이 작품은 DMH와 TDM (NHMRC 프로젝트 보​​조금)에 부여로 투자했다. DMH는 미건야 트러스트에 의해 자금을 그림 웨이드 연구원입니다.

1. ReAsH / 플래시 라벨에 대한 세포의 준비 <ol><li> 관심의 세포 라인에 대한 표준 세포 배양 방법을 사용하여 직접 transfection 준비 라이브 셀 이미징 슬라이드에 자기편 세포의 문화를 준비합니다. </li><li> 선택의 transfection 방법에 따라 관심의 플라스미드가 포함된 TC - 태그 유전자를 Transfect. </li></ol> TC 태그에 특정 바인딩의 범위를 평가하고 공촛점 micrographs를 수집하면 채널 사이에 형광 bleedthrough에 대한 평가에 긍정적이고 부정적인 컨트롤을 사용하는 것이 중요합니다. 따라서, 두 색상 (예 : 플래시 / 체리 또는 ReAsH / CFP 또는 ReAsH / GFP 조합)에 대한 샘플은 단일 색상 (예 : 형광 단백질 혼자 또는 가능한 경우없이 형광등 플래시 / ReAsH 이에 바운드 TC - 태그 단백질에 대한 준비가되어 확인 단백질) <ol start="3"><li> 하나하는 데 이틀이 transfection 후 부드럽게 HBSS (37 ° C에서) 300 μL 사전 예열로 세포를 씻어. </li><li> 부드럽게 prewarmed HBSS와 10 μm의 1,2 - ethanedithiol (동부 서머 타임) 300 μL 1 μm의 플래시 (또는 ReAsH)로 세포를 잠그다. </li></ol> 세포에 추가하기 위해 플래시 / ReAsH를 추가하기 전에 동부 서머 타임을 추가하고 방금 전에 버퍼를 만드는 것이 중요합니다. 37 ° 조직에서 C 문화 인큐베이터에서 정확히 30 분 알을 품다. 우리의 경험을 더 이상 배양 시간이 크게 배경 형광을 증가시킵니다. 새로운 구조는 또한 시간 및 Flash / ReAsH 농도 (0.5-2 μm의) 라벨에 최적화된해야합니다. <ol start="5"><li> 부드럽게 300 μL prewarmed HBSS + 250 μm의 37 15 분에 대한 2,​​3 - dimercaptopropanol (BAL) ° C.로 교체 후 세포에서 솔루션을 라벨링 기음과 </li><li> 부드러운 열망으로 솔루션을 씻고 300 μL prewarmed HBSS로 교체 제거합니다. </li></ol> 우리가이가 아닌 특정 biarsenical 염료의 형광을 증가시킬 수있다는 것을 발견했지만이 세척 후, 세포는 paraformaldehyde (3.2 %의 솔루션으로 15 분)에 고정 수 있습니다. 따라서 우리는 일반적으로 이미지 세포는 실온에서 살고있다. (라벨이 biarsenical 염료 바인딩을 방지하기 전에 세포의 고정을합니다.) 2. 공촛점 현미경의 영상은 세포 <ol><li> 공촛점 현미경에서 이미징 개별 fluorophores (표 1 참조)에 대한 매개 변수를 설정하고 채널 간의 무시할 bleedthrough이있다는 것을 확인하십시오. 이것은 형광 각각 다른 형광 수집 설정에 대한 개별 fluorophores을 (제어 샘플)를 선택하여 얻을 수 있습니다. 방출 파장 범위를 조정하면 (이것은 또한 신호 / 잡음을 줄일 수 있지만) bleedthrough을 최소화하는 데 도움이 될 수 있습니다. </li><li> 또한 예제에서 최대 형광이 탐지기를 포화하지 않도록 photomultiplier 설정을 조정합니다. (이것은 SP2 Leica 공촛점에있는 Q - LUT 설정을 사용하여 감지 수 있습니다.) 일단 최고의 영상 설정이 결정되며, 샘플 간의 그들 중 하나를 변경하지 마십시오. </li><li> 우리가 일반적으로 사용하는 다른 설정 (이가 최적화할 수 있지만) 200 Hz의 스캔 속도이며, 4 린 평균 1 에어리 단위의 핀홀 직경를 수집합니다. 핀홀 직경은 신호 / 노이즈가 문제가있다면하지만,이 영상의 일부 손실을 초래할 수 확장 될 수 있습니다. </li><li> 가능하면 12 비트 (또는 이상) 형식으로 공촛점 이미지를 수집합니다. 12 비트 포맷은 8 비트 (0-255)보다 각 픽셀 강도에 대한 값 (0-4095)의 큰 다이나믹 레인지를 캡처합니다. 이것은 가장 부유한 데이터 세트가 정량 데이터 분석의 품질을 극대화하는, 기록 확보하는 것이 중요합니다. </li><li> 형광 단백질 채널 (체리, GFP 또는 CFP)와 또한 모든 샘플에 대한 biarsenical 염료 채널 (플래시 또는 ReAsH)에 대한 이미지를 수집합니다. </li></ol> 3. 데이터의 분석 <ol><li> 컴퓨터 8 소프트웨어 ImageJ를 설치합니다. <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> </li><li> ImageJ의 버전은 다음과 같은 플러그인이 있는지 확인합니다 : <ul><li> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/file-opener.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/file-opener.html</a> </li><li> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/image_correlator.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/image_correlator.html</a> </li><li> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lut-editor.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lut-editor.html</a> </li></ul></li><li> 오픈 ImageJ 및 v1.32c보다 오래된 버전을 사용하는 경우, 여러 개의 이미지를 한 번 (당신이 다른 파일을 클릭하면서 어떤이 컨트롤 버튼을 누른하여 수행할 수 있습니다)에서 열 수 있도록 다음과 같은 옵션을 클릭합니다 : <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step1.jpg" alt="그림 1" /></li><li> ImageJ에 대한 관심의 이미지를 엽니다. ImageJ는 자동으로 별도로 각각의 이미지를 화면에 표시되는 최대 및 최소 픽셀 농도를 정의합니다. 서로 다른 이미지가 D가됩니다 감안할 때ifferent 픽셀 농도,이 조회로 표시된 이미지가 비교되지 않습니다 것을 의미합니다. </li><li> 열린 이미지가 같은 규모의 모든 있도록하기 위해서는 물리적으로 상부를 정의할 수 있으며, 낮은 픽셀 농도는 (이것은 다른 소프트웨어의 경우 것입니다 같은 이미지의 실제 데이터 내용을 변경하지 않습니다) 볼 수 있습니다. 이러한 값은 다음과 같은 메뉴에서 설정할 수 있습니다 : <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step2.jpg" alt="그림 2" /></li><li> 다른 접근 방식은 같은 규모로 스택에 (볼) 모든 이미지를 하나의 파일에 모두 함께 이미지를두고 자동으로 규모 것입니다 스택에서 작동하는 것입니다. 데이터 작업하는 가장 쉬운 방법은 스택 각 채널을 변환하는 것입니다. 따라서, 형광 단백질 채널과 같이 스택에 대한 모든 변환합니다. 당신은 쉽게 제목에 일반적인 이름 (예 : &quot;ch00&quot;)가 포함된 모든 이미지를 쌓아하여 하나의 채널을 선택할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step3.jpg" alt="그림 3" /></li><li> 이제 분석을 위해 8 비트로 열려있는 모든 이미지를 변환합니다. 이것은 실제로 0-255 범위 (8 비트를 정의하는)에 조회 범위를 rescale 것입니다. 중요 : 원래 12 비트 (또는 이상) 형식을 통해 저장하거나 정보 콘텐츠를 잃게됩니다하지 마십시오. 이 형식은 그림 등을 만드는 데 유용합니다 때문에 일부 소프트웨어 패키지는 8 비트 이미지를 표시할 수 있습니다 <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step4.jpg" alt="그림 4" /></li><li> 옵션 &quot;으로 ... 저장&quot;을 사용하여 &quot;8 비트 변환&quot;라는 새 폴더에 복사본을 저장합니다. </li><li> 전체 이미지 biarsenical 염색 바인딩의 범위를 조사하는 한 가지 방법은 픽셀 강도 상관 계획을 수행하는 것입니다. 두 번째 채널에 해당 픽셀의 가치에 상대적으로 하나의 채널이 플롯은 모든 픽셀 값. 고친이있다면 따라서 CFP 형광 높은 픽셀 위치도 ReAsH의 형광 높은 것입니다. </li><li> 공동 상관 픽셀을 분석하기 위해 8 비트 ReAsH 및 세룰리안 / GFP 이미지 ImageJ에서 열려 있는지 확인하십시오. </li><li> 아래 표시된대로 &#39;이미지 상관기 &quot;플러그인을 엽니다. ReAsH 또는 Flash 스택과 형광 단백질 스택으로 &quot;Image2&quot;로 &quot;Image1&quot;를 선택하십시오. <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step5.jpg" alt="그림 5" /></li><li> 그 결과 스택은 모든 자세한 정보를 표시하지 않을 수 있습니다 -이 정상입니다. &quot;Scatterplots&quot;라는 새 폴더에 스택을 저장하고 그것을 그것이 참조하는 샘플과 동일한 파일 이름을 지정 (예 : &quot;플래시 - 체리 상관 줄거리&quot;) </li><li> 데이터를 보려면 의미 당신은 두 가지 옵션 중 하나를 할 수 있습니다. 이 로그 형식으로되어 있도록 먼저 데이터를 변환. 그렇다면 시각적으로 다음과 같이 데이터를 rescale : <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step6.jpg" alt="그림 6" /></li><li> 또는, 당신은 단지 낮은 값을 표시 (예 : 1-255)과 특수 LUT를 사용하여 데이터를 표시하는 시각 데이터를 rescale 수 있습니다. LUT가 (테이블을 보라) 이미지에서 각 픽셀 값에 할당된 색상의 테이블을 나타냅니다 . 이것은 이미지에 대한 pseudocolor 스키마를 정의하는 데 사용하고 이미지의 특정 기능을 정의하는 데 유용합니다 수 있습니다. &quot;LUT 편집기&quot;에 대한 사용자 정의 LUT 클릭을 만들고 같은 (이것은 저장하고 나중에 사용할 수 있습니다) 그림과 같이 새로 만들 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step7.jpg" alt="그림 7" /></li><li> 0-255에서 밝기 / 대비 범위 (위의 단계 13에서 설명한) 설정합니다. 화면에 표시된 것과 같은 이미지 &quot;에서 잠금&quot;이미지가 각 픽셀의 빨강, 녹색 및 파랑 색상의 각 8 비트 값을 저장 RGB 형식으로 변환할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step8.jpg" alt="그림 8" /> 다른 프로그램에 이미지를 복사하여 붙여 넣으려면 먼저 8 비트 또는 16 비트 이미지를 엽니다. 위의 14 단계에서 설명한 이미지 LUT 색 구성표를 지정합니다. CFP 들어, 아래에 설명된 &quot;청록색&quot;LUT를 지정 ... <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step9.jpg" alt="그림 9" /></li><li> 이미지를 선택하고 클립 보드에 복사를 선택 ... <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step10.jpg" /></li></ol> 4. 대표 결과 : biarsenical 염료와 라벨링 세포의 성공은 몇 가지 주요 매개 변수에 따라 달라집니다. 먼저 염료와 라벨의 타이밍이 중요합니다. 우리가 찾은 그 상표의 연장 기간 (이상 30 분) 이외의 구체적인 배경 얼룩 높은 수준의 결과. 그림 1은 이전 7 설명한 것처럼 TC 태그를 포함하는 CFP 파생 세룰리안에 융합 huntingtin 조각의 야생 식 양식 (25Q)에 대한 전형적인 결과를 보여줍니다. 이 샘플은 ReAsH 30 분 스테인드 및 TC 태그를 부족 샘플에서 최소한의 배경이있다했습니다. 우리는 paraformaldehyde 증가의 배경으로 세포를 고정하는 것은 메탄올로 고정하면 형광 단백질 태그의 형광을 abrogates 동안 나타났습니다. 따라서 세포가 가능한 우리가 이미지를 살고 있습니다. 또한 그 전에 고정에 유의하는 것이 중요하다biarsenical 염료와 라벨을하면 TC 모티브로의 변경으로 인해 아마도 그들의 바인딩을 방지합니다. 일관성있는 결과를 또 다른 중요한 요인은 세포의 밀도입니다. 우리는 느슨하게 배포되고 또한 광범위한 clumping 다른 세포에 biarsenical 염료의 고르지 얼룩으로 이어질 수있는 이미지 세포에 중요한 발견했다. <img src="/files/ftp_upload/2857/2857fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. Tetracysteine ​​태그와 huntingtin (exon1 - 25Q) 세룰리안 fusions와 함께 살고 transfected 세포 ReAsH 염색법. TC 태그는 huntingtin - 세룰리안 융합합니다 (7 설명)의 교차점에 위치하고 있습니다. 픽셀 강도 상관 줄거리는 세포를 통해 바인딩 ReAsH의 차이에 대한 평가를 가능하게하고 conformational 변경 또는 리간드 상호 작용에 의한 구속력 ReAsH의 변화를지도하는 데 사용할 수 있습니다.

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	<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Ann. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+covalent+labeling+of+recombinant+protein+molecules+inside+live+cells.">Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells.</a> Science. 281, 269-2672 (1998).</li><li>Uttamapinant, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorophore+ligase+for+site-specific+protein+labeling+inside+living+cells.">A fluorophore ligase for site-specific protein labeling inside living cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 10914-10919 (2010).</li><li>Ignatova, Z., Gierasch, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+protein+stability+and+aggregation+in+vivo+by+real-time+fluorescent+labeling.">Monitoring protein stability and aggregation in vivo by real-time fluorescent labeling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 523-528 (2004).</li><li>Coleman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+detection+of+prion+protein+with+biarsenical+labeling+and+FlAsH+fluorescence.">Conformational detection of prion protein with biarsenical labeling and FlAsH fluorescence.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 380, 564-568 (2009).</li><li>Luedtke, N. W., Dexter, R. J., Fried, D. B., Schepartz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveying+polypeptide+and+protein+domain+conformation+and+association+with+FlASH+and+ReAsH.">Surveying polypeptide and protein domain conformation and association with FlASH and ReAsH.</a> Nat. Chem. Biol. 3, 779-784 (2007).</li><li>Ramdzan, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation+sensors+that+distinguish+monomeric+proteins+from+oligomers+in+live+cells.">Conformation sensors that distinguish monomeric proteins from oligomers in live cells.</a> Chem. Biol. 17, 371-379 (2010).</li><li>Abramoff, M. a. g. e. l. h. a. e. s., PJ, S. J. R. a. m. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+processing+with+ImageJ.">Image processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li><li>Hearps, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biarsenical+dye+Lumio+exhibits+a+reduced+ability+to+specifically+detect+tetracysteine-containing+proteins+within+live+cells.">The biarsenical dye Lumio exhibits a reduced ability to specifically detect tetracysteine-containing proteins within live cells.</a> J. Fluor. 17, 593-597 (2007).</li><li>Adams, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+biarsenical+ligands+and+tetracysteine+motifs+for+protein+labeling+in+vitro+and+in+vivo:+Synthesis+and+biological+applications.">New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications.</a> J. Am. Chem. Soc. 124, 6063-6076 (2002).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Meth. 2, 905-909 (2005).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

두 번째 염료와 형광 단백질과 conformational 속성 레이블 단백질 지방화에 대한 접근 방법은 단백질의 다양한 conformations가 세포와 단백질 형태의 역학을 변경 이벤트에 발생한 위치를 매핑에 대한 많은 가능성을 제공합니다. ReAsH / 플래시 먼저 포유 동물 세포 retinoic 산성 바인딩 단백질 I 4 단백질 접힘에 대한의 세포 센서로 사용되었다. 이 예제에서는 TC 태그에 바운드 플래시 제가 펼쳐 양...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> μ - 슬라이드 8 - 잘 </td><td> Ibidi </td><td> 80,826 </td><td> 우리는이 챔버는 이미징을위한 culturing 세포에 특히 유용하는 슬라이드 찾습니다. </td></tr><tr><td> TC - 플래시 II Tetracysteine​​ 태그 감지 세포에서 키트 * 녹색 형광 * 살 세포 이미징 </td><td> Invitrogen </td><td> T34561 (플래시) 또는 T34562 (ReAsH) </td><td></td></tr><tr><td> 행크스 &#39;밸런스드 소금 솔루션 </td><td> Invitrogen </td><td> 14175-103 </td><td></td></tr><tr><td> 2,3 - Dimercapto -1 - 프로파놀 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> D1129 - 5ML </td><td></td></tr><tr><td> 1,2 - Ethanedithiol </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 02390 - 25ML </td><td></td></tr></tbody></table>

reash/flash labeling and image analysis of tetracysteine sensor proteins in cells

형광 단백질 및 염료는 세포에있는 단백질 밀매, 현지화 및 기능 연구에 필수적인 도구입니다. 같은 녹색 형광 단백질 (GFP)로 형광 단백질이 광범위 작은 태그는 같은 conformational 변화로 세포 검사로 단백질의 새로운 기능을 활성화와 관심 1 단백질의 속성, 최근 발전을 추적하는 단백질을 융합 파트너로 사용되었습니다 동안 그리고 단백질 협회 2, 3. 작은 태그 시스템은 유전자 biarsenical 염료에 바인딩 대상 단백질에 삽입 tetracysteine의 모티브 (CCXXCC)를 포함, ReAsH (적색 형광) 심지어이 살고 세포에 높은 특이성과 플래시 (녹색 형광). TC / biarsenical 염료 시스템은 conformational 변화와 단백질 - 단백질 상호 작용 4-7를 측정하는 여러 가지 새로운 방법을 사용할 수 있습니다 형광 단백질보다 호스트 단백질을 훨씬 덜 steric 제약을 제공합니다. 우리는 최근에 돌연변이 huntingtin을 표현하는 세포의 oligomerization의 센서로 TC 태그의 소설 응용 프로그램을 개발하는 헌팅턴 질병 7 뉴런에서 집계를 변이된 경우. Huntingtin은 두 개의 형광 염료, 하나 단백질 위치를 추적할 수있는 형광 단백질에만 단량체의 biarsenical 염료를 바인딩 두 번째 TC 태그 적었습니다. 따라서, 단백질과 biarsenical 염료 반응성 사이 colocalization의 변화는 공간 세포 내에서 매핑하는 submicroscopic 올리고머 컨텐츠를 활성화. 여기, 우리는 플래시 또는 ReAsH 라이브 포유 동물 세포와 방법을 두 가지 색상의 형광 (체리 / 플래시, CFP / / 플래시 또는 GFP를 수치와 형광 단백질 (체리, GFP 또는 CFP)로 융합 TC - 태그 단백질을 분류하는 방법에 대해 설명합니다 ReAsH 조합).

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ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells

biarsenical 염료 플래시와 ReAsH 단백질의 tetracysteine​​ 주제에 구체적으로 바인딩하고 선택적으로 살 세포에 단백질을 분류하실 수 있습니다. 최근에이 상표 전략은 다른 단백질 conformations 또는 oligomeric 상태에 대한 센서를 개발하는 데 사용되었습니다. 우리는 라벨 접근 방식을 설명하고 방법은 양적 바인딩을 분석합니다.

ReAsH / 플래시 라벨링 및 전지 Tetracysteine​​ 센서 단백질의 이미지 분석

Fluorescent proteins and dyes are essential tools for the study of protein trafficking, localization and function in cells.  While fluorescent 
proteins ...

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Research

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Biology

16.9K 조회수.  Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute. biarsenical 염료 플래시와 ReAsH 단백질의 tetracysteine​​ 주제에 구체적으로 바인딩하고 선택적으로 살 세포에 단백질을 분류하실 수 있습니다. 최근에이 상표 전략은 다른 단백질 conformations 또는 oligomeric 상태에 대한 센서를 개발하는 데 사용되었습니다. 우리는 라벨 접근 방식을 설명하고 방법은 양적 바인딩을 분석합니다.

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Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods presented here utilize the green fluorescent protein (gfp) gene for continual monitoring of gene expression in the same pieces of tissues, over time. The gfp gene was placed under regulatory control of different promoters and introduced into lima bean cotyledonary tissues via particle bombardment. Cotyledons were then placed on a robotic image collection system, which consisted of a fluorescence dissecting microscope with a digital camera and a 2-dimensional robotics platform custom-designed to allow secure attachment of culture dishes. Images were collected from cotyledonary tissues every hour for 100 hours to generate expression profiles for each promoter. Each collected series of 100 images was first subjected to manual image alignment using ImageReady to make certain that GFP-expressing foci were consistently retained within selected fields of analysis. Specific regions of the series measuring 300 x 400 pixels, were then selected for further analysis to provide GFP Intensity measurements using ImageJ software. Batch images were separated into the red, green and blue channels and GFP-expressing areas were identified using the threshold feature of ImageJ. After subtracting the background fluorescence (subtraction of gray values of non-expressing pixels from every pixel) in the respective red and green channels, GFP intensity was calculated by multiplying the mean grayscale value per pixel by the total number of GFP-expressing pixels in each channel, and then adding those values for both the red and green channels. GFP Intensity values were collected for all 100 time points to yield expression profiles. Variations in GFP expression profiles resulted from differences in factors such as promoter strength, presence of a silencing suppressor, or nature of the promoter. In addition to quantification of GFP intensity, the image series were also used to generate time-lapse animations using ImageReady. Time-lapse animations revealed that the clear majority of cells displayed a relatively rapid increase in GFP expression, followed by a slow decline. Some cells occasionally displayed a sudden loss of fluorescence, which may be associated with rapid cell death. Apparent transport of GFP across the membrane and cell wall to adjacent cells was also observed. Time lapse animations provided additional information that could not otherwise be obtained using GFP Intensity profiles or single time point image collections.

We report a method for introduction, tracking and quantitative analysis of GFP expression in plant cells. This method utilizes a custom-designed robotics system for semi-continuous image collection from large numbers of samples, over time. We also demonstrate the use of ImageJ and ImageReady for analysis of image series.

로보틱스 및 식물 조직에서 유전자 발현의 연구 동적 이미지 분석

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

연구

생물학

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane proteins including ion channels2, ion pumps3, and transporters4. Recent developments have combined site-specific fluorophore labeling alongside TEVC to 
concurrently examine the conformational dynamics at specific residues and function of these proteins on the surface of single cells.
We will describe a method to study the conformational dynamics of membrane proteins by simultaneously monitoring fluorescence and current changes using voltage-clamp fluorometry. This approach can be used to examine the molecular motion of membrane proteins site-specifically following cysteine replacement and site-directed fluorophore labeling5,6. Furthermore, this method provides an approach to determine distance constraints between specific residues7,8. 
This is achieved by selectively attaching donor and acceptor fluorophores to two mutated cysteine residues of interest.
In brief, these experiments are performed following functional expression of the desired protein on the surface of Xenopus leavis oocytes. The large surface area of these oocytes enables facile functional measurements and a robust fluorescence signal5. It is also possible to readily change the extracellular conditions such as pH, ligand or cations/anions, which can provide further information on the mechanism of membrane proteins4. Finally, recent developments 
have also enabled the manipulation of select internal ions following co-expression with a second protein9.
Our protocol is described in multiple parts. First, cysteine scanning mutagenesis proceeded by fluorophore labeling is completed at residues located at the interface of the transmembrane and extracellular domains. Subsequent experiments are designed to identify residues which demonstrate large changes in fluorescence intensity (&lt;5%)3 upon a conformational change of the protein. Second, these changes in fluorescence intensity are compared to the kinetic parameters of 
the membrane protein in order to correlate the conformational dynamics to the function of the protein10. This enables a rigorous biophysical analysis of the molecular motion of the target protein. Lastly, two residues of the holoenzyme can be labeled with a donor and acceptor fluorophore in order to determine distance constraints using donor photodestruction methods. It is also possible to monitor the relative movement of protein subunits following labeling with a donor and acceptor fluorophore.

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

We will describe a method which measures the kinetics of ion transport of membrane proteins alongside site-specific analysis of conformational changes using fluorescence on single cells. This technique is adaptable to ion channels, transporters and ion pumps and can be utilized to determine distance constraints between protein subunits.

막 단백질의 Conformational 역학 검사 현장에서 사이트 이동 형광 라벨링과

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

Murine 조혈 줄기 세포와 리니지 - 헌신 Progenitors의 Phenotypic 분석 및 절연

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

간엽 전환을 유도하고 상피의 분석

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ imaging data is time consuming and subject to bias. Automated signal analysis algorithms based on region of interest (ROI) detection have been implemented for one-dimensional line scan measurements, but there is no current algorithm which integrates optimized identification and analysis of ROIs in two-dimensional image sequences. Here an algorithm for rapid acquisition and analysis of ROIs in image sequences is described. It utilizes ellipses fit to noise filtered signals in order to determine optimal ROI placement, and computes Ca2+ signal parameters of amplitude, duration and spatial spread. This algorithm was implemented as a freely available plugin for ImageJ (NIH) software. Together with analysis scripts written for the open source statistical processing software R, this approach provides a high-capacity pipeline for performing quick statistical analysis of experimental output. The authors suggest that use of this analysis protocol will lead to a more complete and unbiased characterization of physiologic Ca2+ signaling.

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Here a novel region of interest analysis protocol based on sorting best-fit ellipses assigned to regions of positive signal within two-dimensional time lapse image sequences is demonstrated. This algorithm may enable investigators to comprehensively analyze physiological Ca2+ signals with minimal user input and bias.

동적 칼슘의 자동 분석<sup&gt; 2 +</sup이미지 시퀀스에서&gt; 신호

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific positions in DNA, RNA, proteins and small biomolecules. This natural methylation reaction can be expanded to a wide variety of alkylation reactions using synthetic cofactor analogues. Replacement of the reactive sulfonium center of AdoMet with an aziridine ring leads to cofactors which can be coupled with DNA by various DNA MTases. These aziridine cofactors can be equipped with reporter groups at different positions of the adenine moiety and used for Sequence-specific Methyltransferase-Induced Labeling of DNA (SMILing DNA). As a typical example we give a protocol for biotinylation of pBR322 plasmid DNA at the 5&#8217;-ATCGAT-3&#8217; sequence with the DNA MTase M.BseCI and the aziridine cofactor 6BAz in one step. Extension of the activated methyl group with unsaturated alkyl groups results in another class of AdoMet analogues which are used for methyltransferase-directed Transfer of Activated Groups (mTAG). Since the extended side chains are activated by the sulfonium center and the unsaturated bond, these cofactors are called double-activated AdoMet analogues. These analogues not only function as cofactors for DNA MTases, like the aziridine cofactors, but also for RNA, protein and small molecule MTases. They are typically used for enzymatic modification of MTase substrates with unique functional groups which are labeled with reporter groups in a second chemical step. This is exemplified in a protocol for fluorescence labeling of histone H3 protein. A small propargyl group is transferred from the cofactor analogue SeAdoYn to the protein by the histone H3 lysine 4 (H3K4) MTase Set7/9 followed by click labeling of the alkynylated histone H3 with TAMRA azide. MTase-mediated labeling with cofactor analogues is an enabling technology for many exciting applications including identification and functional study of MTase substrates as well as DNA genotyping and methylation detection.

DNA and proteins are sequence-specifically labeled with affinity or fluorescent reporter groups using DNA or protein methyltransferases and synthetic cofactor analogues. Depending on the cofactor specificity of the enzymes, aziridine or double activated cofactor analogues are employed for one- or two-step labeling.

Methyltransferases과 공동 인자 유사체와 핵산과 단백질의 순서 특정 레이블

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of centromere-kinetochore proteins during the cell cycle remains a fundamental tool in investigating the mechanism(s) of these proteins. Advanced imaging methods in fluorescence microscopy provide remarkable resolution of centromere-kinetochore components and allow direct observation of specific molecular components of the centromeres and kinetochores. In addition, methods of indirect immunofluorescent (IIF) staining using specific antibodies are crucial to these observations. However, despite numerous reports about IIF protocols, few discussed in detail problems of specific centromere-kinetochore proteins.1-4 Here we report optimized protocols to stain endogenous centromere-kinetochore proteins in human cells by using paraformaldehyde fixation and IIF staining. Furthermore, we report protocols to detect Flag-tagged exogenous CENP-A proteins in human cells subjected to acetone or methanol fixation. These methods are useful in detecting and quantifying endogenous centromere-kinetochore proteins and Flag-tagged CENP-A proteins, including those in human cells.

Here we report protocols to detect endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins in human cells and quantify these protein levels at centromeres-kinetochores by indirect immunofluorescent staining through the use of fixation (paraformaldehyde, acetone, or methanol fixation).

내생의 면역 형광 분석 및 외인성 센트로 - 동원체 단백질

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded proteins may serve as potential therapeutic targets. To distinguish degradation of misfolding-prone proteins from other mechanisms that regulate their levels, one important method is to measure protein half-life in cells. However, this can be challenging because misfolding-prone proteins may exist in different forms, including the native form and misfolded forms of distinct characteristics. Here we describe assays to examine the half-life of misfolded proteins in mammalian cells using a highly aggregation-prone protein, Ataxin-1 with an extended polyglutamine (polyQ) stretch, and a conformationally unstable luciferase mutant as models. Cycloheximide chase is combined with cell fractionation to examine the turnover rate of misfolding-prone proteins in various cellular fractions. We further depict a fluorescence-based assay using an enhanced green fluorescence protein (EGFP)-fusion of the luciferase mutant, which can be adapted for high throughput screening on a microplate-reader.

This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening.

세포의 잘못 폴딩 된 단백질의 분해에 대한 분석

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

스펙트럼 유동 세포 계측법에 의해 고체 조직에서 분리 한 세포 현탁액의 분석

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

동적 세포 돌출부에서 소프트웨어를 이용한 단백질 농도 추적을위한 그래픽 사용자 인터페이스

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

ReAsH / 플래시 라벨링 및 전지 Tetracysteine 센서 단백질의 이미지 분석

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