이 프로토콜을 사용하면 골수 및 비장과 같이 새로 수확한 마우스 조직에서 직접 BFU-E 및 CFU-E 적혈구 전구세포를 식별하고 분리할 수 있습니다. 이 기술을 사용하여 이전 흐름 프로토콜에서는 불가능했던 적혈구 전구 세포의 순수한 개체군을 분리 할 수 있습니다. 이 방법은 많은 다운스트림 실험에서 전구 분리를 허용함으로써 적혈구 질환 마우스 모델을 연구하는 능력을 크게 향상시킵니다.
시작하려면 새로 해부 된 대퇴골과 경골을 차가운 염색 완충액 또는 SB-5에 직접 넣고 골수를 추출 할 준비가 될 때까지 튜브를 얼음 위에 두십시오. 양동이의 얼음 위에 깨끗한 멸균 모르타르를 놓고 뼈를 박격포로 옮깁니다. 해부 가위를 사용하여 각 뼈의 약 1mm 끝을 잘라냅니다.
SB-5가 들어있는 26 게이지 바늘이 장착 된 3 밀리리터 주사기를 사용하여 골수를 뼈에서 씻어 내고 절구에 모으고 뼈가 무색으로 보일 때까지 매번 신선한 완충액을 사용하여 3-5 회 반복합니다. 플러시 된 골수를 100 마이크로 미터 메쉬를 통해 여과하고 얼음 위에 놓인 50 밀리리터 원심 분리 튜브에 세포를 수집합니다. 다음으로, 박격포와 유봉을 사용하여 5-10 밀리리터의 SB-5로 플러시 된 뼈를 분쇄하십시오.
분쇄된 뼈의 혼합물을 여과하고 100마이크로미터 세포 여과기를 통해 완충액을 여과하여 이전에 수집된 세포와 풀링합니다. 얼음 위에 놓인 빈 50 밀리리터 원심 분리기 튜브에 100 마이크로 미터 메쉬 필터를 설치하십시오. 메쉬 필터에 단일 비장을 놓고 0.5-1 밀리리터의 SB-5를 비장에 추가하여 건조되지 않도록합니다.
3 또는 5 밀리리터 주사기 플런저의 고무면을 사용하여 비장을 메쉬를 통해 으깨십시오. 한 번에 5 밀리리터의 SB-5를 더 추가하고 모든 세포가 튜브에 수집 될 때까지 계속 으깨십시오. 큰 오리피스 팁을 사용하여 2 밀리리터의 SB-5로 수집된 세포를 위아래로 피펫팅하여 단일 세포 현탁액을 준비합니다.
FMO의 이름을 딴 항체를 제외한 모든 항체를 FACS 튜브의 세포 현탁액에 첨가하여 형광 마이너스 1 또는 FMO 대조군을 염색합니다. 단색 대조군을 염색하려면 FACS 튜브의 세포 현탁액에 단일 항체를 추가합니다. 각 컨트롤 튜브를 3000RPM에서 2-3초 동안 소용돌이시킨 다음 섭씨 4도에서 어둠 속에서 2.5시간 동안 흔들면서 배양합니다.
배양 후 세포를 SB-5로 세척하고 SB-5로 세포 현탁액의 부피를 4 밀리리터로 구성합니다. 세포를 섭씨 4도에서 10분 동안 900g으로 회전시키고 상청액을 흡인합니다. 염색되지 않은 모든 단색 컨트롤을 300마이크로리터의 SB-5에 다시 현탁하고 40마이크로미터 필터 메쉬를 통해 새 FACS 튜브로 필터링합니다.
SB-5에서 DAPI 스톡을 1에서 10, 000의 비율로 희석하여 DAPI SB-5 솔루션을 만듭니다. 1.8 밀리리터의 DAPI SB-5 및 300 마이크로 리터의 DAPI SB-5에 DAPI 단색 제어에 FMOS를 다시 현탁 한 다음 40 마이크로 미터 필터 메쉬를 통해 새 FACS 튜브로 필터링합니다. 항체 마스터 믹스를 각 샘플에 첨가한 후, 튜브를 3000rpm에서 2 내지 3초 동안 와동시킨 다음, 흔들림 조건에서 2.5시간 동안 암실에서 섭씨 4도에서 배양한다.
이전에 입증된 대로 세포를 세척한 후 샘플을 1.8밀리리터의 DAPI SB-5에 다시 현탁시키고 40마이크로미터 필터 메쉬를 통해 새 FACS 튜브로 여과하고 방광계를 사용하여 샘플을 분석합니다. 전방 산란을 사용하여 크기에 따라 파편을 제거한 다음 전방 산란 높이 대 전방 산란 영역 히스토그램을 사용하여 세포 응집체를 제외하고 단일 셀을 선택합니다. 측면 산란 높이 대 측면 산란 영역 히스토그램으로 제외를 반복합니다.
DAPI에 대한 양성 세포를 게이팅하여 죽은 세포를 제외합니다. 계통 음성 TUR 19 음성 키트 양성 세포를 선택합니다. 그리고 이들로부터 CD 55를 표현하는 하위 집단을 선택하십시오.
계통을 음성 TUR 19개, 음성 키트, 양성, CD55 양성 세포를 2개의 주요 집단, P6 및 P7개의 CD49F 및 CD1 0 5의 발현에 기초하여 세분한다. 이제 CD(150) 및 CD(41)의 발현에 기초하여, P6을 P3, P4 및 P5로 더 세분화한다. 유사하게, CD(150) 및 CD(71)의 발현에 기초하여, P7을 BFUE, 초기 CFUE 및 후기 CFUE로 더 세분화한다.
본 연구에서, 파열 및 콜로니 형성 단위는 새로 수확 된 골수 및 비장 세포로부터 확인되었다. 마우스에서 72시간의 에리트로포이에틴 또는 비히클 주사 후, 에리트로포이에틴 자극은 수확된 골수 및 비장 세포에서 초기 및 후기 콜로니 형성 단위 집단 P1 낮음 및 P1 높음의 확장을 보였다. 생체내에서 에리트로포이에틴에 대한 골수 및 비장 전구세포의 반응은 또한 비히클 대조군에 비해 초기 및 후기 콜로니 형성 단위 집단에서 더 높은 수의 세포 P1 및 높은 P1을 보였다.
세포를 항체로 표지하기 전에 단일 세포 현탁액을 생성하는 것이 가장 중요합니다. 이는 위아래로 반복적으로 피펫팅하고 버퍼에 EDTA를 포함시켜 달성할 수 있습니다. 정제된 전구체는 모든 다운스트림 세포 및 분자 분석에 사용할 수 있습니다.
예를 들어, 단일 세포 전사체학, atesque, 콜로니 분석 및 생화학. 이 기술은 단일 세포 RNA-seq 실험의 예측을 테스트하는 데 도움이되었습니다.
