이 방법은 미토콘드리아 레독스 상태가 병리학 적 조건에서 영향을받는 방법을 조사 할 수 있습니다. 그것은 또한 미토 콘 드리 아 보호에 목표로 치료 전략의 효능을 평가 하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 미토콘드리아 레독스 상태에 대한 동적 및 추적 변화의 장기 및 특정 평가를 실시간으로 허용한다는 것입니다.
이 방법은 레독스 상태 이외에 미토콘드리아 막 전위 또는 칼슘 농도와 같은 추가 지표와 동시에 기록될 수 있다. 이 프로토콜은 배양 세포, 조직 각성 및 슬라이스 배양에 적용될 수 있습니다. 먼저 스캐닝 공초점 현미경 설정을 최적화합니다.
이렇게 하려면 검출기를 12비트 또는 16비트로 설정하고 순차 적 스캔 모드를 활성화하고 두 번째 시퀀스 /트랙을 추가합니다. 두 채널모두 노출이 부족한 픽셀을 나타내는 의사 색상 조회 테이블을 선택한 다음 관심 대상에 적합한 목표를 선택합니다. 화상 진찰실에 세포가 있는 덮개 전표를 마운트합니다.
이미징 버퍼 1밀리리터를 추가하고 현미경에 챔버를 놓습니다. 접안렌즈와 전염된 빛을 사용하여 세포에 초점을 맞춥니다. 픽셀 형식과 핀홀 크기가 다른 이미지를 기록합니다.
그런 다음 다른 레이저 강도로 이미지를 기록하고 그에 따라 검출기 게인 및 임계 값을 조정합니다. 마지막으로, 다른 스캔 속도와 프레임 평균의 다른 숫자로 이미지를 기록합니다. 라이브 이미징의 경우 타임랩스 간격을 30초로 설정하고 지속 시간을 25분으로 설정합니다.
그런 다음 세포를 장착하고, 현미경에 챔버를 배치하고 이전에 입증 된 바와 같이 세포를 집중합니다. 스캐닝 모드로 전환하고 라이브 뷰에서 488 나노미터 채널을 사용하여 이미징을 위한 세포를 집중하고 찾습니다. 선택적으로, 실행당 기록된 셀수를 늘리려면 다중 점 함수를 사용하여 커버슬립당 2~3개의 뷰 필드를 이미지화합니다.
타임랩스 수집을 시작하고 5개의 이미지를 2분 베이스라인 레코딩으로 기록합니다. 챔버에 3X NMDA 용액 500마이크로리터를 추가하여 30 마이크로몰러의 최종 농도를 달성하고 10분 NMDA 응답으로 20개의 이미지를 추가로 기록합니다. 다음으로, 챔버에 4X DA 솔루션의 500 마이크로리터를 추가하고 6 개의 이미지를 더 기록합니다.
이미징 챔버에서 버퍼를 흡인하고 DTT 용액의 1밀리리터로 대체합니다. 10개의 이미지를 더 녹음한 후 레코딩을 종료하고 이미지 시리즈를 저장합니다. 이미지 분석 소프트웨어에서 데이터를 가져오면 플러그인을 클릭하고 바이오 형식을 선택한 다음 바이오 포맷 가져오기를 선택합니다.
대화 상자에서 뷰 스택에서 하이퍼스택을 선택하고 색상 모드를 기본값으로 설정하고 자동 축척을 선택합니다. 이미지를 클릭하고, 유형을 선택한 다음, 옵션에서 32비트로 이미지 형식을 변경합니다. 색상 채널을 별도의 창으로 분할하려면 이미지를 클릭하고 색상으로 이동하여 분할 채널을 선택합니다.
임계값을 조정하여 이미지를 클릭하여 분석을 위해 미토콘드리아를 선택하고 조정 및 임계값을 선택합니다. 대화 상자에서 기본 빨간색 어두운 배경을 선택하고 히스토그램을 스택합니다. 선택한 픽셀이 빨간색으로 표시되면 적용을 클릭합니다.
그런 다음 NAN에 설정된 배경 픽셀을 선택하여 모든 이미지를 처리하고 채널 2에 대해 동일한 절차를 수행합니다. 405 ~ 488 나노미터 비율을 시각화하려면 공정 및 이미지 계산기를 클릭하여 비율 이미지를 만듭니다. 대화 상자에서 이미지 2에서 동작 채널 2에서 하나의 분할이미지에서 채널 1을 선택합니다.
그런 다음 새 창 만들기를 선택하고 모든 이미지를 처리합니다. 이미지를 클릭하고 조회 테이블을 선택한 다음 불면 비율 이미지의 조회 테이블을 의사 색상으로 변경합니다. 이미지를 분석하기 위해, 비율 이미지에 개별 세포 또는 미토콘드리아 주위에 ROI를 그립니다.
ROI 관리자에 ROI를 추가하려면 분석하려면 도구를 클릭하고 ROI 관리자를 선택하고 추가를 클릭하고 모두 표시를 선택합니다. 개별 셀의 405 ~ 488 나노미터 비율을 측정하려면 ROI 관리자를 클릭하고 제어 A를 눌러 모든 ROI를 선택하고 더 많은 것으로 이동하여 다중 측정을 선택합니다. 대화 상자에서 슬라이스당 모든 슬라이스와 행 을 측정합니다.
측정값을 스프레드시트 소프트웨어로 내보낸 후 405나노미터 이미지를 선택하고 모든 ROI의 강도를 측정한 다음 측정값을 스프레드시트 소프트웨어로 다시 내보냅니다. 마찬가지로, 488 나노미터 이미지의 ROI 강도를 측정한다. 향후 참조를 위해 ROI를 저장하려면 제어 A를 눌러 모든 RO를 선택하고 더 많이 이동하여 저장을 선택합니다.
타임랩스 기록에서 이러한 대표적인 스냅샷은 NMDA 치료 전후뉴런의 비율 이미지와 DA 및 DTT로 최대/최소 교정 후의 비율을 보여줍니다. 30 마이크로 몰러 NMDA를 가진 뉴런의 처리는 몇 분 안에 미토콘드리아 산화를 유도합니다. 개별 형광 채널의 분석은 NMDA 유도미토콘드리아 산성증이 405 및 488 나노미터 흥분모두에 GFP 형광의 한 방울을 일으키는 원인이 되었다는 것을 밝혔습니다.
대조군 실험에서, DA를 가진 pretreatment는 NMDA에 의하여 어떤 추가 미토콘드리아 산화를 배제했습니다. 따라서, 405 대 488 비율은 레독스에 민감한 GFP2 형광 강도의 상당한 담금질에도 불구하고 변하지 않았다. 본 실험은 405~488나노미터 비율이 pH 변화에 영향을 받지 않는다는 것을 확인하였다.
별도의 실험에서 미토콘드리아 막 전위, 레독스 상태 및 형태학이 병렬로 평가되었다. 60 마이크로몰라 NMDA를 가진 뉴런의 처리는 테트라메틸lrhodamine 또는 TMRE 신호의 손실 및 405에서 488 나노미터 로GFP 비율에 있는 증가 귀착되었습니다 미토콘드리아의 몇몇 지연된 반올림에 선행되었습니다. 이 방법을 사용하기 시작하면 미세 설정을 신중하게 최적화하는 데 시간이 걸리는 것이 매우 중요합니다.
이것은 당신의 실험 하는 동안 건강 한 뉴런을 유지 하는 데 도움이 됩니다. 또한 항상 레이저 안전 규칙을 존중하는 것이 매우 중요합니다. 라이브 녹화 중에 약물을 조작할 때 레이저 방사선에 노출되지 않도록 하십시오.
