이 프로토콜은 두 가지 주요 생체 에너지 경로의 실시간 분석을 제공합니다: 미토콘드리아 호흡 및 글리코리시스에서 갓 해부된 전 생체 내 마우스 망막 조직. 전통적인 해마 분석은 배양단 단층 세포에 집중되었습니다, 이 프로토콜은 연구원이 갓 해부한 조직에서 미토콘드리아 활동을 연구하는 동안, 특히 망막. 이 기술은 상속된 망막 변성 마우스 모형의 망막에 있는 미토콘드리아의 활동 및 글리코리시스 깃발을 공부하는 데 사용됩니다.
그것은 망막 연구를 유용한 도구이며 잠재적 인 치료를 개발하기 위해 조직의 다른 유형에 적용 될 가능성이있다. 이 프로토콜의 가장 어려운 부분은 갓 해부 된 마우스 망막에서 품질 펀치 디스크를 얻는 것입니다, 그래서이 기술을 수행 할 개인이 좋은 망막 해부 기술을 가지고하는 것이 좋습니다. 실험 전날 센서 카트리지 카세트를 열고 1밀리리터의 교정 매체를 유틸리티 플레이트의 각 웰에 추가합니다.
이산화탄소가 없는 인큐베이터에서 하룻밤 동안 37도의 인큐베이터에서 배양하여 형광을 활성화합니다. 실험 당일, 원료로부터 희석 화합물 약물로 분석 매체를 준비한다. 섭씨 37도의 수조에서 분석 매체를 데우습니다.
텍스트 원고에 설명된 대로 컴퓨터에 분석 프로그램을 설정합니다. 메쉬 인서트가 포함된 카세트의 뚜껑을 엽니다. 각 메쉬 인서트에 코팅 믹스의 파이펫 8 마이크로리터, 다음 부드럽게 메쉬 삽입 을 통해 코팅 믹스를 배포 주위에 방울을 확산 파이펫 팁을 사용합니다.
카세트를 닫고 메쉬 인서트가 흡수를 위해 실온에서 25분 이상 배양할 수 있도록 합니다. 인큐베이션 후 분석 매체의 4밀리리터를 인서트에 직접 피펫하여 메쉬 인서트를 세척합니다. 카세트를 부드럽게 흔들어 모든 메쉬 인서트가 분석 매체로 세척되도록 합니다.
망막 펀치를 준비하려면 성인 안락사 마우스에서 눈을 방출하고 페트리 접시에 얼음 차가운 PBS에 넣은 다음 페트리 접시를 해부 현미경 아래에 놓습니다. 미세 시체를 사용하여 시신경을 잘라낸 다음 안구 외부에 부착된 여분의 근육을 조심스럽게 제거합니다. 30 게이지 바늘을 사용하여 각막 가장자리에 구멍을 뚫습니다.
그런 다음 미세 해부 미세 시저를 사용하여 각막 가장자리를 따라 원형 절단을 합니다. 날카로운 해부 집게를 사용하여 각막, 렌즈 및 유리체 유머를 아이 컵에서 제거하십시오. 미세 해부 미세 시저를 사용하여 눈 컵의 가장자리에 있는 경층 층에 몇 가지 작은 상처를 만듭니다.
두 개의 날카로운 해부 집게를 사용하여 양쪽의 경추 조직을 잡고 경마 층을 매우 조심스럽게 당겨 신경 망막에서 제거하십시오. 모든 clera가 제거되고 그대로 망막 컵이 얻어질 때까지 아이 컵 주위에 이것을 반복하십시오. 망막 컵에 방사형 컷을 만들어 평평해지고 해부 미세 시저를 사용하여 여러 개의 뚜렷한 섹션을 생성합니다.
다음으로, 1밀리미터 직경의 생검 펀처를 사용하여 평평한 망막 컵의 각 섹션에서 망막 디스크 하나를 잘라냅니다. 시신경 헤드와 동일한 거리에서 펀치. 미리 코팅된 메쉬 인서트를 집게를 사용하여 페트리 접시에 옮킨다.
두 개의 슈퍼 미세 속눈썹 브러시의 도움으로 망막 펀치 디스크를 메쉬 와 광수용체 층을 향한 신경절 세포 층 측면으로 메쉬 인서트의 중앙에 놓습니다. 센서 카트리지를 로드하려면 수화 센서 카트리지 플레이트 카세트를 섭씨 37도 인큐베이터에서 꺼내십시오. 하이드로 부스터 커버를 제거한 후 센서 카트리지를 유틸리티 플레이트에 다시 놓습니다.
파이펫 팁을 45도 각도로 잡고, 사출 포트의 반대 쪽 벽에 대한 팁의 경사와 함께 사출 포트에 피펫 팁을 중간 삽입하여 적절한 포트에 주입 화합물 솔루션의 원하는 볼륨을 로드합니다. 화합물을 각 포트에 부드럽게 로드합니다. 센서 카트리지를 기기에 로드하여 시작 실행 버튼을 클릭하여 교정을 위해 장비 트레이를 엽니다.
센서 카트리지를 기기에 넣고 보정을 시작할 준비가 된 버튼을 클릭합니다. 분석 매체의 원하는 부피를 각 우물에 적재하여 각 우물에 적재하여 플레이트를 캡처합니다. 집게를 사용하여 망막 펀치 디스크가 들어있는 메쉬 인서트의 테두리를 잡고 페트리 접시에서 꺼내십시오.
흡수닦기 티슈에 메쉬 인서트 의 바닥을 가볍게 두드려 여분의 액체를 제거하고 아슬레 캡처 플레이트의 우물에 넣습니다. 망막 펀치가 있는 모든 메쉬 인서트가 빈 메쉬 인서트로 배경 보정 우물과 빈 우물을 채우는 아슬렛 캡처 플레이트에 배치될 때까지 이 단계를 반복합니다. 두 개의 Graefe 집게를 사용하여 각 메쉬 인서트의 테두리를 신중하고 부드럽게 눌러 이 것들이 아일렛 캡처 플레이트의 바닥에 단단히 삽입되도록 합니다.
로드된 아슬렛 캡처 플레이트를 섭씨 37도 인큐베이터에 넣고 5분간 워밍업한 다음 교정이 완료된 후 유틸리티 플레이트를 배출합니다. 망막 펀치가 들어 있는 islet 캡처 플레이트로 교체하고 로드 셀 플레이트 버튼을 클릭하여 분석 실행을 다시 시작합니다. 실행이 완료되면 센서 카트리지와 방출 버튼을 클릭하여 망막 펀치가 포함된 islet 캡처 플레이트를 꺼내서 데이터가 ASYR 파일로 자동으로 저장되고 화면이 자동으로 변경되어 표시되도록 완료된 버튼을 클릭합니다.
OCR 및 ECAR 추적을 모두 나타내는 OCR 추적 및 글리코리질 속도 분석기를 보여주는 미토콘드리아 응력 분석은 갓 해부된 1mm 망막 펀치 디스크를 사용하여 수행하였다. 미토콘드리아 스트레스 분석에서 Bam15는 미토콘드리아 ATP 생산에서 양성자 그라데이션을 분리하여 OCR을 최대 수준으로 증가시도록 주입되었습니다. 로테네안 및 항마이신 A는 각각 복잡한 하나 및 복잡한 3개에서 미토콘드리아 호흡을 억제하도록 주입되어 OCR이 최소 수준으로 떨어졌다.
OCR의 최대 수준과 기저 OCR 수준의 마지막 측정 사이의 차이는 미토콘드리아 예비 용량을 반영합니다. 글리코리틱 속도 분석에서 로테네안 과 항마이신 A의 주사는 미토콘드리아 호흡을 차단하고 글리코리시스를 더 높게 유도합니다. 글리코리시스는 헥소키나아제 결합을 위한 포도당과 경쟁하는 2-deoxy-d-포도당을 주입하여 압수되어 ECAR가 최소한의 수준으로 떨어지게 합니다.
글리코 ECAR 기저 레벨의 마지막 측정에서 글리코 ECAR의 최대 수준 사이의 차이는 글리코 리저브 용량을 반영한다. 신뢰할 수 있는 데이터를 생성하려면 망막 펀치 디스크의 품질을 얻고 1.5시간 이내에 총 해부 시간을 제한하는 것이 중요합니다. 실험후, 망막 디스크의 단백질 함량의 DNA를 잘 정량화하고 이를 사용하여 해마 데이터를 정상화할 수 있다.
그래서 이 프로토콜은 망막에 있는 발달, 노화 및 질병을 공부하기 위하여 이용되었습니다. 포도당 또는 지방산과 같은 상이한 연료 기판에 대한 조직 선호도 또는 의존도 분석되었다.
