새로운 증거는 신경 병 증 통증 개발 및 신경 손상의 맥락에서 축 하 수리에 등산 루트 신경 절기 대식절의 기여를 연루 했다. 등대 뿌리 신경절 대식세포의 반응을 빠르게 페노티핑하여 알 수 없는 신경면역 인자를 식별하는 것이 좋습니다. 여기서 우리는 우리의 실험실이 효소가 없는 기계 해리 프로토콜을 사용하여 등쪽 뿌리 간질에서 대식대를 신속하고 효과적으로 분리하는 방법을 보여줍니다.
이 프로토콜은 표준 효소 프로토콜에 비해 시간이 훨씬 적게 소요되며 형광 활성화 셀 정렬 분석에 일상적으로 사용했습니다. 실험을 시작하기 전에 9권의 매질을 칼슘과 마그네슘 이없는 10X HBSS와 혼합하여 밀도 그라데이션 매체의 작동 솔루션을 준비하고 얼음 위에 보관하십시오. 뒷발 핀치에 대한 응답이 부족하여 마우스가 완전히 마취되어 있는지 확인합니다.
먼저 마취된 마우스를 테이프로 고정한 4개의 발을 스핀 위치에 화학 연기 후드 에 넣는 것으로 시작합니다. 집게를 사용하여 흉곽 아래 피부를 들어 올립니다. 그리고 외과 가위를 사용하면 간과 횡격막을 노출하기 위해 작은 절개를합니다.
동일한 가위를 사용하여 다이어프램과 흉곽을 잘라냅니다. 그리고 흉막 구멍을 열어 박동 심장을 노출시합니다. 홍채 가위를 가진 다음, 신속하게 오른쪽 심방 부속기를 잘라.
출혈이 지적되면, 왼쪽 심실의 후방 끝에 30 게이지 바늘을 삽입하고 천천히 동물을 perfuse하기 위해 미리 냉각 된 1X PBS의 10 밀리리터를 주입합니다. 등갈 라미케절제술을 수행하려면 마우스를 경향이 있는 위치에 놓습니다. 크기 11 메스를 사용하여 흉부 부위에서 부터 성수 부위까지 두 개의 세로 측면 깊은 절개를 만듭니다.
그런 다음 등대 근육 층을 노출하는 피부를 제거합니다. 그런 다음 프리드먼-피어슨 rongeur와 함께, 요추성 척추 프로세스와 양측 횡단 과정이 노출 될 때까지 결합 조직과 근육을 벗겨. 먼저 프리드먼-피어슨 롱거를 사용하여 등삼 척수를 조심스럽게 열고 프리드먼-피어슨 롱거와 Noyes 스프링 가위 사이를 전환하여 척추 뼈를 제거하고 척수에 손상되지 않은 척수를 노출시십시오.
신중하게 ipsilateral 및 모순 된 요추 DRG를 해부. Dounce 조직 균질화기에 얼음 차가운 칼슘과 마그네슘이 없는 1X HBSS1 밀리리터에 넣습니다. 20~25회 느슨한 페일과 함께 두스균균제에서 DRG 조직을 균질화한다.
멸균 50 밀리리터 원원형 튜브에 멸균 70 마이크로미터 나일론 세포 스트레이너를 놓습니다. 800 마이크로리터의 얼음 코드 1X HBSS를 사용하여 세포 여과기를 적시세요. 파이펫을 사용하여 균질화기로부터 균질화 된 조직 현탁액을 습식 세포 여과기에 수집하고 50 밀리리터 원내 튜브로 수집합니다.
800 마이크로리터의 얼음 차가운 1X HBSS로 균질화제를 두 번 헹구고, 액체를 동일한 50 밀리리터 원추형 튜브로 수집하여 수율을 증가시게 합니다. 1.5 밀리리터의 평형 얼음 차가운 동위원 밀도 그라데이션 배지를 멸균 5 밀리리터 폴리스티렌 플라스크 튜브에 넣습니다. 50 밀리리터 원추형 튜브에서 이 플라스크 튜브로 세포 균모를 전달합니다.
그리고 파이펫을 위아래로 잘 섞어. 상단을 밀봉하기 위해 1X HBSS의 500 마이크로리터를 추가합니다. 섭씨 4도에서 20분 동안 800배 G의 세포를 원심분리합니다.
조심스럽게 튜브의 바닥에 세포 펠릿을 방해하지 않고 매체에 myelin을 포함하는 슈퍼 네티얼을 흡인. 펠릿에 5%의 태아 소 혈청을 함유한 PBS 100 마이크로리터를 추가하고 DRG 세포를 다시 중단합니다. 그런 다음 알파 마우스 CX3CR1 APC 항체를 세포에 추가하고 1 시간 동안 섭씨 4도에서 어둠 속에서 배양합니다.
PBS의 5 밀리리터로 한 번 세포를 씻으시다. 섭씨 4도에서 8분간 360배 G의 세포를 원심분리합니다. 수퍼내티드를 흡인한 다음, 사실 분석을 위해 PBS의 300 마이크로리터에서 세포 펠릿을 다시 중단한다.
대식세포를 고갈시키기 위해 MaFIA 마우스로 FK 결합 단백질 이메르자 AP의 복막 주사 후, 대조된 차량 처리 마우스에 비해 AP 처리 마우스의 DRGs에서 GFP 양성 세포의 상당한 손실이 있었다. 사실 분석은 AP 처리된 마우스에 있는 GFP 높은 인구의 성공적인 고갈을 드러내고 고립된 세포의 고품질을 보여주었습니다. 총 분리된 세포의 4%는 GFP 높은 대식세포였다.
대조적으로 전체 DRG 세포의 0.4%만이 AP 처리 마우스에서 GFP 높은 대식세포였다. 야생형 마우스로부터 기계적으로 분리된 DRG 세포는 알파 마우스 CX3CR1-APC 항체로 염색하였다. DRG 세포의 6%는 CX3CR1 양성 대식세포였다.
세포 생존능력이 공화요오드로 평가되었을 때, 갓 분리된 DRG 세포의 80% 이상이 실행 가능하다는 것이 밝혀졌습니다. 만족스럽지 못한 세포 수율이 지적되면 DRG 조직의 불충분하거나 과도한 균질화가 의심될 수 있습니다. 또한, DRG 해부는 초보자를 위한 반복적인 사례가 필요할 수 있습니다.
가능성이 우리의 프로토콜의 응용 프로그램은 위성 세포 및 T 세포와 같은 다른 비 신경 세포를 연구하기 위해 확장 될 수있다. 추가 연구는 세포 격리의 효과 확인 하는 데 필요할 수 있습니다.
