처에 될 때까지 물질 용기와 함께 슬라이드를 밀어 넣습니다. 압축 공기 공급 장치를 질량 흐름 컨트롤러를 탭하여 에어로졸 발전기로 열고 시작 버튼을 클릭하여 에어로졸 생성을 시작합니다. 긴 대기 시간을 피하기 위해 시간당 공급 속도를 15~20mm로 설정합니다.
용유리튜브 의 유리튜브 뒤에서 작은 손전등으로 미세먼지 구름을 관찰하여 올바른 입자 생성을 제어한다. 중간 공급에 예열된 노출 매체로 시작하고 모듈이 열려 있는 동안 다운파이프가 덮일 때까지 샘플링 모듈을 채웁니다. 블라인드 셀 배양 삽입을 노출 모듈에 삽입하고, 하부 파이프가 매체로 덮여 있고 인서츠의 하부가 매체와 접촉할 때까지 노출 매체를 아래로 펌핑한다.
에어로졸 발전기를 시작하고, 노출 모듈을 닫고, 에어로졸 발전기의 노출 모듈 콘센트에 노출 모듈을 연결한다. 리드 타임 후 30분 후, 용류기의 노출 모듈 콘센트를 고무 플러그로 밀봉하고 블라인드 인서트를 제거합니다. 다운파이프가 매체로 덮일 때까지 노출 매체를 다시 채웁니다.
핀셋의 도움으로 6 개의 우물 플레이트에서 세포 배양 삽입을 제거합니다. 인서트를 덮어 세포 배양으로부터 조심스럽게 성장 배지를 붓고 파이펫을 사용하여 잔류 액체를 흡인하고 폐기합니다. 노출 및 청정 공기 모듈의 노출 챔버에 인서트를 배치합니다.
에어로졸 발전기의 노출 모듈 콘센트와 청정 공기 모듈을 캐리어 가스 공급에 동시에 연결하여 모듈을 닫고 노출 실험을 시작합니다. 실험을 완료한 후, 노출 및 깨끗한 공기 모듈을 분리하고 노출 모듈 콘센트를 밀봉합니다. 정지 버튼을 클릭하여 압축 공기 공급 장치와 에어로졸 생성기를 중지합니다.
노출 및 깨끗한 공기 모듈을 열고 핀셋을 사용하여 셀 배양 인서트를 준비된 인큐베이션 6개의 웰 플레이트로 전송합니다. 6개의 웰 플레이트와 노출되지 않은 세포 배양 인서트에 24시간 동안 37도, 공기 액상 인터페이스에서 이산화탄소 5%를 배양합니다. 노출 후 24시간, 새로운 준비된 6개의 웰 플레이트에 세포 배양 인서트를 삽입한다.
각 세포 배양 삽입에 신선한 준비된 WST1 용액1밀리리터를 추가합니다. 용액을 세포에 균일하게 분배하기 위해 플레이트를 조심스럽게 흔들어 주세요. 세포 배양 인서트와 함께 6 개의 우물 플레이트를 섭씨 37도및 이산화탄소 5 %에서 1 시간 동안 배양하십시오.
그 후, 6개의 웰 플레이트에서 96웰 플레이트로 세쌍둥이의 100마이크로리터를 세쌍둥이로 옮기다. 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 기준 파장 650나노미터로 450나노미터의 흡광도를 측정합니다. CULTEX RFS는 특수 설계된 모듈식 시험관 내 노출 시스템으로 공기 액체 인터페이스에서 공기 중 입자에 직접 적이고 균일하게 노출될 수 있습니다.
깨끗한 공기에 세포의 노출은 시간이 지남에 따라 세포 생존의 감소로 이어질. 노출 시스템은 성공적으로 검증되고 테스트된 화합물의 급성 흡입 위험에 대한 예측 모델로 확립되었다. A549 세포의 노출은 아니, 매체, 또는 강한 독성을 전시 하는 다른 테스트 물질에 세포.
잠복기, 미립자 발생의 리드 타임, 미립자 증착 시간인 시간 프레임을 엄격하게 보관하십시오. 이러한 노출 방법은 주로 세포의 미립자 노출을 위해 설계되었지만 에어로졸 생성 방법을 적용하여 액체 에어로졸 및 가스의 노출로 확장될 수 있다. 이 스크리닝 방법은 시험관 내급성 흡입 독성에 관한 흡입 가능한 입자의 질적 평가를 가능하게 하여 일반적으로 이러한 독성 평가를 제공하는 동물 실험을 감소시킵니다.
독성 테스트 물질로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 장갑, 마스크를 착용하는 것과 같은 예방 조치는 그러한 화합물을 취급할 때 항상 취해야 합니다.
