우리는 중요한 의견과 매일 문제 해결 photobleaching 실험, 특히 Meshorer 연구실의 구성원, 샤이 Melcer, 안녕 Alajem, Edupuganti Raghu RAM, Badi 스리랑카 Sailaja, 애나 Mattout 및 알바 비란 감사드립니다. EM은 조셉 H. 및 벨 R. 브라운은 생명 과학의 수석 강사이며, 이스라엘 과학 재단 (ISF 943/09), 건강의 이스라엘 교육부 (6007) 유럽 연합 (IRG - 206872 및 238176)에 의해 지원됩니다 이스라엘 암 연구 재단, 히브리어 대학과 이스라엘 Psychobiology 연구소의 내부 Applicative 의료 기금.

1. ES 세포를 도금 T = 0 시간 MEF 도금 <ol><li> 문장 라이브 영상 μ - 슬라이드 8 자 (ibidi, 뮌헨, 독일) 젤라틴이나 chambered 커버 안경에서 (연구실 - 테크, 로체스터, NY) 또는 유리 바닥 문화 요리 (MatTek, 애쉬, MA). 50-30 분두고 무료 젤라틴 멀리 대기음. </li><li> 시드 22,000 MEFs / 잘 DMEM 250 μl 총 볼륨의 [10% 태아 소 혈청 (FBS)와 보충]. 세포 조직 문화 인큐베이터 (37 ° C 5 % CO2)의 성장을 허용합니다. </li></ol> T는 = 6 시간 ES 세포 도금 <ol start="3"><li> 기음 DMEM. </li><li> 종자는 / 잘 ES 세포 미디어 250 μl 총 판매량 15,000 R1 세포와 잘 코팅 각 MEF은 [​​10% ESC 등급 태아 소 혈청 (FBS), 1 MM 나트륨 pyruvate, 0.1 MM 불필요한 아미노산, 0.1 MM의 β -와 보충 메르 캅 토 에탄올, 1000 U / ML 백혈병 억제 인자 (난생)], 다음날 30 % 50% 합류를 얻을 수 있습니다. </li></ol> 2. ES 세포 Transfecting T는 = 24 시간 과도 transfection <ol><li> 250와 함께 μl / 잘 신선한 ES 세포 미디어의 ES 세포 미디어를 교체합니다. </li><li> 1.5 ML 멸균 시험관에서, 100 μl 혈청 무료 미디어 [Opti - 멤 (Gibco)] 후 바로 혈청을 무료로 미디어에 10 μl 대중 교통 - LT1 transfection 시약 (Mirus)을 추가를 추가합니다. 부드러운 pipetting으로 혼합하고 50-20 분 실온에서 알을 품다. </li><li> 1.5 μg의 GFP 융합 플라스미드 DNA (H1e, H1o 또는 HP1) 희석을 통과 - LT1 시약을 추가합니다. 부드러운 pipetting으로 혼합하고 15-30 분 실온에서 알을 품다. </li><li> / 잘 transfection 혼합물의 13.5 μl를 추가합니다. 소용돌이는 μ - 슬라이드 8 - 음도 분산을 위해. 24 시간 신선한 ES 세포 미디어 250 μl로 이전 ES 세포 미디어를 교체 후. </li></ol> 3. FRAP 및 뒤집기 공연 T는 = 48-72 시간 <ol><li> 실험이 어떤 공촛점 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM)에서 수행할 수 있지만 정상 FRAP / 플립 실험 이후, 많은 연속 이미지를 찾았습니다, 그것은 수집 속도를 수있는 회전 디스크 공촛점 현미경을 사용하는 것이 좋습니다 그리고 보장이란 말야 표백 바람직하지 않은 샘플의 초기 의도 표백 이벤트 다음 발생합니다. 여기, 우리는 요코 CSU - X 회전 디스크 헤드와 디스크 공촛점 시스템 (www.Andor.com)을 돌고있는 혁명를 사용하는 것이 좋습니다. 이 시스템은 포인트 스캐닝 시스템을 갖춘 전문 FRAPPA 모듈을 사용하여 photobleach 수있는 듀얼 용량을 가지고 있으며, 빠르게 회전하는 디스크를 사용하여 이미지를 수집하기 위해 빛을 다시 전환할 수 있습니다. 실험을 photobleaching에 사용되는 가장 일반적인 세​​ fluorescing 단백질은 GFP, YFP 체리입니다. GFP 또는 YFP를 사용하는 경우, ~ 488 nm의 레이저가 필요합니다. 체리 들어, ~ 560 nm의 레이저를 사용합니다. 모든 경우에, 우리는 고체 레이저를 사용하는 것이 좋습니다. 자동 무대를 갖는 것은 유용하지만, 필요하지 않습니다. 라이브 세포가 몇 군데 있기 때문에, 그것 (우리가 LIS에서 하나를 사용하여, 스위스) 환경 챔버를 사용하는 데 필수적이며, 제어 산소, ​​습도, CO 2 및 온도. FRAP는 영상이 필요한 최소한의 레이저 전원 (일반적으로 형광 수준이 적합 10 % 지역에)로 이루어집니다 동안 최대의 레이저 강도를 사용하여 수행됩니다. 적절한 파장의 형광으로 세포를 관찰하고 60X 기름 침지 렌즈를 사용하여 GFP를 표현하는 셀을 선택합니다. 올바른 subcellular 분포를 확인하십시오. 때때로 표현 수준이 너무 높은 경우, 단백질의 지방화는 nucleolus 다른 구획에 &#39;유출&#39;수 있습니다. 이러한 세포가 선택되지 않습니다. </li><li> 지금 이미징 프로토콜을 설정 euchromatin 또는 heterochromatin (응축 GFP foci로 볼)에 다음 photobleaching 전에 photobleach 3-5 프레임을 수집하고 MS 250-1000 간격으로 photobleach 후 90-120 프레임을 수집 H1e - GFP, 1000 MS, H1o 및 HP1 - GFP, 250 MS (간격 시간 변경이 매우 역동적인 단백질은 짧은 간격 시간을 필요로하는 단백질 역학에 따라). 우리는 일반적으로 20-40 μseconds (1-2 반복)의 레이저 펄스와 photobleaching에 대한 80~100% 레이저 강도를 사용하지만,이 숫자는 분석 단백질과 표현 수준에 따라 변경할 수 있습니다. photobleaching 적절한 때, 당신은 GFP의 형광의 &quot;블랙홀&quot;을 준수해야합니다. 블랙홀은 점차 형광 다음과 같은 복구와 함께 다시 채워집니다. 회전 디스크가 초당 60 주변 이미지 (하나의 휴대폰으로 확대하면 좋은 형광 강도와)까지 얻을 수 있지만, 우리는 낮은 이미지 품질과 잠재력을 증가 phototoxicity로 인해 이러한 높은 속도로 시스템을 사용하지 않는 것이 좋습니다. </li><li> 플립 실험, 다른 영상 프로토콜을 설정 : 이미지를 수집하는 동안 같은 자리에서 표백 반복 시작 후, 표백하기 전에 3-5 프레임을 수집합니다. H1o - GFP, 표백을 위해 H1e - GFP, 표백제 매 5 초마다 2 초, 그리고 HP1 - GFP 표백마다 1 초하십시오. 블리치D 전체 실험에​​ 걸쳐 반복적으로 이미지를 수집합니다. </li><li> 두 기법, 20-30 세포의 과정을 반복합니다. 통계 목적, 선호 다른 일에 실험을 3 회 이상 반복합니다. 동질적인 인구와 올바른 설정, 표준 편차는 (&lt;5 %) 일반적으로 낮습니다. FRAP 및 뒤집기 모두 들어, 표백 영역의 크기와 모양은 복구 역학에 영향을 미칩니다 및 실험 시간 상수 있어야합니다. 또한, 두 세포와 비교하는 경우, 동일한 프로토콜을 사용해야하며 전지는 전력 레이저 및 기타 조건이 변동될 수 있으며 실험의 결과에 영향을 미칠 수 있으므로 당일에 순차적으로 분석해야합니다. </li></ol> 4. FRAP 및 뒤집기 데이터 분석 <ol><li> 모든 FRAP 프레임이 수집에서는,의 형광 강도를 측정하는 ROI (투자 수익 (ROI) B = 표백 지역), 배경 영역 (ROI BG), 그리고 전에 시간의 함수로하고 표백 후 비 표백 핵 영역 (ROI NB). 표백 영역이 무시할 때 전체 핵이 정상화 목적으로 선택할 수 있습니다. </li><li> / (ROI NB - 투자 수익 (ROI) BG) - (ROI BG 투자 수익 (ROI) B) / (pbROI B - pbROI BG) / (pbROI NB - pbROI BG), PB 사전 표백 나타냅니다 : 매주 시점 들어, 수식에 따라 데이터를 정상화. 사전 표백 이미지 당신은 약 1의 값을 얻을 것입니다. 표백제 후 첫 번째 이미지는 블리치 깊이를 나타냅니다. 실제 블리치 깊이 값을 1에서 값을 뺍니다. 모든 세포와 각 실험에서 평균 20-30 전지 반복합니다. </li><li> 수집된 모든 플립 프레임에서 (ROI NB = 비 표백 지역, 투자 수익 (ROI) BG = 배경) 이외의 표백 핵 영역에서 형광 강도, 그리고 배경 영역을 측정합니다. 플립 데이터의 계산은 FRAP 곡선과 유사합니다, 오직 분석 ROI (투자 수익 (ROI) NB)는 계산에 사용되지 않은 실제 표백 지역 다를되어야합니다 (ROI NB - 투자 수익 (ROI) BG) / (pbROI NB - pbROI BG) . 그것은 정규화의 목적 이웃 셀 (ROI N = 이웃 세포)를 사용하는 것도 가능합니다 : (ROI NB - 투자 수익 (ROI) BG) / (ROI N - 투자 수익 (ROI) BG) / (pbROI NB - pbROI BG) / (pbROI N - pbROI BG ). 데이터 수집에 따라, 그것은 컴퓨터 시뮬레이션으로 실험 데이터를 맞게 수 있습니다. 이것은 좋은 근접, 모바일 분수, 고정되어 분수와 반 최대와 계산할 수 있습니다. 우리는 여기서 FRAP 분석의 수학 및 통계 측면을 토론하고 다른 훌륭한 출판물 4-9로 독자를 참조하지 않습니다. 표백 깊이는 사전 표백제 (100 %) 신호 및 표백 후 첫 이미지 사이의 거리 (Y - 축)에를 말합니다, 모바일 분율은 표백제 깊이와 사이의 거리 (Y - 축)에를 말합니다 복구 신호를 반응 속도론은 고원을 도달하고, 고정되어 분수가 회복 신호와 사전 표백제 (100 %) 신호 사이의 거리 (Y 축)에 (인물 1B와 2B 참조)을 말합 때. 이 분석 외에도, 데이터에 맞는 좋은 수학적 모델이 있습니다. 단일 지수, 방정식에 대한  <img src="/files/ftp_upload/2696/eq0.jpg" alt="방정식" width="80" /> t 시간이 어디에 있는지, A는 1 - A는 모바일 분수입니다 고정되어 분수이며, K는 해제 상수 분리이며, 데이터에 맞게 사용할 수 있으며, 바인딩의에서 속도의 직접적인 추정 (K 해제)는 수 뿐만 아니라 협회 속도를 계산하는 데 사용할 수있는 매개 변수에 대해, 취득. </li></ol> 5. 대표 결과 : <img src="/files/ftp_upload/2696/2696fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. A와 HP1 (왼쪽), H1o (가운데)과 R1 ES 세포에서 H1e (오른쪽)의 B 쇼 대표 FRAP 곡선. 단순하고 명확 그림에 대한 1A는 정상화하고 계산 전에 단세포의 원시 데이터를 보여줍니다. 노란색 곡선은 표백 지역에 해당하는, 보라색 커브가 아닌 표백 핵 영역 (표백 영역이 무시할 때 전체 핵이 정상화의 목적으로 선택할 수 있습니다)에 해당하고, 빨간색 라인은 배경 형광에 해당 이 경우 최소한. 수직 화살표는 표백제 시간을 나타냅니다. 정규와 평균 데이터는 그림 1B에 표시됩니다. HP1 (적색)와 비교 H1 (파란색)의 느린 복구를합니다. 또한 H1e 변종 (진한 파란색)은 H1o 변종 (하늘색)보다 느립니다. 모바일 및 고정되어 분수와 블리치 깊이가 HP1에 대해 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2696/2696fig2.jpg" alt="그림 2" /> 2. A와 B를 비교 euchromatin 쇼 대표 FRAP 곡선 (그림R1의 ES 세포의 HP1의 heterochromatin (오른쪽)와 함께) 떠났다. 마찬가지로 1 그림, 그림 2A는 단일 세포의 원시 데이터를 보여줍니다, 노란색 곡선은 표백 지역에 해당하는, 보라색 커브가 아닌 표백 핵 영역에 해당하고, 빨간색 선은 배경 형광에 해당합니다. 수직 화살표는 표백제 시간을 나타냅니다. 정규와 평균 데이터는 그림 2B에 표시됩니다. euchromatin (조명 적색)와 비교 heterochromatin (어두운 빨강)의 느린 복구를합니다. 모바일 및 고정되어 분수와 블리치 깊이는 euchromatin에 대해 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2696/2696fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3.. H1o R1 ES 세포의 전형적인 플립 실험은 그림 3A (원료, 취소 정규화된 데이터)와 B (정규 및 평균 데이터)에 표시됩니다. 본 실험에서는 자주색 곡선이 아닌 표백 핵 영역에 해당하는, 녹색 라인은 이웃 세포 핵에 해당하며 빨간색 선은 배경 형광에 해당합니다.

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	<li>Phair, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+nature+of+dynamic+protein-chromatin+interactions+in+vivo:+three-dimensional+genome+scanning+and+dynamic+interaction+networks+of+chromatin+proteins.">Global nature of dynamic protein-chromatin interactions in vivo: three-dimensional genome scanning and dynamic interaction networks of chromatin proteins.</a> Mol Cell Biol. 24, 6393-6402 (2004).</li><li>Meshorer, E., Girard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Imaging chromatin in embyonic stem cells in StemBook. , (2008).</li><li>Meshorer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperdynamic+plasticity+of+chromatin+proteins+in+pluripotent+embryonic+stem+cells.">Hyperdynamic plasticity of chromatin proteins in pluripotent embryonic stem cells.</a> Dev Cell. 10, 105-116 (2006).</li><li>Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, photoactivation, photo conversion, and FLIP. , (2009).</li><li>Dundr, M., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+dynamics+of+nuclear+proteins+by+photobleaching.">Measuring dynamics of nuclear proteins by photobleaching.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 13, Unit 13-Unit 13 (2003).</li><li>Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+membrane+dynamics+and+reassembly+in+living+cells:+targeting+of+an+inner+nuclear+membrane+protein+in+interphase+and+mitosis.">Nuclear membrane dynamics and reassembly in living cells: targeting of an inner nuclear membrane protein in interphase and mitosis.</a> J Cell Biol. 138, 1193-1206 (1997).</li><li>Lenser, T., Weisshart, K., Ulbricht, T., Klement, K., Hemmerich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+fluctuation+microscopy+to+reveal+3D+architecture+and+function+in+the+cell+nucleus.">Fluorescence fluctuation microscopy to reveal 3D architecture and function in the cell nucleus.</a> Methods Cell Biol. 98, 2-33 (2010).</li><li>Mueller, F., Mazza, D., Stasevich, T. J., McNally, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRAP+and+kinetic+modeling+in+the+analysis+of+nuclear+protein+dynamics:+what+do+we+really+know.">FRAP and kinetic modeling in the analysis of nuclear protein dynamics: what do we really know.</a> Curr Opin Cell Biol. 22, 403-411 (2010).</li><li>Phair, R. D., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+modelling+approaches+to+in+vivo+imaging.">Kinetic modelling approaches to in vivo imaging.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 898-907 (2001).</li><li>Poser, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAC+TransgeneOmics:+a+high-throughput+method+for+exploration+of+protein+function+in+mammals.">BAC TransgeneOmics: a high-throughput method for exploration of protein function in mammals.</a> Nat Methods. 5, 409-415 (2008).</li><li>Sigal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+fluorescently+labeled+endogenous+protein+library+in+living+human+cells.">Generation of a fluorescently labeled endogenous protein library in living human cells.</a> Nat Protoc. 2, 1515-1527 (2007).</li><li>Cohen, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+proteomics+of+individual+cancer+cells+in+response+to+a+drug.">Dynamic proteomics of individual cancer cells in response to a drug.</a> Science. 322, 1511-1516 (2008).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

세포 집단 또는 고정 세포, FRAP 실험에서 정화 염색질을 포함 대부분의 사용 가능한 기술과 달리 살아있는 세포에서 염색질 단백질 역학의 변화를 따릅니다. 우리는 염색질 단백질 역학 염색질 소성 좋은 지표가된다는 것을 발견. 그러나, 그것이 융합에게 GFP와 관심의 유전자를 필요로하기 때문에, 형광 태그의 추가는 단백질의 기능을 방해할 수 있습니다. 따라서, 사전 FRAP 진행하는 융합 단백질?...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th></tr><tr><td> DMEM </td><td> 시그마 </td><td> D5671 </td></tr><tr><td> 젤라틴 </td><td> 머크 </td><td> 1.04078 </td></tr><tr><td> Opti - 멤 </td><td> Gibco </td><td> 31,985 </td></tr><tr><td> 대중 교통 - LT1 </td><td> Mirus </td><td> MIR2300 </td></tr><tr><td> μ - 슬라이드 8 - 잘 </td><td> ibidi </td><td> 80,826 </td></tr></tbody></table>

photobleaching assays (frap &amp; flip) to measure chromatin protein dynamics in living embryonic stem cells

Photobleaching 후 형광 복구 (FRAP)와 Photobleaching에서 형광 손실 (플립)는 좋은 공간과 시간적 해상도를 가진 살아있는 세포의 단백질 역학 연구를 활성화합니다. 여기 FRAP 및 마우스 배아 줄기 (ES) 세포에 H1과 HP1 포함 염색질 단백질의 플립 assays을 수행하는 방법에 대해 설명합니다. FRAP 실험에서 세포는 녹색 형광 단백질 (GFP) 또는 그에 파생 상품 (YFP, CFP, 체리 등) 융합 관심의 단백질과 중 transiently 또는 안정, transfected 있습니다. transfected, fluorescing 세포에서 강렬한 초점 레이저 빔을 관심의 비교적 작은 영역 (ROI)을 표백제. 레이저 파장은 융합에 사용되는 형광 단백질에 따라 선택됩니다. 레이저 빛이 irreversibly 투자 수익 (ROI)에있는 분자의 형광 신호를 표백제와 즉시 표백 다음, 표백 영역에서 형광 신호의 복구 - 표백하지 않은 분자와 표백 분자의 교체에 의해 중재가 - 시간 저속 이미징을 사용하여 모니터링할 수 있습니다. 생성된 형광 복구 곡선은 단백질의 이동성에 대한 정보를 제공합니다. 형광 분자가 고정되어있다면, 어떤 형광 복구 관찰되지 않습니다. 보완적인 접근에서, Photobleaching에서 형광 손실 (플립)은 레이저 빔을 반복 같은 자리를 표백제와 신호 강도가 다른 fluorescing 세포 단위로 측정됩니다. 뒤집기 실험 따라서 오히려 형광 복구보다 신호 부패를 측정하고 세포 구획 사이 였죠 단백질의 이동성뿐만 아니라 단백질을 확인하는 데 유용합니다. 과도 바인딩은 염색질 결합 단백질의 일반적인 속성입니다. 각 염색질 단백질의 주요 분율이 일정한 상태에서 특정 순간에 염색질에 바인딩되어 있지만, 바인딩은 일시적이며 대부분의 염색질 단백질 초의 순서에 체류 시간, 염색질에 대한 높은 매출 있습니다. 이러한 속성은 게놈의 표현 1 높은 소성을 생성하기위한 열쇠입니다. 염색질 단백질 (heterochromatin 단백질 1 (HP1), 링커 히스톤 H1 및 핵심 histones 포함)의 동적 교환이 높습니다 어디 Photobleaching 실험 따라서 특히 ES 세포에서 염색질 구조 단백질 GFP - 퓨전 버전을 사용 염색질 소성을, 결정하기 위해 특히 유용합니다 2,3 차별화된 세포보다.

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Photobleaching Assays FRAP &amp; FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

우리는 Photobleaching 후 형광 복구 (FRAP)와 배아 줄기 (ES) 세포에서 염색질 단백질 역학을 모니터 (플립) Photobleaching에서 형광 손실을 포함하여 photobleaching 방법을 설명합니다. 염색질 소성을 연구하는 방법 중 하나가 될 것으로 간주됩니다 염색질 단백질 역학은, pluripotent 세포 향상됩니다.

배아 줄기 세포 생활에서 염색질 단백질 역학을 측정하는 Assays (FRAP 및 플립)를 Photobleaching

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

photobleaching-assays-frap-flip-to-measure-chromatin-protein-dynamics

Research

JoVE Journal

Biology

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

27.0K 조회수.  The Hebrew University of Jerusalem. 우리는 Photobleaching 후 형광 복구 (FRAP)와 배아 줄기 (ES) 세포에서 염색질 단백질 역학을 모니터 (플립) Photobleaching에서 형광 손실을 포함하여 photobleaching 방법을 설명합니다. 염색질 소성을 연구하는 방법 중 하나가 될 것으로 간주됩니다 염색질 단백질 역학은, pluripotent 세포 향상됩니다.

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Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

인간의 배아 줄기 (ES) 세포의 전파

연구

생물학

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Murine 배아 줄기 세포로부터 조혈 줄기 세포의 유도

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Patterning of Embryonic Stem Cells Using the Bio Flip Chip

Cell-cell interactions consisting of diffusible signaling and cell-cell contact (juxtacrine signaling) are important in numerous biological processes such as tumor growth, stem cell differentiation, and stem cell self-renewal. A number of methods currently exist to modulate cell signaling in vitro. One method of modulating the total amount of diffusible signaling is to vary the cell seeding density during culture. Due to the random nature of cell seeding, this results in considerable variation in the actual cell-cell spacing and amount of cell-cell contact, and cannot prescribe the local environment. A more specific approach for modulating cell signaling is to use molecular inhibitors or genetic approaches to knock down specific signaling proteins, but both of these methods are best suited to manipulating small numbers of molecules. Here, we demonstrate a new approach to modulating cell-cell signaling that modulates the local environment of a cluster of cells by placing different numbers of cells at desired locations on a substrate. This method provides a complementary way to control the local diffusible and juxtacrine signaling between cells. Our method makes use of the Bio Flip Chip (BFC), a microfabricated silicone chip containing hundreds-to-thousands of microwells, each sized to hold either a single cell or small numbers of cells. We load the chip with cells simply by pipetting them onto the array of wells and washing unloaded cells off the array. The chip is then flipped onto a substrate, whereby the cells fall out of the wells and onto the substrate, maintaining their patterning. After the cells have attached, the chip can be removed (or left on). This approach to cell patterning is unique in that it: 1) doesn't alter the chemistry of the substrate, thus allowing cells to proliferate and migrate; 2) allows patterning onto any substrate, including tissue-culture polystyrene, glass, matrigel, and even feeder cell layers; and 3) is compatible with traditional microcontact printing, allowing the creation of extracellular matrix islands with cells placed inside those islands. In this video, we demonstrate the patterning of mouse embryonic stem cells onto tissue-culture polystyrene using the BFC.

We demonstrate a simple method for placing cells at desired locations on a substrate. This method patterns cells by flipping a silicone chip containing microwells filled with cells onto the substrate. This method provides a new way to modulate diffusible and juxtacrine signaling between cells.

바이오 플립 칩을 사용하여 배아 줄기 세포의 Patterning

Cell-cell interactions consisting of diffusible signaling and cell-cell contact (juxtacrine signaling) are important in numerous biological processes such ...

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and programmed cell death. Mitochondria produce ATP, regulate the cytoplasmic redox state and Ca2+ balance, catabolize fatty acids, synthesize heme, nucleotides, steroid hormones, amino acids, and help assemble iron-sulfur clusters in proteins. Mitochondria also have an essential role in heat production. Mutations of the mitochondrial genome cause several types of human disorder. The accumulation of mtDNA mutations correlates with aging and is suspected to have an important role in the development of cancer. Due to their vitally important role in all cell types, the function of mitochondria must also be critical for stem cells. Key advances have been made in our understanding of stem cell viability, proliferation, and differentiation capacity. But the functional activity of stem cells, in particular their energy status, was not yet been studied in detail. Almost nothing is known about the mitochondrial properties of human embryonic stem cells (hESCs) and their differentiated precursor progeny. One way to understand and evaluate the role of mitochondria in hESC function and developmental potential is to directly measure the activity of mitochondrial respiratory complexes. Here, we describe high resolution clear native gel electrophoresis and subsequent in gel activity visualization as a method for analyzing the five respiratory chain complexes of hESCs.

In this video, we will show you how the mitochondrial respiratory chain complexes of human embryonic stem cells can be analyzed using in gel activity assays.

인간 배아 줄기 세포에서 Mitochondrial 복잡한 활동에 대한 탐색

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

인간 배아 줄기 세포에서 염색질의 Immunoprecipitation

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

인간 배아 줄기 세포를 동결 융해

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and organs1,2,6,7. During development, toxic chemicals or genetic alterations can cause an increase in PCD or change PCD patterns resulting in developmental abnormalities and birth defects3-5. To understand the etiology of these defects, the study of embryos can be complemented with in vitro assays that use differentiating embryonic stem (ES) cells.
Apoptosis is a well-studied form of PCD that involves both intrinsic and extrinsic signaling to activate the caspase enzyme cascade. Characteristic cell changes include membrane blebbing, nuclear shrinking, and DNA fragmentation. Other forms of PCD do not involve caspase activation and may be the end-result of prolonged autophagy. Regardless of the PCD pathway, dying cells need to be removed. In adults, the immune cells perform this function, while in embryos, where the immune system has not yet developed, removal occurs by an alternative mechanism. This mechanism involves neighboring cells (called "non-professional phagocytes") taking on a phagocytic role-they recognize the 'eat me' signal on the surface of the dying cell and engulf it8-10. After engulfment, the debris is brought to the lysosome for degradation. Thus regardless of PCD mechanism, an increase in lysosomal activity can be correlated with increased cell death.
To study PCD, a simple assay to visualize lysosomes in thick tissues and multilayer differentiating cultures can be useful. LysoTracker dye is a highly soluble small molecule that is retained in acidic subcellular compartments such as the lysosome11-13. The dye is taken up by diffusion and through the circulation. Since penetration is not a hindrance, visualization of PCD in thick tissues and multi-layer cultures is possible12,13. In contrast, TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) analysis14, is limited to small samples, histological sections, and monolayer cultures because the procedure requires the entry/permeability of a terminal transferase.
In contrast to Aniline blue, which diffuses and is dissolved by solvents, LysoTracker Red DND-99 is fixable, bright, and stable. Staining can be visualized with standard fluorescent or confocal microscopy in whole-mount or section using aqueous or solvent-based mounting media12,13. Here we describe protocols using this dye to look at PCD in normal and sonic hedgehog null mouse embryos. In addition, we demonstrate analysis of PCD in differentiating ES cell cultures and present a simple quantification method. In summary, LysoTracker staining can be a great complement to other methods of detecting PCD.

We present a simple protocol to visualize regions of programmed cell death (PCD) in mouse embryos and differentiating embryonic stem (ES) cell cultures using a highly soluble dye called LysoTracker.

태아의 프로그래밍 셀 죽음을 감지 할 LysoTracker의 이용 및 배아 줄기 세포를 차별화

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

간엽 전환을 유도하고 상피의 분석

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

정량적 RT-PCR에 의해 개별 인간 배아 줄기 세포를 프로파일 링

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and widely-utilized +TIPs for analyzing MT dynamics is the End-Binding protein, EB1, which binds all growing MT plus-ends, and thus, is a marker for MT polymerization1. Many studies of EB1 behavior within growth cones have used time-consuming and biased computer-assisted, hand-tracking methods to analyze individual MTs1-3. Our approach is to quantify global parameters of MT dynamics using the software package, plusTipTracker4, following the acquisition of high-resolution, live images of tagged EB1 in cultured embryonic growth cones5. This software is a MATLAB-based, open-source, user-friendly package that combines automated detection, tracking, visualization, and analysis for movies of fluorescently-labeled +TIPs. Here, we present the protocol for using plusTipTracker for the analysis of fluorescently-labeled +TIP comets in cultured Xenopus laevis growth cones. However, this software can also be used to characterize MT dynamics in various cell types6-8.

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

The MATLAB-based, open source software package, plusTipTracker, can be used to analyze image series of fluorescently-labeled +TIPs to quantify microtubule dynamics.

에 미세 소관 역학을 측정하는 plusTipTracker 소프트웨어를 사용<em&gt; 운송에 필요한 정보 미국 교통부</em&gt; 성장 콘

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...