DRS. 코펜하겐 대학 (덴마크)에서 CJP Grimmelikhuijzen와 마이클 윌리엄슨은 aequorin이 플라스미드 제공을위한 감사합니다. 우리의 공동 작업자, ARS - USDA (TX, 미국)에서 박사 로널드 J. Nachman는 펩타이드 합성 및 NOVOstar 플레이트 리더를 제공 인정받고 있습니다.

1. 안정적인 세포 라인의 구축 <ol><li> 관심의 GPCR을 복제하고 포유류의 시스템에 최적의 ribosomal 바인딩 (코작, 1986)의 시작 코돈 주변 5 &#39;코작의 합의 순서 (GCCA / GCCATGG)을 통합 발현 벡터에 삽입. 여기서 우리는 모기 kinin 수용체 (.; Pietrantonio 외, 2005. 홈즈 외, 2003)에 대한 체크 kinin 수용체에 대한 플라스미드 pcDNA3.1/Bm-KR 및 플라스미드 pcDNA3.1/Aedae-KR을 사용합니다. 벡터는 포유 동물 세포에 선택에 대한 박테리아와 네오 마이신 (G418) 저항의 선택에 대한 암피실린 저항을 인코딩 - pcDNA3.1 (). </li><li> CHO - K1 빈 셀 (plasmids 제외) (ATCC, 머내서스, VA, 미국) 또는 37 T - 25 플라스크의 다른 원하는 세포주 (BD 팔콘) · 5 % CO 2 humidified 인큐베이터에서 C (홈즈 외 그로 ., 2003). 별도로 명시하지 않는 한 모든 추가 incubations 이러한 조건 하에서 수행되어야합니다. 함께 성장 매체에서 빈 셀을 (F12K 매체 10% 태아 소 혈청)를 유지 1X 항생제 - Antimycotic (Invitrogen, CA). </li><li> 세포를 분리하기 위해 37 ° C.에 대한 모든 솔루션을 따뜻하게 T - 25 플라스크에 오래된 매체를 제거하고 PBS로 5 ML 씻어 후 PBS를 제거합니다. 세포를 trypsinize하려면 2 분 2 ML PBS - 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 (34 ML PBS, 2 ML 7.5 % 나트륨 중탄산염, 4 ML 10X 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))을 추가합니다. 3 ML 미디어를 추가하고 세포를 섞어 매체를 대기음 아래. 원뿔 튜브와 ~ 2백~3백g (1,000 RPM) 2 분 원심 분리기로 세포와 매체를 전송합니다. 뜨는 취소 5 ML 매체에서 다시 중지 세포. 신선한 매체 1시 5분 또는 1시 10분의 농도에 resuspended 세포를 희석하고 새로운 T - 25 플라스크에 5 ML을 전송. </li><li> 세포가 항생제없이 (2-3 일 정도) 건강하게 성장하는 씨앗 CHO - K1 세포를 T - 25 조직 문화 flasks로 성장 매체들이 야간 성장 후 그들은 약 30 %의 합류 (약 18 시간)까지. confluency의 정도는 거꾸로 형광 현미경 하에서 관찰 세포에 의해 결정하실 수 있습니다. </li><li> 각 샘플에 대해 다음과 섞어 준비 : <ol><li> 100 μl Opti - 멤 전 세럼 중간 (Invitrogen)을 감소와 함께 : 1-2 μg의 DNA (265μg/μl pcDNA3.1/Aedae-KR의 사용 4μl 예)를 결합합니다. </li><li> DNA에 Lipofectin의 1:1 비율을 만들고, 100 μl F12K 혈청 무료로 중간에 6 μl Lipofectin 시약 (InvitrogenTM)를 섞는다. 30-45 분 실온에서 알을 품다. </li></ol> 부드럽게 (총 부피 = 200 μL)를 드롭 현명한 방식으로 1.5.2과 1.5.1에​​서 솔루션을 섞는다. 10-15 분 실온에서있게 해줘요. </li><li> 세포에서 오래된 성장 매체를 제거하고 5 ML F12K 혈청 무료 매체로 세포를 세척 후 F12K 혈청 무료 매체를 제거합니다. 15 ML 관에서 부드럽게 드롭 현명한 방식으로 신선한 F12K 매체의 1.8 ML로 transfection 혼합물을 섞는다. 그런 다음, PBS와 단계 1.5에서 세포를 씻어하고 세포에 transfection이 새로운 솔루션을 추가합니다. 18 시간 동안 부화. </li><li> 항생제없이 중간 플러스 10% 태아 소 혈청을 F12K와 하룻밤 부화 매체를 변경합니다. 또 18 시간 동안 항생제없이 F12K 매체 플러스 10% 태아 소 혈청 (분리 세포에 대한 단계 1.3 참조) 두 개의 T - 25 flasks로 세포를 분리. </li><li> 선택적 매체 (F12K 매체 플러스 800μg/ml GENETICIN와 10% 태아 소 혈청, Invitrogen)로 매체를 교체합니다. 3-4주에 대한 선택적 매체를 사용하여 세포 문화. 시간이지나면서이 안정적으로 자신의 게놈 DNA에 플라스미드를 통합해야 전지 선택합니다. 유지 보수 매체 (F12K 매체 플러스 400μg/ml GENETICIN와 10% 태아 소 혈청)를 사용하여 세포를 유지 계속합니다. 주기적으로 예기치 않은 오염의 경우에는 손실을 방지하기 위해 동결 미디어의 1시 1분 비율 (20 % DMSO와 선택적 중간)와 세포 라인을 정지. </li><li> clonal 세포 라인을 선택 : 첫 번째 단계로, trypsinize 및 단계 1.3 유지 보수 매체와 1.8 단계에서 세포를 원심 분리기. 다시 중지 전지 5 ML 유지 보수 매체에 세포의 0.5 ML은 일시 중단하고 10X 희석를 만들기 위해 신선한 유지 보수 매체 4.5 ML를 추가 가져가라. 단일 세포에 대한 선택 각 잘 ~ 100 μl를 추가, 96 잘 접시 12 우물에 10 배 희석을 전송합니다. </li><li> 100 μl 당 하나의 셀 (; 10X 직렬 dilutions의 총계 ~ 19 일반적으로 최종 희석은 10 -19 10 -11의 범위에서 될)의 이론적 최종 정지에 대해 이러한 세포의 10X 시리얼 dilutions을 계속 . 즉시 각 희석 다음, 96 잘 접시 12 우물에 희석 100 μl를 전송합니다. 18시간 보육 후, 거꾸로 빛 또는 유일한 하나의 세포를 포함하거나 분명 하나의 세포에서 나눈 두 세포를 포함하는 것처럼 형광 현미경 마크 웰스 이하 96 자 번호판을 관​​찰합니다. 모든 삼일 매일 및 변경 매체를 관찰 유지. </li><li> 우물은 80 % conflu 경우천만에 (주일), 200 μl PBS로 표시된 우물을 씻어 PBS - 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션을 100 μl으로 그들을 trypsinize. 잘 1 ML 유지 보수 매체와 6 자 판 잘 하나에 표시된 각 전송 세포. 3 일간 그 세포를 성장 다음 각 T25 플라스크에 세포를 전송합니다. 작용제의 펩티드 (2 절 참조)과 칼슘 bioluminescence 분석을 사용하여 이러한 세포를 테스트합니다. </li><li> 칼슘 bioluminescence 플레이트 분석에서 가장 높은 응답 단계 1.11에서 1 셀 라인을 선택하고 두 번째로 단일 셀 선택 다음 단계 1.9-1.11에 대한 수행합니다. 주기적으로 세포 라인을 정지. </li><li> 단계 1.12에 설명되어있는 보조 선택에서 칼슘 bioluminescence 플레이트 분석에서 가장 높은 응답 2-3 셀 라인을 선택하고 추가로 칼슘 bioluminescence 플레이트 assays를위한 문화에서 그들을 유지합니다. 통과 번호를 추적할 수 있습니다. 더 많은 구절과 셀 라인이 지속적으로 실적을 중지하면 당신은 항상 그들에게 돌아갈 수 있도록 때때로 초기 구절에서 세포 라인을 정지. </li></ol> 2. 칼슘 bioluminescence 플레이트 분석 <ol><li> 발현 벡터에 관심있는 리포터 유전자를 Ligate. 여기 aequorin 플라스미드 mtAEQ/pcDNA1을 (DRS. CJP Grimmelikhuijzen과 마이클 윌리엄슨, 코펜하겐 대학, 덴마크의 선물) 사용됩니다. E.에있는 플라스미드를 변환 대장균 세포의 MC1061/PS (Invitrogen)과 QIAprep 스핀 miniprep 키트 (Qiagen 주식 회사)를 사용하여 정화. 최종 단계에서 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)이 아니라 물없이 트리스 버퍼와 플라스미드를 elute. </li><li> 보수 매체에서 원하는 수용체를 표현하는 단계를 1.13에서 세포 라인을 성장. 세포이 90 % 합류하는 경우, trypsinize 원심 분리기 다음 단계 1.3는 5 ML 유지 보수 매체에있는 세포를 다시 일시 중지합니다. 세포를 (유지 보수 매체에 대한 10 배) 희석하여 현미경 하에서 세포 카운터 (브라이트 - 라인 Hemacytometer)와 휴대폰 번호를 계산합니다. 약 2 × 10 5 세포 / ML에 휴대폰 번호를 조정 (9 사각형 중 하나에 평균 20 세포는 Hemacytometer에 보여주었다). 여섯 잘 접시의 각 우물에 미디어에 씨앗이 ML 희석 세포. 24 시간 (세포 배양 후 약 60 %에 도달해야 confluency)에 품어. </li><li> OPTI - 멤 매체에 6 우물 판에서 미디어를 변경합니다. 각 잘 들어, microfuge 튜브 4 μl FuGENE 6 Transfection 시약 (로체 Biochemicals)에 96 μl OPTI - 멤를 섞어 5 분 실온에서 앉아 보자. 각각의 튜브에 aequorin / pcDNA 1 플라스미드 DNA 1 μg를 추가하고 나서 부드럽게 15-20 분 상온에서 품어, 1 분 샘플을 흔들. 부드럽게 잘 번호판을 흔들어 동안 dropwise 방식으로 각 우물에 각 혼합물을 추가합니다. 6 시간 동안 접시를 부화하고 항생제없이 10% 태아 소 혈청을 포함하는 미디어를 F12K 수있는 매체를 변경합니다. </li><li> 24 시간 동안 식스 웰 플레이트에있는 세포를 잠복기 후, trypsinize 원심 분리기 및 단계 1.3로 세포를 다시 일시 중지합니다. 단계 2.1로 400,000 셀 / ML에 휴대폰 번호를 카운트하고 96 잘 흰색 얇은 바닥 microtitre 플레이트 (코스타 3610)의 각 우물에 100 μl (총 40,000 cells/100 μl)를 전송합니다. 80 %의 세포 confluency까지 24 시간 동안 부화. 이것은 bioluminescence 분석을위한 세포의 최적 농도이다. </li><li> 어둠 5 μm의의 coelenterazine (Invitrogen)에 포함된 칼슘이없는 DMEM 매체 (Invitrogen)의 90μl/well 준비 (coelenterazine 것은 민감한 빛입니다.) 2.4에서 접시를 타고 이전 미디어를 제거하고 각 우물에이 90μl를 추가합니다. 37 어둠 속에서 3 시간 동안 접시를 품어 ° C와 접시에있는 세포가 시험을 준비하는 이후 5% CO 2. </li></ol> 3. 악기 운영 및 데이터 분석 <ol><li> 각 bioluminescence 플레이트 판독기가 다릅니다. 우리는 bioluminensence 모드에서 NOVOstar (BMG의 Labtechnologies) 플레이트 판독기를 사용하여 우리의 분석을 수행합니다. 다른 악기를 사용하는 경우 프로토콜을 적응해야합니다. </li><li> 사용하기 전에 플레이트 판독기 펌프 (또는 PRIME 펌프) 정리. 접시 홀더에 접시를 올려 놓기 전에 방에 불을 끕니다. 플레이트 소유자가 폐쇄되면에 불을 켭니다. </li><li> 칼슘없는 DMEM 매체에서 펩티드를 (1.5 ML Eppendorf 튜브) Solubilize. &quot;기음 깊이&quot;를 사용하기 전에 펩타이드 솔루션의 &quot;위치 결정&quot;을 설정합니다. 펩티드의 농도 (FFFSWG - NH2, Aedes - K1 - 3, 또는 기타 원하는 펩타이드)를 다양한 10 μl (10X)로 세포를 도전 즉시 발광 녹음을 시작합니다. 우리는 50 초 총 시간에 대한 각 잘 매 2 초 동안 발광 (465 nm의)를 기록하는 악기를 설정했습니다. </li><li> 이러한 적극적인 아날로그 (아날로그 FFFSWGa이 타네 - Bageshwar 외. 2009 년, 사용되고있다)와 같은 벡터에만 transfected 세포로 대조군과 같은 긍정적인 컨트롤을 포함시키십시오. 부정적인 제어 (대표 결과를 참조) 기준 임계값을 설정하는 데이터 분석 중에 필요합니다.관련없는 비활성 펩타이드 또한 대조군으로 추가할 수 있습니다. </li><li> 실행이 완료되면, 악기 펌프 (또는 PRIME 펌프) 다음 다음 펩타이드 샘플 장소를 씻으십시오. 데이터를 저장하고 다시 펌프를 세척. </li><li> 데이터 처리 : Microsoft Excel의 데이터 시트에 각 우물에서 발광의 데이터를 전송합니다. </li><li> Excel에서 GraphPad 소프트웨어 주식 회사 (샌디에고, CA, 미국)에서 프리즘 소프트웨어 4.0 데이터를 붙여 넣습니다. 다양한 펩타이드의 농도는 X - 축이며 bioluminescence 단위는 Y 축입니다. 데이터를 정상화하려면 로그 - 반응 곡선을 플롯. 각 펩타이드에 대한 농도 - 반응 곡선을 얻기 위해 비선형 회귀 곡선에 맞게 분석 (변수 경사와 sigmoidal 선량 - 반응 방정식)을 선택합니다. 프로그램 플롯 결국 가치 및 EC 50 제공합니다. </li><li> 각 실험 데이터 분석을 위해 세 번 반복해야합니다. </li></ol> 4. 대표 결과 : CHO - K1 세포로 표현하면, 모기 Aedes aegypti kinin 수용체는 multiligand 수용체와 같은 행동과 기능의 세 endogenours Aedes kinins, Aedae kinins 1-3 1 NM으로 낮은 농도에 응답, 단독 칼슘 bioluminescence 플레이트 분석을 사용하여 테스트 . Aedae - K -, 얻은 힘의 순위의 순서가 Aedae - K - 3, 16.04 NM의 각 EC 50 값에 따라 Aedae - K - 3&gt; Aedae - K - 2&gt; Aedae - K - 1,라고 그림 1 보여줍니다 통계 (Pietrantonio 외., 2005) (P &lt;0.05) 크게 달랐다 2, 26.6 NM 및 Aedae - K - 1, 48.85 NM. 우리는 또한 kinin 잔류물은 kinin 펩타이드 - 수용체 상호 작용에 대한 중요한 결정이 분석를 사용합니다. 곤충 kinin의 펩티드는 또한 핵심으로 알려진 생물 학적 활동에 필요한 최소한의 순서를 나타내는 C - 터미널 pentapeptide을 서로 나누세요. 표 1에서 kinin 펩타이드 코어 analogs는 핵심 kinin pentapeptide FFSWGa의 알라닌 대체 시리즈로 합성되었으며 칼슘 bioluminescence 플레이트 분석 (타네 - Bageshwar 외., 2006)에 의해 테스트. 우리는 아미노산 PHE 1 TRP 4 두 수용체에 대한 곤충 kinins의 활동에 필수적인 것으로 나타났다. 분석은 또한 향상된 biostability위한 펩티드를 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 표 2는 체크 재조합 kinin 수용체와 그림 2에서 테스트 아미노산 isobutyric 산성 (Aib)이있는 설계 kinin analogs은 칼슘에 의해 CHO - K1 세포 라인을 표현 틱 kinin 수용체 6 알파 - 아미노 isobutyric 산성 analogs의 활동 비교를 보여줍니다 보여줍니다 bioluminescence 플레이트 분석 (타네 - Bageshwar 외., 2009). hexapeptide 아날로그 FFFSWGa는 수용체 활동에 대한 긍정적인 제어에 추가됩니다. 아날로그 FF [Aib] WGA이 hexapeptide 제어 아날로그보다 적극적인 결과. 이 aminoisobutyric 산성 교체, [Aib] FF [Aib] WGA와 아날로그 (표 2 및 그림 2) 테스트를 두 번 교체 analogs 중 가장 강력했다. 이 분석이되었으며, Nachman 및 Pietantonio (2010), Nachman 외 볼 적용할 수있는 방법에 대한 더 많은 예제. (2009), 타네 - Bageshwar 외. (2008a), 그리고 타네 - Bageshwar 외. (2008b). <img src="/files/ftp_upload/2732/2732fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. Aedes의 견적은 칼슘 bioluminescence 플레이트 분석하여 CHO - K1 E10 세포에 대한 효과적인 농도 (EC 50) kinins. 농도 - 반응 곡선의 y 축은 각에 대한 관찰 최대한 응답의 백분율로 표시 bioluminescence 단위로부터 얻은 것입니다 펩타이드. 데이터 포인트는 세 독립적인 실험을하는 동안 얻은 여섯 복제의 평균을 나타냅니다. 바 표준 오류를 나타냅니다. (A) Aedae - K1 EC 50 추정은 = 48 NM. (B) Aedae - K2 EC 50 추정은 = 26 NM. (C) Aedae - K3 EC 50 추정은 = 16 NM. EC 50 Aedae - K3 &lt;EC 50 Aedae - K2 &lt;EC 50 Aedae - K1, P는 &lt;0.05. 통계 분석 및 그래프는 GraphPad의 프리즘 4.0 소프트웨어와 함께했다. <img src="/files/ftp_upload/2732/2732fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. 칼슘 bioluminescence 플레이트 분석하여 CHO - K1 세포 라인을 표현 체크 kinin 수용체 6 알파 - 아미노 isobutyric 산성 analogs의 활동 비교. y 축은 농도에서 관찰 bioluminescence의 백분율로 각 아날로그에 대한 퍼센트 최대한 bioluminescence 단위를 나타냅니다 각 아날로그에 대한 검사를 모든 농도 사이에 관찰 최대한의 반응 비교. 통계 분석 및 그래프는 GraphPad의 프리즘 4.0 소프트웨어와 함께 수행했다. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="2"> 수용체 세포주 틱 </td><td colspan="2"> 모기 수용체 세포주 </td></TR&gt; <tr><td> 펩티드 </td><td> EC 50 (NM) </td><td > 1 ㎜에서 최대한 bioluminescence 응답 </td><td> EC 50 (NM) </td><td> 1 ㎜에서 최대한 bioluminescence 응답 </td></tr><tr><td> AFSWGa </td><td> 나 </td><td> 나 </td><td> 나 </td><td> 나 </td></tr><tr><td> FASWGa </td><td> 586 </td><td> 5600 </td><td> ND </td><td> 400 </td></tr><tr><td> FFAWGa </td><td> 64 </td><td> 12,800 </td><td> 621 </td><td> 3050 </td></tr><tr><td> FFSAGa </td><td> 나 </td><td> 나 </td><td> 나 </td><td> 나 </td></tr><tr><td> FFSWAa </td><td> 417 </td><td> 10,600 </td><td> 2800 </td><td> 1830 </td></tr><tr><td> FFSWGa </td><td> 590 </td><td> 10,800 </td><td> ND </td><td> 525 </td></tr><tr><td> FSWGa </td><td> 나 </td><td> 나 </td><td> 나 </td><td> 나 </td></tr><tr><td> FFSWa </td><td> 나 </td><td> 나 </td><td> 나 </td><td> 나 </td></tr><tr><td> FFSWG - OH </td><td> 나 </td><td> 나 </td><td> 나 </td><td> 나 </td></tr><tr><td> FFFSWGa </td><td> 259 </td><td> 13,000 </td><td> 562 </td><td> 10,000 </td></tr><tr><td> FF [Aib] WGA </td><td> 29 </td><td> 12,700 </td><td> 445 </td><td> 9300 </td></tr></tbody></table> 표 1. 추정 potencies (EC 50)와 진드기와 모기 수용체 transfected 세포 라인에 대한 테스트의 모든 펩티드의 최대한의 bioluminescence 응답 *. * EC 50 반 최대한의 반응을 유도하는 데 필요한 농도를 추정하고있다. I : bioluminescence 응답 미만 300 단위 (벡터 전용 transfected 세포 수준) 인 경우 비활성. A : 펩타이드 FFSWGa에있는 각각의 물질 알라닌로 대체되었습니다 위치. ND : 아날로그가 테스트했지만 역시 매우 활성화되지 이하 molarities에 적극 아니었 따라서 EC50 결정 수 없습니다되었습니다. <table border="1"><tbody><tr><td> K - Aib - 1 </td><td> [Aib] FF [Aib] WGA </td></tr><tr><td> K - Aib - 2 </td><td> [α MeF] FF [Aib] WGA </td></tr><tr><td> K - Aib - 3 </td><td> AC - R [Aib] FF [Aib] WGA </td></tr><tr><td> K - Aib - 4 </td><td> AC - R [β3F] FF [Aib] WGA </td></tr><tr><td> K - Aib - 5 </td><td> [Aib] RFF [Aib] WGA </td></tr><tr><td> K - Aib - 6 </td><td> [Aib - Aib - Aib - Aib] RFF [Aib] WGA </td></tr></tbody></table> 표 2. 아미노산 isobutyric 산성 (Aib)이있는 Kinin analogs (K)는 체크 재조합 kinin 수용체에 대한 테스트. AC : 아세틸, α 나 : α - 메틸 페닐알라닌, β3F : β3 - 페닐알라닌, : 아미드.

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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identification+of+the+insect+adipokinetic+hormone+receptors.">Molecular identification of the insect adipokinetic hormone receptors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 99, 3446-3451 (2002).</li><li>Stables, J., Green, A., Marshall, F., Fraser, N., Knight, E., Sautel, M., Milligan, G., Lee, M., Rees, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bioluminescent+assay+for+agonist+activity+at+potentially+any+G-protein+coupled+receptor.">A bioluminescent assay for agonist activity at potentially any G-protein coupled receptor.</a> Analytical Biochemistry. 252, 115-126 (1997).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리는이 프로토콜을 사용하여 Arachnida (진드기, 진드기 및 스파이더), 틱 k​​inin 수용체에서 발견된 최초의 neuropeptide 수용체의 기능 특성을 수행할 수있었습니다. 이 방법은 세 가지 기본 애플 리케이션을했다. 첫째, 기술은 리간드 활동 측정을 통해 수용체 deorphanization에 대해 적용할 수 있습니다. 둘째, 분석은 리간드 - 수용체 구조 - 활동 관계 (SAR)을 해결할 수 있습니다. 셋째, 방법은 약물 발견에 사용할 수 있습니다. 또한,이 프로토콜은 거의 모든 GPCR에 agonists 또는 antagonists의 활동을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 작은 도서관의 심사를 위해이 프로토콜을 적응하기 시작하고 있습니다. 우리가 활용 세포 라인은 유비 쿼터스 G 단백질 G 16 표현하지 않습니다. 우리는 그것이 필요하지 않았기 때문에 GQ 단백질과 세포내 칼슘 캐스케이드를 통해 arthropod kinin 수용체가 신호를 여기에 같이 그들은 포유 동물 세포에 신호 특성을 보존.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td><td></td></tr><tr><td> CHO - K1 세포 </td><td> ATCC </td><td> CCL - 61 </td><td> 머내서스, VA, 미국 </td></tr><tr><td> F12K 매체 </td><td> Invitrogen </td><td> 21,127 </td><td></td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> F0643 </td><td></td></tr><tr><td> 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (10X) </td><td> Invitrogen </td><td> 15,400 </td><td></td></tr><tr><td> 항생제 - Antimycotic </td><td> Invitrogen </td><td> 15,240 </td><td></td></tr><tr><td> Opti - 멤 널 혈청 매체를 감소 </td><td> Invitrogen </td><td> 31,985 </td><td></td></tr><tr><td> Lipofectin 시약 </td><td> Invitrogen </td><td> 18292-011 </td><td></td></tr><tr><td> GENETICIN </td><td> Invitrogen </td><td> 10131035 </td><td></td></tr><tr><td> MC1061/P3 Ultracomp </td><td> Invitrogen </td><td> C663 - 03 </td><td></td></tr><tr><td> QIAprep 스핀 miniprep 키트 </td><td> Qiagen 주식 회사 </td><td> 19,064 </td><td></td></tr><tr><td> FuGENE 6 Transfection 시약 </td><td> 로체 </td><td> 11 814 443 001 </td><td></td></tr><tr><td> 96 - 웰 흰색 얇은 바닥 microtitere 플레이트 </td><td> 코스타 </td><td> 3610 </td><td></td></tr><tr><td> 칼슘없는 DMEM 매체 </td><td> Invitrogen </td><td> 21,068 </td><td></td></tr><tr><td> Coelenterazine </td><td> Invitrogen </td><td> C - 2944 </td><td></td></tr><tr><td> 브라이트 - 라인 Hemacytometer </td><td> Hausser 과학 </td><td></td><td> 호셤, PA </td></tr><tr><td> NOVOstar </td><td> BMG의 Labtechnologies </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 프리즘 소프트웨어 4.0 </td><td> GraphPad 소프트웨어 주식 회사 </td><td></td><td> 샌디에고, CA, 미국 </td></tr><tr><td> T - 25 T - 75 Flasks </td><td> BD 팰컨 </td><td> 353014 및 353135 </td><td></td></tr></tbody></table>

a calcium bioluminescence assay for functional analysis of mosquito (aedes aegypti) and tick (rhipicephalus microplus) g protein-coupled receptors

Arthropod 호르몬 수용체들은 많은 중요한 생리 및 행동 과정을 조절 같은 소설 살충제에 대한 잠재적인 공격 대상입니다. 그들의 대다수는 G 단백질 결합 수용체 (GPCRs)의 superfamily에 속합니다. 우리는 진드기와 모기의 arthropod kinin 수용체를 특성화에 초점을했습니다. Arthropod의 kinins는 myotropic, 이뇨제, 그리고 신경 전달 물질의 기능으로 다기능 neuropeptides 있습니다. 여기, 두 heterologous kinin에 곤충 kinins 구조 - 활동 관계를 체계적으로 분석하는 방법은 수용체 - 표현하는 것은 시스템에 설명되어 있습니다. 우리는 이뇨제, myotropic 및 / 또는 진드기와 모기의 소화 과정을 방해하는 잠재력을 지닌 biostable kinin analogs의 발전과 관련된 중요한 정보를 제공합니다. 남부 소 틱, Boophilus microplus (Canestrini), 그리고 모기 Aedes aegypti (리네 우스)에서 kinin 수용체는 안정 포유 동물 세포주 CHO - K1으로 표현했다. 이러한 수용체의 기능 분석은 이러한 재조합 세포 펩티드 신청시 세포질 칼슘 수준을 결정하는 세포 bioluminescence를 측정하는 칼슘 bioluminescence 플레이트 분석을 사용하여 완료되었습니다. 이 방법은 aequorin 단백질, 발광 해파리로부터 격리 photoprotein을 활용합니다. 우리는 transiently 안정 kinin 수용체를 표현 세포 라인에 플라스미드 aequorin (mtAEQ/pcDNA1)을 transfected. 이러한 전지는 다음 어느 세포 aequorin와 단지 cofactor의 coelenterazine와 치료를했다. 이 증서에는 칼슘 농도 나타내는 발광 레벨을 방출, 칼슘의 존재에 나옵니다. kinin 수용체는 세포 내 칼슘의 출시를 통해 신호로, 신호의 강도는 펩타이드의 힘 관련이 있습니다. 이 프로토콜은 수정 몇 가지 이전에 설명한 프로토콜의 합성이며.. 그것은 기능 플레이트 assays (Staubly 외, 2002 스테이블스 외, 1997을 통해 포유류의 세포 라인에 GPCRs의 안정 표현에 대한 단계별 지침을 제시 ). 이 방법론을 사용하여, 우리는 모기와 틱 kinin 수용체를 표현하는 안정적인 세포 라인을 설정할 수 있었다 세 모기 kinins의 힘을 비교, 리간드 - 수용체 상호 작용에 대한 중요한 아미노산 위치를 식별하고, 펩타이드의 세미 처리량 검사를 수행 도서관. 곤충 kinins는 내생 peptidases로 빠르게 효소 저하의 영향 때문에, 그들은 심각 해충 제어하거나 endocrinological 연구 도구로 사용에 제한됩니다. 따라서, 우리는 그들의 힘 및 biostability을 향상 아미노산 isobutyric의 산성 (Aib)이있는 kinin analogs을 테스트했습니다. 이 펩티다제 방지 아날로그 biostable 곤충 kinin의 analogs의 개발에 중요한 단서를 나타내고 neuropeptide 기반 arthropod 제어 전략의 개발에 도움이됩니다.

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A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

이 프로토콜은 clonal 세포 라인 선택과 자신의 동족 GPCRs에 합성 arthropod neuropeptides의 구조 - 활동 관계를 분석하기 위해 칼슘 bioluminescence 분석에 대한 지침을 제공합니다. 이 분석은 합성 아날로그 설계 및 펩타이드 / 약물 리드 발견 수용체 deorphanization 및 구조 - 활동 관계 연구에 사용될 수 있습니다.

모기의 기능 분석을 위해 칼슘 Bioluminescence 분석 ( Aedes aegypti)와 틱 ( Rhipicephalus microplus) G 단백질 결합 수용체

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

a-calcium-bioluminescence-assay-for-functional-analysis-mosquito

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

15.5K 조회수.  Texas A&M University (TAMU). 이 프로토콜은 clonal 세포 라인 선택과 자신의 동족 GPCRs에 합성 arthropod neuropeptides의 구조 - 활동 관계를 분석하기 위해 칼슘 bioluminescence 분석에 대한 지침을 제공합니다. 이 분석은 합성 아날로그 설계 및 펩타이드 / 약물 리드 발견 수용체 deorphanization 및 구조 - 활동 관계 연구에 사용될 수 있습니다.

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A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Mosquitoes are vectors for a number of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites and filarial worms. Laboratories are investigating anti-pathogen components of the innate immune system in disease vector species in the hopes of generating transgenic mosquitoes that are refractory to such pathogens1, 2. The innate immune system of mosquitoes consists of several lines of defense 3. Pathogens that manage to escape the barrier imposed by the epithelium-lined mosquito midgut 4 enter the hemolymph and encounter circulating hemocytes, important cellular components that encapsulate and engulf pathogens 5, 6. Researchers have not found evidence for hematopoietic tissues in mosquitoes and current evidence suggests that the number of hemocytes is fixed at adult emergence and numbers may actually decline as the mosquito ages 7. The ability to properly collect and identify hemocytes from medically important insects is an essential step for studies in cellular immunity. However, the small size of mosquitoes and the limited volume of hemolymph pose a challenge to collecting immune cells. 
Two established methods for collecting mosquito hemocytes include expulsion of hemolymph from a cut proboscis 8, and volume displacement (perfusion), in which saline is injected into the membranous necklike region between the head and thorax (i.e., cervix) and the perfused hemolymph is collected from a torn opening in a distal region of the abdomen 9, 10. These techniques, however, are limited by low recovery of hemocytes and possible contamination by fat body cells, respectively 11. More recently a method referred to as high injection/recovery improved recovery of immunocytes by use of anticoagulant buffers while reducing levels of contaminating scales and internal tissues 11. While that method allows for an improved method of collecting and maintaining hemocytes for primary culture, it entails a number of injection and collecting steps that are not necessary if the downstream goal is to collect, fix and stain hemocytes for diagnostics. Here, we demonstrate our method of collecting mosquito hemolymph that combines the simplicity of perfusion, using anticoagulant buffers in place of saline solution, with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes.

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A simplified yet accurate method to collect and stain mosquito hemocytes is described. Our method combines the simplicity of perfusion with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes. This method facilitates studies requiring knowledge of the types of hemocytes and their abundance.

옐로 피버 모스키토에서 Hemocytes를 수집 및 스테 이닝을위한 프로토콜 Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

연구

면역학 및 감염병학

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene function and phenotype(s). The development of mutant strains with targeted gene deletions, targeted mutations, complemented gene function, and/or tagged genes provides powerful strategies to address gene function, particularly if these genetic manipulations can be efficiently targeted to the gene locus of interest using integration mediated by double cross over homologous recombination.
Due to very high rates of nonhomologous recombination, functional genomic analysis of Toxoplasma gondii has been previously limited by the absence of efficient methods for targeting gene deletions and gene replacements to specific genetic loci. Recently, we abolished the major pathway of nonhomologous recombination in type I and type II strains of T. gondii by deleting the gene encoding the KU80 protein1,2. The &Delta;ku80 strains behave normally during tachyzoite (acute) and bradyzoite (chronic) stages in vitro and in vivo and exhibit essentially a 100% frequency of homologous recombination. The &Delta;ku80 strains make functional genomic studies feasible on the single gene as well as on the genome scale1-4.
Here, we report methods for using type I and type II &Delta;ku80&Delta;hxgprt strains to advance gene targeting approaches in T. gondii. We outline efficient methods for generating gene deletions, gene replacements, and tagged genes by targeted insertion or deletion of the hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HXGPRT) selectable marker. The described gene targeting protocol can be used in a variety of ways in &Delta;ku80 strains to advance functional analysis of the parasite genome and to develop single strains that carry multiple targeted genetic manipulations. The application of this genetic method and subsequent phenotypic assays will reveal fundamental and unique aspects of the biology of T. gondii and related significant human pathogens that cause malaria (Plasmodium sp.) and cryptosporidiosis (Cryptosporidium).

Genetic Manipulation in &lt;em&gt;&amp;Delta;ku80&lt;/em&gt; Strains for Functional Genomic Analysis of &lt;em&gt;Toxoplasma gondii&lt;/em&gt;

Here we report a method for using type I and type II &Delta;ku80 strains of Toxoplasma gondii to efficiently generate targeted gene deletions and gene replacements for functional genomic analysis.

유전 조작<em&gt; Δku80</em의 기능 게놈 분석을위한&gt; 균주<em&gt; 톡소 포자충</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Rearing Ixodes scapularis, the Black-legged Tick: Feeding Immature Stages on Mice

Ixodes scapularis, the vector of Lyme disease, is one of the most important disease vectors in the eastern and Midwestern United States. This species is a three host tick that requires a blood meal from a vertebrate host for each development stage, and the adult females require a blood meal for reproduction. Larval ticks attach to their host for 3 - 5 days for feeding and drop off the host when fully engorged. This dependency on several different hosts and the lengthy attachment time for engorgement complicates tick rearing in the laboratory setting. However, to understand tick biology and tick-pathogen interactions, the production of healthy, laboratory-reared ticks is essential. Here, we demonstrate a simple, cost-effective protocol for immature tick feeding on mice. We modified the existing protocols for decreased stress on mice and increased tick feeding success and survival by using disposable cages without mesh bottoms to avoid contact of ticks with water contaminated with mice urine and feces.

Rearing Ixodes scapularis, the Black-legged Tick: Feeding Immature Stages on Mice

The production of healthy laboratory-reared ticks is essential to studies on tick biology, and tick-pathogen interactions. Here we demonstrate a simple protocol for immature tick feeding that is cost-effective and less stressful to mice.

사육<em&gt; Ixodes의 scapularis,</em&gt; 블랙 다리 틱 : 마우스에 미성숙 단계를 먹이

Ixodes scapularis, the vector of Lyme disease, is one of the most important disease vectors in the eastern and Midwestern United States. This species is a ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a crucial step in this process and therapeutic strategies interfering with adhesion have been successfully established. The anti-&#945;4&#946;7 integrin antibody, vedolizumab, is used for the clinical treatment of Crohn&#39;s disease (CD) and ulcerative colitis (UC) and further compounds are likely to follow.
The details of the adhesion procedure and the action mechanisms of anti-integrin antibodies are still unclear in many regards due to the limited available techniques for the functional research in this field.
Here, we present a dynamic adhesion assay for the functional analysis of human cell adhesion under flow conditions and the impact of anti-integrin therapies in the context of IBD. It is based on the perfusion of primary human cells through addressin-coated ultrathin glass capillaries with real-time microscopic analysis. The assay offers a variety of opportunities for refinements and modifications and holds potentials for mechanistic discoveries and translational applications.

Dynamic adhesion of immune cells to the vessel wall is a prerequisite for gut homing. Here, we present a protocol for a functional in vitro assay for the impact analysis of anti-integrin antibodies, chemokines or other factors on the dynamic cell adhesion of human cells using addressin-coated capillaries.

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with cytoplasmic tails of the receptors. The interactions often occur through specific protein domains and result in activation of the enzymes. There are several methods to study interactions between proteins. While co-immunoprecipitation is commonly used to study domains that are required for protein-protein interactions, there are no assays that document the contribution of specific domains to activity of the recruited enzymes at the same time. Accordingly, the method described here combines co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay for simultaneous evaluation of interactions between proteins and associated enzymatic activation. The goal of this protocol is to identify the domains that are critical for physical interactions between a protein and enzyme and the domains that are obligatory for complete activation of the enzyme. The importance of this assay is demonstrated, as certain receptor protein domains contribute to the binding of the enzyme to the cytoplasmic tail of the receptor, while other domains are necessary to regulate the function of the same enzyme.

Here, we present a protocol for co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay to simultaneously study the contribution of specific protein domains of plasma membrane receptors to both enzyme recruitment and enzyme activity.

수용 체와 효소 간의 기능 상호 작용을 공부에 대 한 분석 결과 Co-immunoprecipitation

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites and Rhipicephalus microplus has great importance in veterinary medicine because it causes anemia, weight loss, depreciation of the animals&#39; leather and also can act as a vector of several pathogens. Due to the exorbitant costs to control these parasites, damage to the environment caused by the inappropriate use of chemical acaricides, and the increased resistance against traditional parasiticides, alternative control of ticks, by the use of entomopathogenic fungi, for example, has been considered an interesting approach. Nevertheless, few studies have demonstrated how the tick&#39;s immune system acts to fight these entomopathogens. Therefore, this protocol demonstrates two methods used for entomopathogen inoculation into engorged females and two techniques used for hemolymph collection and hemocytes harvesting. Inoculation of pathogens at the leg insertion in the tick female&#39;s body allows evaluation of females biologic parameters unlike the inoculation between the scutum and capitulum, which frequently damages Gen&#233;&#39;s organ. Dorsal hemolymph collection yielded a higher volume recovery than collection through the legs. Some limitations of tick hemolymph collection and processing include i) high rates of hemocytes&#39; disruption, ii) hemolymph contamination with disrupted midgut, and iii) low hemolymph volume recovery. When hemolymph is collected through the leg cutting, the hemolymph takes time to accumulate at the leg opening, favoring the clotting process. In addition, fewer hemocytes are obtained in the collection through the leg compared to the dorsal collection, even though the first method is considered easier to be performed. Understanding the immune response in ticks mediated by entomopathogenic agents helps to unveil their pathogenesis and develop new targets for tick control. The inoculation processes described here require very low technological resources and can be used not only to expose ticks to pathogenic microorganisms. Similarly, the collection of tick hemolymph may represent the first step for many physiological studies.

Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

Analysis of tick hemolymph represents an important source of information on how some pathogens cause disease and how ticks immunologically respond to this infection. The present study demonstrates how to inoculate fungal propagules and collect hemolymph from Rhipicephalus microplus engorged females.

무척 추 병리학 연구를 향한 Rhipicephalus 마이크로 플러스 진드기에 Metarhizium 발 파 포자의 혈 림프 수집 및 접종을 공개

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites and Rhipicephalus microplus has great importance in veterinary medicine because it causes anemia, weight ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine the rate of infection, disseminated infection, and potential transmission of the virus in the mosquito population in question. These procedures are widely utilized with various modifications in vector competence evaluations globally. They are important in determining the potential role that a given mosquito (i.e., species, population, individual) may play in the transmission of a given agent.

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The presented protocol can determine the vector competence of Aedes aegypti mosquito populations for a given virus, such as Zika, in a containment setting.

지카 바이러스를 사용하여 Aedes aegypti 모기에 벡터 역량 분석

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of disease cases each year. E. aedis causes mortality and reduced reproductive fitness in the mosquito vector and has been explored for its potential as a biocontrol agent. The protocol we present for culturing E. aedis is based on its natural infection cycle, which involves both horizontal and vertical transmission at different life stages of the mosquito host. Ae. aegypti mosquitoes are exposed to spores in the larval stage. These infected larvae then mature into adults and transmit the parasite vertically to their offspring. Infected offspring are then used as a source of spores for future horizontal transmission. Culturing E. aedis can be challenging to the uninitiated given the complexities of the parasite&#8217;s life cycle, and this protocol provides detailed guidance and visual aids for clarification.

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

A protocol to culture the microsporidian parasite Edhazardia aedis. The parasite is passaged from one generation of Aedes aegypti mosquitoes to the next via horizontal transfer at the larval stage followed by vertical transmission at the adult stage. Live sporoplasms survive long-term in infected eggs.

Aedes aegypti 모기에서 현미경 포리디안 기생충 에드hazardia aedis의 전파

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of ...

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

Females of certain mosquito species can spread diseases while biting vertebrate hosts to obtain protein-rich blood meals required for egg development. In the laboratory, researchers can deliver animal-derived and artificial blood meals to mosquitoes via membrane feeders, which allow for manipulation of meal composition. Here, we present methods for feeding blood and artificial blood meals to Aedes aegypti mosquitoes and quantifying the volume consumed by individual females.
Targeted feeding and quantification of artificial/blood meals have broad uses, including testing the effects of meal components on mosquito behavior and physiology, delivering pharmacological compounds without injection, and infecting mosquitoes with specific pathogens. Adding fluorescein dye to the meal prior to feeding allows for subsequent meal size quantification. The meal volume consumed by mosquitoes can be measured either by weight, if the females are to be used later for behavioral experiments, or by homogenizing individual females in 96-well plates and measuring fluorescence levels using a plate reader as an endpoint assay. Meal size quantification can be used to determine whether changing the meal components alters the meal volume ingested or if meal consumption differs between mosquito strains. Precise meal size quantification is also critical for downstream assays, such as those measuring effects on host attraction or fecundity. The methods presented here can be further adapted to track meal digestion over the course of days or to include multiple distinguishable markers added to different meals (like nectar and blood) to quantify the consumption of each meal by a single mosquito.
These methods allow researchers to singlehandedly perform high-throughput measurements to compare the meal volume consumed by hundreds of individual mosquitoes. These tools will therefore be broadly useful to the community of mosquito researchers for answering diverse biological questions.

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

The goal of this protocol is to deliver animal-derived and artificial blood meals to Aedes aegypti mosquitoes through an artificial membrane feeder and precisely quantify the volume of meal ingested.

Aedes aegypti 모기에서 동물 유래 혈액 및 인공 식사 먹이주기 및 정량화

Females of certain mosquito species can spread diseases while biting vertebrate hosts to obtain protein-rich blood meals required for egg development. In ...

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

Malaria remains one of the most devastating diseases worldwide and, to date, the African region is still responsible for 94% of all cases worldwide. This parasitic disease requires a protozoan parasite, an Anopheles mosquito vector, and a vertebrate host. The Anopheles genus comprises more than 500 species, of which 60 are known as vectors of the parasite. The Plasmodium parasite genus consists of 250 species, and 48 of these are involved in disease transmission. Furthermore, the Plasmodium falciparum parasite has contributed toward an estimated 99.7% of malaria cases in sub-Saharan Africa in recent years. 
Gametocytes form part of the sexual stage of the parasite and are ingested by the female mosquito upon feeding on an infected human host. Further development of the parasite within the mosquito is enhanced by favorable environmental conditions in the midgut of the mosquito. Here, the fusion of the female and male gametes takes place, and the motile ookinetes originate. The ookinetes enter the midgut epithelium of the mosquito, and mature ookinetes form oocysts, which, in turn, produce motile sporozoites. These sporozoites migrate to the mosquito's salivary glands and are injected as a mosquito takes a blood meal. 
For drug discovery purposes, mosquitoes were artificially infected with gametocyte-infected blood in the standard membrane feeding assay (SMFA). To detect infection within the mosquito and/or to assess the efficacy of antimalarial compounds, the midguts of the female mosquitoes were removed post infection and were stained with mercurochrome. This method was used to enhance the visual detection of oocysts under the microscope for the accurate determination of oocyst prevalence and intensity.

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

The standard membrane feeding assay (SMFA) is regarded as the gold standard for the assessment and identification of potential antimalarial compounds. This artificial feeding system is used to infect mosquitoes to further evaluate the effects of such compounds on the intensity and prevalence of the Plasmodium falciparum parasite.

Anopheles 모기 벡터에서 플라스모듐 팔시파룸 감염 검출을 위한 표준 막 공급 분석

Malaria remains one of the most devastating diseases worldwide and, to date, the African region is still responsible for 94% of all cases worldwide. This ...