이 프로토콜은 제한된 수의 미토콘드리아를 포함하는 작은 조직에서 까다로운 절차인 분리된 미토콘드리아의 파셀레이션에 의해 신경 내부의 미토콘드리아 기능을 평가할 수 있게 해줍니다. 이 기술은 현장에서 보존 된 미토콘드리아에서 산소 소비 및 ROS 생산과 같은 미토콘드리아 기능을 동시에 분석 할 수있는 가능성을 제공합니다. 여러 기판, 억제제 및 언커플러 설계 프로토콜이 있습니다.
몇몇 질병은 미토콘드리아 기능, 특히 두 가지 당뇨병 또는 화학요법에 의해 유도되는 신경병증을 공유한다. 이러한 질병에서 미토콘드리아 산화 인산화의 손상은 질병 발생을 지시하는 유일한 신호입니다. 이 방법은 미토콘드리아 질병 메커니즘의 조사, 미토콘드리아 부스터 또는 개선 된 신경 병증 성 통증과 같은 치료법 검색을 통해 신경 생물학, 생화학 및 약리학에 대한 통찰력을 제공합니다.
시작하려면 2.1 밀리리터의 MR 버퍼를 각 챔버에 피펫팅하여 산소 센서를 교정하십시오. 마개로 닫고 거품이 형성 될 때까지 챔버로 공기를 끌어들입니다. 질량당 산소 플럭스가 안정화될 때까지 교정 모드에서 섭씨 37도에서 한 시간 동안 저어줍니다.
HRR 소프트웨어를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 편광 산소 센서의 공기 교정을 수행합니다. 조직 준비를 위해, 좌골 신경을 TP 완충액이 충분한 페트리 접시에 넣어 덮으십시오. 포셉으로 신경의 한쪽 끝을 잡고 다른 포셉으로 신경 번들을 수평으로 당깁니다.
먼저, 표시된 조직을 조직 투과를 위해 하나의 밀리리터 TP 버퍼가 들어있는 작은 접시로 옮깁니다. 투과를 시작하려면 포셉으로 조직을 사포닌 밀리리터 당 50 마이크로 그램의 TP 버퍼가 들어있는 다른 접시로 옮깁니다. 플레이트를 마이크로플레이트 진탕기에 넣고 30분 동안 부드럽게 저어준다.
그런 다음 포셉으로 조직을 1 밀리리터 MR 버퍼가 들어있는 신선한 접시에 옮기고 10 분 동안 부드럽게 저어줍니다. 포셉으로 조직을 교정된 HRR 챔버로 옮깁니다. HRR 챔버를 2.1 밀리리터의 MR 버퍼로 채 웁니다.
Amplex Red와 peroxidase를 각각 다섯 마이크로 몰의 최종 농도와 밀리리터 당 두 단위로 첨가하십시오. 그런 다음 투과성 좌골 신경을 추가하십시오. 기기의 형광 센서를 부착합니다.
그런 다음 소프트웨어의 제어 섹션에서 조명을 끄고 소프트웨어에서 옥시 그래프에 연결"프로토콜 편집으로 이동"을 클릭하고 조직 무게를 삽입하십시오. 레이아웃으로 이동하여 단위 샘플 당 특정 플럭스 "옵션을 선택하십시오. 그런 다음 플롯을 선택하여 산소 소비량 판독값에 동시에 액세스하고, 필요한 경우 과산화수소 생산에 액세스합니다.
약 10분 정도 기다립니다. 챔버의 교정을 위해 두 개의 펄스의 과산화수소를 주입하고, 각각 260 마이크로 몰의 최종 농도로 주입하십시오. 미토콘드리아 콤플렉스 II 기질인 숙시네이트 20마이크로리터를 주입하여 미토콘드리아 전자 수송 시스템을 활성화시킨다.
ATP 합성을 활성화하기 위해 20 마이크로 리터의 ADP를 추가하십시오. 순차적으로, 막 완전성의 지표로서 다섯 마이크로리터의 시토크롬 c를 첨가한다. 산소 소비의 더 이상의 감소가 관찰되지 않을 때까지 올리고마이신 밀리리터 당 0.2 마이크로그램의 분취량으로 적정한다.
산소 소비의 더 이상의 증가가 관찰되지 않을 때까지 리터 FCCP 당 0.5 마이크로몰의 분취량으로 적정하고, 미토콘드리아 언커플러. 실험을 끝내려면 두 마이크로 리터의 안티마이신 A를 주입하고 다섯 밀리몰의 최종 농도를 수행하고 흐름이 안정화 될 때까지 기다리십시오. 명령 모음으로 이동합니다.
소프트웨어에서 다중 감각 검색". 컨트롤을 클릭하십시오"그런 다음 파일 저장을 누르고 연결을 끊습니다. 저장된 파일을 열고 질량 트레이당 산소 플럭스를 선택하여 실험적 산소 소비 결과를 얻습니다.
Shift + 마우스 왼쪽 버튼을 눌러 주사 사이의 창을 수동으로 선택합니다. 마크로 이동하여 통계를 선택하여 기질, 억제제 및 언커플러 프로토콜의 각 주입에 대한 결과를 시각화합니다. 과산화수소 생산을 위해 앰프 기울기 트레이스와 동일한 절차를 수행하십시오.
ATP 시타제 활성에 의해 촉진된 막 전위의 감소는 산소 소비를 가속화시켰다. 외인성 시토크롬 C의 첨가는 호흡의 최소한의 자극만을 촉진하여, 이 준비에 대한 미토콘드리아 외막 완전성을 인증하였다. 절대 산소 흐름이 기록되었고 호흡에서 6.3 % 증가 만 관찰되어 조직 준비의 양질을 나타냅니다.
산소 소비 및 ROS 생산은 전자 수송 시스템에 연료를 제공하는 상이한 기판의 존재 하에 동시에 측정되었다. 미토콘드리아 복합체에 대한 피루베이트와 말레이트의 첨가는 호흡을 증가시켰다. 콤플렉스 II에 대한 숙시네이트의 추가의 첨가는 또한 산소 소비를 증가시킨다.
따라서 다른 기판을 테스트 할 수 있습니다. ROS 생산도 증가하여 전자 수송 시스템에서 산소가 누출되었음을 나타냅니다. 포화 농도에서 아데노신 디포스페이트의 첨가는 ATP 형성을 유도하는 산소 소비를 증가시키고, ROS 생산을 감소시켰다.
대조적으로, 올리고 적정은 산소 소비를 감소시키고 ROS 생산을 증가시켰다. 이것은 permeablized 좌골 신경이 미토콘드리아 생리학에서 표준 관계를 복제 할 수 있음을 시사했다. 예상되는 산소 플럭스 변화에 부합하는 FCCP 및 레티논의 첨가는 미토콘드리아 생리학 및 생체 에너지 프로파일이 투과 된 좌골 신경에서 보존되었음을 확인합니다.
가장 중요한 단계는 조직 섹션을 부드럽게 준비하고 모든 챔버 개구부가 제대로 청소되었는지 확인하는 것입니다. 미토콘드리아 기능의 변화는 기능 장애 또는 낮은 미토콘드리아 수 때문일 수 있습니다. 따라서 인용 된 합성 효소 활성 및 PCR에 의한 미토콘드리아 DNA 함량 확인이 권장됩니다.
