이 작품은 국립 보건원 (JCB에 K22NS050137)에 의해 지원되었다.

1. 세포 배양 <ol><li> 대뇌 피질의 뉴런은 고립과 앞에서 설명한 기법과 폴리 - D - 라이신과 laminin 1 코팅 유리 바닥 (MatTek 공사, 애쉬 랜드, MA)와 문화 요리에 도금을 사용하여 재배하고 있습니다. </li></ol> 2. 형광 프로브 TMRM와 H 2 DCF - DA에 대한 재고 솔루션을 준비 <ol><li> 무수 dimethylsulfoxide 1 ML에 TMRM의 5.0 MG를 해소하여 TMRM의 10 MM 재고 솔루션을 준비합니다. 소용돌이 1 분 동안. 그런 다음, aliquots을하고 -20 ° C에서 그들을 저장, 빛으로부터 보호하고, 1 개월 이내에 사용합니다. </li><li> 다음 무수 DMSO 1 ML에서 H 2 DCF - DA의 4.87 밀리그램을 용해하여 H 2 DCF - DA의 10 MM 재고 솔루션을 준비합니다. 마찬가지로, 와동 1 분 동안. 그런 다음, aliquots을하고 -20 ° C에서 그들을 저장, 빛으로부터 보호하고, 일주일 이내에 사용합니다. </li></ol> 3. TMRM 및 H 2 DCF - DA로 로딩 쥐 대뇌 피질 뉴런 TMRM는 mitochondria의 매우 부정적인 요금 내부에 축적 potentiometric, 셀 투과 형광 표시기입니다. mitochondrial TMRM의 자동 담금질을 피하기 위해 TMRM의 낮은 농도 (10-50 nm의 범위)를 사용하는 것이 중요합니다. 그런 다음, TMRM의 형광 신호는 내부 mitochondrial 멤브레인 전체 ΔΨm 직접 공동과 관련이있을 수 있습니다. ΔΨm의 손실이 형광 강도의 손실 발생 mitochondria에서 누출 TMRM됩니다. H 2 DCF - DA는 세포 - 세포 투과 esterases하여 DCF - DA로 변환 프로브 및 형광 DCF에서의 산화 결과입니다. 높은 로딩 농도도 H 2의 부재 O 2 DCF 형광의 채도가 발생할 수 있으므로 DCF - DA는 20-10 μm의 그것 사이의 범위 H 2의 최종 농도는 서로 다른 뇌 영역에서 파생된 뉴런에서 경험적으로 테스트해야합니다. 모든 내생이나 외인성 산화제의 존재 (예 : 질산 산화, 과산화수소)는 DFC 형광 강도를 증가합니다. 아래, 우리는 TMRM와 H 2 DCF - DA와 쥐의 대뇌 피질의 뉴런 로딩을위한 프로토콜을 제공합니다. <ol><li> 결핵 : : 145 MM NaCl, 5 MM KCl, 10 MM 포도당 1.5 MM CaCl 2, 1 MM MgCl 2, 10 TMRM와 쥐 대뇌 피질의 뉴런을로드하려면, 먼저 Tyrode의 버퍼 (텍스트 오버레이와 교양 뉴런에게 3 회 ​​씻어 MM의 HEPES;) NaOH와 7.4으로 산도를 조정합니다. 그런 다음, TB의 1 / 1000 회 10 MM TMRM 주식을 diluting하여 TMRM 20 NM를 준비하고 TB 1 ML 당 희석 TMRM 2 μl를 추가합니다. 상온에서 어두운 곳에 45 분 TMRM과 뉴런을 품어. 45 분 후, 현미경의 무대에 문화 접시를 탑재하고 영상을 시작합니다. </li><li> H 2 DCF - DA와 쥐의 대뇌 피질의 뉴런을로드하려면, 결핵과 교양 뉴런에게 3 회 ​​씻는다. 다음 TB의 H 2 DCF - DA 주식 10분의 1 회 10 MM을 diluting하여 H 2 DCF - DA 2 μm의 준비를하고 TB 1 ML 당 희석 H 2 DCF - DA 2 μl를 추가합니다. 그런 다음, 상온에서 어두운 45 분 H 2 DCF - DA로 뉴런을 품어. 45 분 후, 이미지를 취득하기 전에 여분의 형광 표시기를 제거하는 결핵과 뉴런에게 4 번 씻으십시오. </li></ol> 4. ΔΨm을 결정하는 TMRM와 incubated 뉴런의 이미징 라이브 <ol><li> TMRM, 공촛점 레이저 스캐닝 현미경 (텍스트 오버레이 : LSM 510, 칼 자이스 혈구 주)와 incubated 뉴런의 라이브 영상 수행하려면, 라이브 타임 시리즈 프로그램의 응용 프로그램과 함께하는 것은, 사용됩니다. 이미지를 취득하고 photobleaching 방지하는 데 필요한 시간을 최소화하기 위해; 낮은 해상도와 감쇠 레이저 파워 (1 % : 낮은 해상도의 레이저 파워 256 X 256 텍스트 오버레이)을 적용합니다. </li><li> . 다음 반사광을 사용 TMRM와 함께 로드된 탑재 뉴런의 초점을 조정합니다. 514 NM에서 조명과 570 nm의에서 감지하여 TMRM 형광을 검사합니다. 단지 채도 수준 아래 카메라의 감지 게인을 설정합니다. </li><li> 취득 해상도, 레이저 파워, 카메라의 감지 이득, 그리고 시간 경과 간격을 포함 모든 매개 변수되면 이미지 설정, 실험을 사이에 이러한 설정을 변경하지 마십시오. 다음 필드를 변경합니다. 이미지를 수집 시작합니다. </li><li> ΔΨm의 변화를 테스트하려면, 그러한 FCCP 또는 2 μg / oligomycin의 ML, 1 μm의 같은 자극이 크게 각각 mitochondrial 멤브레인 잠재력을 depolarize 또는 hyperpolarize되는, 적용할 수 있습니다. 이러한 변경 사항은 FCCP의 경우에 기준 형광 강도, 또는 oligomycin의 경우 TMRM 형광 강도의 증가와 비교 TMRM 형광 강도의 감소로 반영됩니다. </li></ol> 5. ROS를 확인하는 H 2 DCF - DA와 incubated 뉴런의 라이브 영상 <ol><li> H 2 DCF - DA, 최초로 incubated 뉴런의 라이브 영상을 수행하려면, 현미경의 무대에 문화 접시를 탑재합니다. 우리 세포의 초점을 조정주입은 빛을 반사. 488 nm의 여기에서 그리고 515 nm의 방출에 의해 DCF 형광을 검사합니다. </li><li> 다음 5-7 %, 검출기 이득, 256 X 256의 해상도 레이저 파워를 조정합니다. 실험을 사이에 이러한 설정을 변경하지 마십시오. 그런 다음, 시간 시리즈 프로그램을 사용하여 라이브 영상을 얻기위한 주파수를 설정합니다. </li><li> 새로운 분야를 선택하고 이미지를 획득 시작합니다. ROS 수준의 변화를 감지하기 위해, H 2 O 2 100-200 μm의와 세포를 치료. 이것은 기준 레벨과 비교 DCF 형광 강도의 증가로 반영됩니다. </li></ol> 6. 데이터 분석 <ol><li> 영역을 선택 LSM 프로그램에서 도구 : 관심 지역 (ROI 텍스트 오버레이)를 사용합니다. 그런 다음, TMRM 또는 ROS 형광 강도를 측정합니다. mitochondrial 지역 또는 TMRM이나 ROS의 형광 강도, 각각을 측정하는 몇 군데 세포에서 전체 세포 본체에서 로아에서 로아를 선택합니다. </li><li> TMRM 또는 각 시점에 대한 ROS에 대한 모든 군데 세포에 대한 전체 세포 기관에서 각 세포의 모든 로아에서 평균 형광 강도를 계산합니다. 배경 형광 강도를 계산하기 위해 셀 옆에 지역을 선택합니다. 몇 가지 측정을 가지고 평균 배경 강도를 계산합니다. </li><li> Microsoft Excel을 사용하여 각 시점의 각 세포에 로아의 평균 형광 강도의 평균 배경 형광 강도를 빼기. . 배경 강도를 공제한 후,이 수식을 (ΔF = FF O / F O X 100, F = 기본 형광 어느 시점에서 = 형광 강도, 텍스트 오버레이)를 사용하여 기준 형광에 TMRM 또는 DCF 형광 강도를 정상화 그런 다음, 시간이 지남에 따라 형광 강도의 변화를 보여주는 줄거리를 생성하는 시그마 플롯 프로그램을 사용합니다. </li></ol> 7. 대표 결과 그림 1A는 TMRM와 incubated 쥐의 대뇌 피질의 뉴런의 형광 이미지를 보여줍니다. FCCP, mitochondrial uncoupler의 또한 mitochondrial 탈분극 및 TMRM의 형광 강도 (그림의 1B)의 손실로 연결됩니다. 기준 TMRM의 형광 수준 FCCP를 추가 (.; 그림 1C 처음으로 350 초) 전에 안정 남아 있습니다. 시간이 지남에 따라 TMRM 형광 변화를 정량 분석​​ FCCP (그림 1C)를 추가 후 TMRM의 형광에 상당한 감소를 보여줍니다. 그림 1D는 DCF로로드 쥐의 대뇌 피질의 뉴런의 형광 이미지를 보여줍니다. 에서 H 2 O 2 결과 또한 (그림 1E) 세포 기관에서 DCF 형광 강도를 증가했다. 기준 DCF 형광 수준은 H 2 O 2의 응용 프로그램을 이전 (처음 120 초) 변경됩니다. DCF 형광의 시간 - 저속도 측정은 안정 수준을 보여, H 2 O 2 치료 (그림 1 층) 이후 증가하는. <img src="/files/ftp_upload/2704/2704fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. mitochondrial 막 잠재력과 라이브 쥐의 대뇌 피질의 뉴런에서 ROS 수준의 평가. (A) 대뇌 피질의 뉴런 대표 형광 이미지 TMRM 탑재. 기본 TMRM 형광 스캔 후 뉴런은 protonophore FCCP (1 μm의)와 치료를했다. 오른쪽에있는 밝은 노란색과 검은색으로 표현하는 최대 및 최소 강도 각각과 TMRM 형광의 강도 pseudocolor 바 있습니다. mitochondrial 지역의 TMRM의 형광의 손실이 FCCP 치료 (패널 B)에 따라 ΔΨm의 붕괴를 나타냅니다. 다른 시간 시점에서 TMRM 형광 강도 변화의 양적 표현 FCCP 치료 전후 패널 C. (D)에 H2DCF - DA와 함께 로드된 쥐의 대뇌 피질의 뉴런의 형광 이미지를 볼 수 있습니다. 기본 DCF 형광을 결정 후, 세포는 200 μm의 H 2 O 2로 치료했고, DCF 형광의 변화는 평가했다. DCF 형광의 증가는 H 2 O 2 치료 (E)시 ROS 수준의 증가를 반영합니다. DCF 형광의 변화의 정량 분석, H 2 O 2 치료 전후는, 패널 F. 스케일 표시줄에 = 10 μm의를 표시합니다 Video.7.1 - labmedia 2704_Joshi.avi 40X 목표를 사용하여 FCCP 추가 전후의 대뇌 피질의 뉴런에 TMRM의 세포 이미징을 살고있다. pseudocolor 강도가 최대 (FCCP 추가하기 전에 밝은 노란색을) 보여 주며 (붉은 색, FCCP 추가 후) FCCP 추가 후 TMRM 형광 강도를 감소. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2704/supplemental_video1.avi">비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> 비디오. 7.5 - labmedia 2704_Joshi.avi 40X 목표를 사용하여 H 2 O 2 또한 이전과 이후 대뇌 피질의 뉴런에서 DCF의 세포 이미징을 살고있다. 기준 DCF 형광은 세포 기관에서 밝은 녹색 색상을 보유하고 H2O2 또한 DC 증가밝은 녹색 색상 F 형광 강도. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2704/supplemental_video2.avi">비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오</a>

<ol>
	<li>Hilgenberg, L. G., Smith, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+dissociated+mouse+cortical+neuron+cultures.">Preparation of dissociated mouse cortical neuron cultures.</a> J. Vis. Exp. , (2007).</li><li>Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives.">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophys. J. 76, 469-477 (1999).</li><li>Ward, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+(AICD)+disrupts+actin+dynamics+and+mitochondrial+bioenergetics.">The amyloid precursor protein intracellular domain (AICD) disrupts actin dynamics and mitochondrial bioenergetics.</a> J. Neurochem. 113, 275-284 (2010).</li><li>Gunasekar, P. G., Kanthasamy, A. G., Borowitz, J. L., Isom, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor+activation+produces+concurrent+generation+of+nitric+oxide+and+reactive+oxygen+species:+implication+for+cell+death.">NMDA receptor activation produces concurrent generation of nitric oxide and reactive oxygen species: implication for cell death.</a> J. Neurochem. 65, 2016-2021 (1995).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리는 각각 형광 표시기 TMRM와 H 2 DCF - DA를 사용하여 쥐의 대뇌 피질의 뉴런에 ΔΨm과 ROS를 결정하는 방법을 설명하는 단계별 절차를 제공합니다. 다른 세포 유형에 대한, 경험적으로 TMRM 또는 H 2 DCF - DA의 최종 농도 및 로딩 시간을 결정하는 것이 중요합니다. 일반적으로 TMRM 20-200 NM의 농도 범위, 그리고 TMRM과 세포 배양 시간은 20 60 분 다릅니다. H 2의 최종 농도는 DCF - DA는 20-10 μm의 범위에서,이 표시기를 포함하는로드 솔루션 세포의 배양은 30-45 분부터 다릅니다. 어떤 자극이없는에있는 세포 및 형광 강도의 변화 (TMRM 형광 깜빡 예를 들어)을 모두 사진 독성을 피하기 위해 이미지를 복용의 레이저 전원 및 스캔 속도를 최적화하는 것이 중요합니다. 최적화된 광학 설정은 자극의 부재에서 (요건) 포화 이상 또는 이하가 아닌 형광 신호를 발생한다. 라이브 영상을 10-15 분에 대한 자극의 부재에서 프로브의 형광 강도에 변화가없는 경우 특정 레이저 파워와 스캔 속도로 선택한 필드에서 이미지를 수집하기 위해 최적의 조건을 달성하고 있습니다. ΔΨm을 결정하기 위해 다른 형광 프로브는 rhodamine 123와 테트라 메틸 에틸 에스테르 rhodamine (TMRE)를 포함합니다. 그러나, 그들은 고립 mitochondria 2의 호흡 과정을 억제하는 것으로 확인되었습니다. 중요한 TMRM 낮은 농도 2 mitochondrial 호흡에 영향을주지 않습니다 낮은 phototoxicity 및 기타 프로브에 비해 3 photobleaching 있습니다. H 2 DCF - DA는 잘 세포의 유지와 같이 ROS에 대한 좋은 지표 등 peroxides 같은 여러 산화제 종, 슈퍼 산화물과 질산 산화물 4 인식합니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th></tr><tr><td> 유리 바닥 문화 요리 </td><td> MatTek 코퍼레이션 </td><td> P35G - 1.5-14 - C </td></tr><tr><td> NbActive4 </td><td> BrainBits </td><td> NbActive4 </td></tr><tr><td> TMRM </td><td> Invitrogen </td><td> T668 </td></tr><tr><td> H 2 DCF - DA </td><td> Invitrogen </td><td> C400 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 시그마 </td><td> S6191 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 시그마 </td><td> P3911 </td></tr><tr><td> CaCl 2 • 2 시간 2 O </td><td> 시그마 </td><td> C3306 </td></tr><tr><td> MgCl 2 • 6H 2 O </td><td> 시그마 </td><td> M2670 </td></tr><tr><td> D - 포도당 </td><td> 시그마 </td><td> G6152 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Invitrogen </td><td> 15,630 </td></tr></tbody></table>

determination of mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species in live rat cortical neurons

Mitochondrial 막 잠재적인 (ΔΨm)는 ATP를 생성하는 호흡 체인의 생리 기능을 유지하기위한 중요합니다. ΔΨm의 큰 손실이 이후의 죽음과 에너지의 고갈 세포를 렌더링. 반응 산소 종 (ROS)는 중요한 신호 분자 있지만, 병적인 조건에서 그들의 축적은 산화 스트레스로 연결됩니다. 세포에 ROS의 두 가지 주요 소스는 환경 독소 및 산화 인산화 과정입니다. Mitochondrial 장애 및 산화 스트레스는 많은 질병의 pathophysiology에 연루되어있다, 그러므로 ΔΨm 및 ROS를 결정하는 능력은 세포와 mitochondria의 기능의 생리적 상태에 대한 중요한 단서를 제공할 수 있습니다. 여러 형광 프로브 (Rhodamine 123, TMRM, TMRE, JC - 1) 세포 유형의 다양한 Δψm을 결정하는 데 사용, 그리고 수 많은 형광 지표 (Dihydroethidium, Dihydrorhodamine 123, H 2 DCF - DA)는 ROS를 결정하는 데 사용할 수 있습니다 . 거의 ΔΨm 또는 ROS를 평가하는 데 사용 가능한 형광 프로브의 모든 ΔΨm이나 ROS의 수준을 증가 또는 감소 자극에 비례 자신의 형광 강도를 증가 또는 감소 단일 파장 지표입니다. 따라서, 그것은 기본 수준과 특정 자극의 적용 후 이러한 프로브의 형광 강도를 측정하는 필수적입니다. 이것은 하나가 기본 수준과 자극 사이의 형광 강도의 변화의 비율을 결정할 수 있습니다. 형광 강도이 변경 사항은 ΔΨm이나 ROS의 상대적인 수준의 변화를 반영합니다. 이 비디오에서는, 우리는 기본 수준 사이 FCCP, mitochondrial uncoupler를 적용한 후에 TMRM 형광 강도의 비율 변화를 확인하기 위해 쥐 대뇌 피질의 뉴런에 형광 표시기, TMRM을 적용하는 방법을 보여줍니다. FCCP 치료 인한 TMRM 형광의 낮은 수준 mitochondrial 막 잠재력의 탈분극을 반영합니다. 우리는 또한 H 2 O 2의 신청 후에베이스 라인 처음에 대뇌 피질의 뉴런에서 ROS의 수준을 평가하고 형광 프로브 H 2 DCF - DA를 적용하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 (작은 수정)도 다른 세포 유형과 다른 뇌 영역에서 분리된 뉴런에 ΔΨm 및 ROS의 변화를 결정하는 데 사용할 수 있습니다.

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Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

우리는 특정 자극의 응용 프로그램을 이전과 이후 TMRM 형광 강도의 상대적 변화를 결정하기 위해 대뇌 피질의 뉴런에서, 형광 표시기, TMRM의 응용 프로그램을 보여줍니다. 우리는 또한 형광 프로브 H의 응용 프로그램을 표시<sub&gt; 2</sub&gt; DCF - DA 대뇌 피질의 뉴런의 반응 산소 종의 상대적 수준을 평가합니다.

라이브 랫 두피 뉴런에서 Mitochondrial 분리막 잠재력과 반응 산소 종의 결정

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

64.7K 조회수.  Loyola University Chicago. 우리는 특정 자극의 응용 프로그램을 이전과 이후 TMRM 형광 강도의 상대적 변화를 결정하기 위해 대뇌 피질의 뉴런에서, 형광 표시기, TMRM의 응용 프로그램을 보여줍니다. 우리는 또한 형광 프로브 H의 응용 프로그램을 표시 2 DCF - DA 대뇌 피질의 뉴런의 반응 산소 종의 상대적 수준을 평가합니다.

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Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured neurons for extended durations1-3. This is now possible through the use of vital dyes and fluorescent proteins with which cytoskeletal components, organelles, and other structures in living cells can be labeled and then visualized via dynamic fluorescence microscopy. For example, in embryonic chicken sympathetic neurons, mitochondrial movement was characterized using the vital dye rhodamine 1234. In another study, mitochondria were visualized in rat forebrain neurons by transfection of mitochondrially targeted eYFP5. However, imaging of primary neurons over minutes, hours, or even days presents a number of issues. Foremost among these are: 1) maintenance of culture conditions such as temperature, humidity, and pH during long imaging sessions; 2) a strong, stable fluorescent signal to assure both the quality of acquired images and accurate measurement of signal intensity during image analysis; and 3) limiting exposure times during image acquisition to minimize photobleaching and avoid phototoxicity.
Here, we describe a protocol that permits the observation, visualization, and analysis of mitochondrial movement in cultured hippocampal neurons with high temporal resolution and under optimal life support conditions. We have constructed an affordable stage-top incubator that provides good temperature regulation and atmospheric gas flow, and also limits the degree of media evaporation, assuring stable pH and osmolarity. This incubator is connected, via inlet and outlet hoses, to a standard tissue culture incubator, which provides constant humidity levels and an atmosphere of 5-10% CO2/air. This design offers a cost-effective alternative to significantly more expensive microscope incubators that don't necessarily assure the viability of cells over many hours or even days. To visualize mitochondria, we infect cells with a lentivirus encoding a red fluorescent protein that is targeted to the mitochondrion. This assures a strong and persistent signal, which, in conjunction with the use of a stable xenon light source, allows us to limit exposure times during image acquisition and all but precludes photobleaching and phototoxicity. Two injection ports on the top of the stage-top incubator allow the acute administration of neurotransmitters and other reagents intended to modulate mitochondrial movement. In sum, lentivirus-mediated expression of an organelle-targeted red fluorescent protein and the combination of our stage-top incubator, a conventional inverted fluorescence microscope, CCD camera, and xenon light source allow us to acquire time-lapse images of mitochondrial transport in living neurons over longer durations than those possible in studies deploying conventional vital dyes and off-the-shelf life support systems.

We describe a protocol that allows imaging of mitochondria in living neurons via fluorescence microscopy over long durations. Imaging over extended periods is accomplished through lentivirus-mediated expression of a mitochondrially targeted fluorescent protein and use of an inexpensive stage-top incubator that was designed and built in our laboratory.

Neuromodulation 및 Mitochondrial 교통 : 긴 기간이 이상 Hippocampal 뉴런의 라이브 영상

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

연구

신경과학

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

FM 염료를 사용하여 양식 소뇌 과립 뉴런에서 시냅틱 소포 풀 보충의 정량 분석

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or co-culture model. This system is suitable for a variety of experimental needs requiring either a glass or plastic growth substrate and can also be used for culture of other types of neurons.
Rat cortical neurons obtained from the late embryonic stage (E17) are plated on glass coverslips or tissue culture dishes facing a feeder layer of glia grown on dishes or plastic coverslips (known as Thermanox), respectively. The choice between the two configurations depends on the specific experimental technique used, which may require, or not, that neurons are grown on glass (e.g. calcium imaging versus Western blot). The glial feeder layer, an astroglia-enriched secondary culture of mixed glia, is separately prepared from the cortices of newborn rat pups (P2-4) prior to the neuronal dissection.
A major advantage of this culture system as compared to a culture of neurons only is the support of neuronal growth, survival, and differentiation provided by trophic factors secreted from the glial feeder layer, which more accurately resembles the brain environment in vivo. Furthermore, the co-culture can be used to study neuronal-glial interactions1.
At the same time, glia contamination in the neuronal layer is prevented by different means (low density culture, addition of mitotic inhibitors, lack of serum and use of optimized culture medium) leading to a virtually pure neuronal layer, comparable to other established methods1-3. Neurons can be easily separated from the glial layer at any time during culture and used for different experimental applications ranging from electrophysiology4, cellular and molecular biology5-8, biochemistry5, imaging and microscopy4,6,7,9,10. The primary neurons extend axons and dendrites to form functional synapses11, a process which is not observed in neuronal cell lines, although some cell lines do extend processes.
A detailed protocol of culturing rat hippocampal neurons using this co-culture system has been described previously4,12,13. Here we detail a modified protocol suited for cortical neurons. As approximately 20x106 cells are recovered from each rat embryo, this method is particularly useful for experiments requiring large numbers of neurons (but not concerned about a highly homogenous neuronal population). The preparation of neurons and glia needs to be planned in a time-specific manner. We will provide the step-by-step protocol for culturing rat cortical neurons as well as culturing glial cells to support the neurons.

Here we provide a protocol for culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer. The cultured neurons establish polarity and create synapses, and can be separated from the glia for use in various applications, such as electrophysiology, calcium imaging, cell survival assays, immunocytochemistry, and RNA/DNA/protein isolation.

차 쥐 두피 뉴런과 Glia의 Bilaminar의 공동 문화

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

두피 뉴런에서 생체 내 두 - 광자의 영상은 경험에 의존 분자 변경

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with increasing connective tissue and decreased neuronal viability that occur with age. Here, we describe a methodology for the dissociation of healthy hypothalamic neurons from adult-aged mice. The ability to study neurons from adult-aged mice allows the use of disease models that manifest at a later age and might be more developmentally accurate for certain studies. Fluorescence imaging of dissociated neurons can be used to study the activity of a population of neurons, as opposed to using electrophysiology to study a single neuron. This is particularly useful when studying a heterogeneous neuronal population in which the desired neuronal type is rare such as for hypothalamic glucose sensing neurons. We utilized membrane potential dye imaging of adult ventromedial hypothalamic neurons to study their responses to changes in extracellular glucose. Glucose sensing neurons are believed to play a role in central regulation of energy balance. The ability to study glucose sensing in adult rodents is particularly useful since the predominance of diseases related to dysfunctional energy balance (e.g.&#160;obesity) increase with age.

The activity of single neurons from adult-aged mice can be studied by dissociating neurons from specific brain regions and using fluorescent membrane potential dye imaging. By testing responses to changes in glucose, this technique can be used to study the glucose sensitivity of adult ventromedial hypothalamic neurons.

막 성인 쥐에서 Ventromedial 시상 하부 뉴런의 잠재적 인 염료 이미징은 포도당 감지를 연​​구하는

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich structures suggest alterations in synaptic integrity and connectivity. Here we provide a detailed protocol for culturing primary rat cortical neurons, Phalloidin staining for F-actin puncta, and subsequent quantification techniques. First, the frontal cortex of E18 rat embryos are dissociated into low-density cell culture, then the neurons grown in vitro for at least 12-14 days. Following experimental treatment, the cortical neurons are stained with AlexaFluor 488 Phalloidin (to label the dendritic F-actin puncta) and microtubule-associated protein 2 (MAP2; to validate the neuronal cells and dendritic integrity). Finally, specialized software is used to analyze and quantify randomly selected neuronal dendrites. F-actin rich structures are identified on second order dendritic branches (length range 25-75 &#181;m) with continuous MAP2 immunofluorescence. The protocol presented here will be a useful method for investigating changes in dendritic synapse structures subsequent to experimental treatments.

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.

쥐 두피 뉴런의 사상 액틴 (F - 굴지) puncta의 정량

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

Vivo에서 신생아 쥐에 있는 대뇌 피 질의 뉴런의 두 광자 영상

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Stimulus-specific Cortical Visual Evoked Potential Morphological Patterns

This paper presents a methodology for the recording and analysis of cortical visual evoked potentials (CVEPs) in response to various visual stimuli using 128-channel high-density electroencephalography (EEG). The specific aim of the described stimuli and analyses is to examine whether it is feasible to replicate previously reported CVEP morphological patterns elicited by an apparent motion stimulus, designed to simultaneously stimulate both ventral and dorsal central visual networks, using object and motion stimuli designed to separately stimulate ventral and dorsal visual cortical networks.&#160; Four visual paradigms are presented: 1. Randomized visual objects with consistent temporal presentation. 2. Randomized visual objects with inconsistent temporal presentation (or jitter).&#160; 3. Visual motion via a radial field of coherent central dot motion without jitter.&#160; 4. Visual motion via a radial field of coherent central dot motion with jitter.&#160; These four paradigms are presented in a pseudo-randomized order for each participant.&#160; Jitter is introduced in order to view how possible anticipatory-related effects may affect the morphology of the object-onset and motion-onset CVEP response.&#160; EEG data analyses are described in detail, including steps of data exportation from and importation to signal processing platforms, bad channel identification&#160;and removal, artifact rejection, averaging, and categorization of average CVEP morphological pattern type based upon latency ranges of component peaks. Representative data show that the methodological approach is indeed sensitive in eliciting differential object-onset and motion-onset CVEP morphological patterns and may, therefore, be useful in addressing the larger research aim. Given the high temporal resolution of EEG and the possible application of high-density EEG in source localization analyses, this protocol is ideal for the investigation of distinct CVEP morphological patterns and the underlying neural mechanisms which generate these differential responses.&#160; &#160; &#160;&#160;

In this paper, we present a protocol to investigate differential cortical visual evoked potential morphological patterns through stimulation of ventral and dorsal networks using high-density EEG. Visual object and motion stimulus paradigms, with and without temporal jitter, are described. Visual evoked potential morphological analyses are also outlined.&#160;&#160;

자극 특이적 피질 시각적 자극 잠재적 인 형태 학적 패턴을 불러 일으켰다

This paper presents a methodology for the recording and analysis of cortical visual evoked potentials (CVEPs) in response to various visual stimuli using ...

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have a robust in vitro model that can be exploited for various neurobiology studies. Though primary neuron cultures (i.e., long-term hippocampal cultures) have provided scientists with models, it does not yet represent the complexity of brain network completely. In the wake of these limitations, a new model has emerged using neurospheres, which bears a closer resemblance to the brain tissue. The present protocol describes the plating of high and low densities of mixed cortical and hippocampal neurons isolated from the embryo of embryonic day 14-16 Sprague Dawley rats. This allows for the generation of neurospheres and long-term primary neuron culture as two independent platforms to conduct further studies. This process is extremely simple and cost-effective, as it minimizes several steps and reagents previously deemed essential for neuron culture. This is a robust protocol with minimal requirements that can be performed with achievable results and further used for a diversity of studies related to neuroscience.

Presented here is a protocol for the spontaneous generation of neurospheres enriched in neural progenitor cells from high density plated neurons. During the same experiment, when neurons are plated at a lower density, the protocol also results in prolonged primary rat neuron cultures.

E14-E16 스프라그 Dawley 쥐 배아에서 분리된 혼합 된 기본 해마 및 피질 뉴런에서 신경 구의 생성

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...

Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples

Mitochondrial respiration is a critical energy-generating pathway in all cells, especially retinal photoreceptors that possess a highly active metabolism. In addition, photoreceptors also exhibit high aerobic glycolysis like cancer cells. Precise measurements of these metabolic activities can provide valuable insights into cellular homeostasis under physiological conditions and in disease states. High throughput microplate-based assays have been developed to measure mitochondrial respiration and various metabolic activities in live cells. However, a vast majority of these are developed for cultured cells and have not been optimized for intact tissue samples and for application ex vivo. Described here is a detailed step-by-step protocol, using microplate-based fluorescence technology, to directly measure oxygen consumption rate (OCR) as an indicator of mitochondrial respiration, as well as extracellular acidification rate (ECAR) as an indicator of glycolysis, in intact ex vivo retinal tissue. This method has been used to successfully assess metabolic activities in adult mouse retina and demonstrate its application in investigating cellular mechanisms of aging and disease.

Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples

Described here is a detailed protocol for performing mitochondrial stress assay and glycolytic rate assay in ex vivo retinal tissue samples using a commercial bioanalyzer.

전 비보 망막 조직 샘플에서 미토콘드리아 호흡 및 글리코리시스의 결정

Mitochondrial respiration is a critical energy-generating pathway in all cells, especially retinal photoreceptors that possess a highly active metabolism. ...